全 文 ：第 16 卷 第 4 期
Vo l. 16 No. 4
草 地 学 报
ACT A AGREST IA SIN ICA
2008年 7 月
Jul. 2008
太空搭载-热研 2号.柱花草后代 RAPD多态性分析
白昌军, 刘国道, 姚庆群, 虞道耿, 陈志权
(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所, 海南 571737)
摘要: 以返回式卫星搭载的-热研 2 号. 柱花草( Sty losanthes guianensis ( Aubl. ) Sw. )种子为材料, 经过 5 年地面
种植和选择, 获得 26 个变异株系。利用 RAPD分子标记技术对 26 个变异株系和 2 个对照-热研 2 号. 与-热研 5
号. 柱花草进行遗传多样性研究。从 50 个随机引物中筛选出 11 个, 共扩增出 77 条带, 其中 53 条为多态性带, 占
68. 8% ,平均每个引物扩增出多态性带 4. 8 条; 采用 Nei72 方法计算出不同材料间的遗传距离, 其变化范围为
0. 056~ 0. 509;利用 NTSYS 软件进行非加权组法( UPGMA)聚类分析, 建立-热研 2 号. 柱花草太空育种后代材料
间的分子系统树状图; 并以相似系数 0. 77 为标准, 将 28 份材料分为 5 类。
关键词: 热研 2 号柱花草;太空育种; RAPD; 遗传多样性;聚类分析
中图分类号: S812 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 04-0336-05
Polymorphic Analysis of RAPD in Stylosanthes guianensis -Reyan
No. 2. after Spaceship-carried Seed Induction
BAI Chang- jun, LIU Guo-dao , YAO Qing-qun, YU Dao-geng , CHEN Zh-i quan
( T ropical Crops Genetic Resources In st itute, Chinese Academ y of Tropical Agricul tural S cien ces
( CATAS ) , Danzhou, Hainan Province 571737, Chin a)
Abstract: Tw enty-six mutants w ere obtained from the 5-year plantat ion of the seeds of Sty losanthes
g uianensi s ( A ubl. ) Sw . cv. -Reyan No. 2. which w ere carried into outer space by a recoverable satellite in
1996. The genet ic diversity of the 26 mutant lines and the contral v ar iet ies ( S . g uianensi s cv. Reyan No.
2 and S . g uianensi s cv. Reyan No. 5) w as analy zed by RAPD using 11 primers f rom 50 r andom pr imer s.
T here w ere 53 polymorphic DNA bands ( 68. 8%) among the 77 DNA bands amplified by RAPD. The av-
erage number of polymor phic DNA bands per primer w as 4. 8, and the r ange o f genet ic distance among
these lines varied from 0. 056 to 0. 509 as assessed by Neis 72. A DNA molecular tree diag ram was estab-
lished base on UPGMA analysis by N TSYS softw are and the 28 materials of S. guianensi s wer e classified
into f ive gr oups according to a standar d o f similarity coef ficient at 0. 77 in the dendrogram.
Key word: S ty losanthes guianensis ( Aubl. ) Sw . -Reyan No. 2. ; Space- f light breeding ; RA PD; Genet ic
div ersity; Cluster analysis
中国是世界上开展农作物太空诱变育种最早的
国家之一。自 1987年以来,我国已成功地利用返回
式卫星先后搭载了水稻 ( Or y z a sativa L. )、小麦
( T r it icum aest iv um L. )、大麦 ( H or deum vulg ar e
L. )、青椒 ( Zanthoxy lum schini f ol ium Sieb. et
Zucc. )等重要农作物进行太空育种[ 1] 。研究表明,
经过太空飞行的植物干种子, 地面种植后会发生明
显的变异,如生长势变化、同工酶谱带增减、染色体
数目改变、叶绿体损伤 [ 2~ 5]等,已获得了许多宝贵的
突变材料,并从中选育出一批优良品系。目前一般从
收稿日期: 2007-07-27; 修回日期: 2008-02- 27
基金项目: 国家科技基础条件平台建设项目( 2005DKA21000)
作者简介: 白昌军(1967-) ,在职博士,副研究员,研究方向为热带牧草和草坪草品种选育及栽培利用, E-mail: yaoqingqun@ 126. com
第 3期 白昌军等:太空搭载-热研 2号. 柱花草后代的 RAPD多态性分析
育种角度出发, 将有利的突变性状用于育种中, 对突
变后代的分子水平的分析虽在水稻、蔬菜等作物上也
有不少报道[ 6~ 8] ,但在牧草方面报道不多。
本文利用太空诱变育种技术对-热研 2号. 柱花
草( Sty losanthes guianensis ( Aubl. ) Sw . ) 进行诱
变处理,并通过 RAPD技术对诱变后代群体进行初
步的遗传差异分析, 以期从分子水平上分析太空搭
载对其基因组变异的影响,为太空诱变育种进一步
应用于生产提供科学依据,从而选择优良的育种材
料,定向培育新品种。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
本研究所用的材料为-热研 2号. 柱花草种子,于
1996年 10月 20日 ) 11月 4日利用返回式地球卫星
进行空间诱变处理,对照种子常温保存,返地后经过
连续 5代大田选择,培育,获得一批形态及育性变异
的材料,如高产、早花、抗病等,以初步选育的 26份材
料及其亲本热研2号柱花草作为研究对象,并将热研
5号柱花草作为早花对照(见表 1)。选取以上 28份
材料的种子各20粒,育苗,待苗高 3~ 5 cm 时取样。
1. 2 基因组 DNA的提取与检测
采用改良 CTAB 法提取的柱花草叶的总
DNA
[ 6]。提取的 DNA 通过琼脂糖凝胶电泳, Go ld-
V iew 染色, 条带模糊的样品进行重提, 条带清晰
的通过紫外分光光度计测定 DNA 的浓度, 并将各
组 DNA 浓度用超纯水稀释成 20 Lg / mL 的混合模
板 DNA。
表 1 实验材料
Table 1 Accessions for the experiment
序号
S erial No.
种质编号
Access ion No.
备注
Remark
序号
Serial No.
种质编号
Accession No.
备注
Remark
1 2001- 1 15 2001- 54
2 2001- 2 16 2001- 55
3 2001- 5 早花( Early blos soming) 17 2001- 58
4 2001- 6 早花( Early blos soming) 18 2001- 60
5 2001- 7 早花( Early blos soming) 19 2001- 70
6 2001- 8 早花( Early blos soming) 20 2001- 71
7 2001- 9 21 2001- 73
8 2001- 24 晚花( Late bloss oming) 22 2001- 79
9 2001- 25 晚花( Late bloss oming) 23 2001- 80
10 2001- 31 24 2001- 81
11 2001- 38 25 2001- 84
12 2001- 39 26 2001- 85
13 2001- 40 27
热研 2号
( S. g uianen si s cv. Reyan No. 2)
种质亲本 Parents
14 2001- 44 28
热研 5号
( S. g uianen si s cv. Reyan No. 5)
早花对照
CK for early bloss om ing
1. 3 PCR体系及其扩增程序
通过对反应体系各组份的浓度梯度实验,并对
反应程序优化后, 建立扩增结果稳定的体系为: 模板
2 LL ( 20 ng/LL ) , 随机引物 2 LL ( 20 Lmo l/ L ) ,
T aq酶 1U,组合缓冲液 10 LL, 加无菌水至总体积
为 20 LL。反应程序为: 94 e 预变性 5 min; 94 e 变
性 1 m in ; 36 e 复性1 m in; 72 e 延伸1 min; 共38个
循环; 72 e 延伸 7 min, 最后 4 e 保存。
1. 4 扩增产物的检测
取 7 LL 扩增产物加 3 LL 上样缓冲液,混匀,在
1. 5%的琼脂糖凝胶中以 4V/ cm 稳压电泳直至溴酚
蓝到达凝胶的末端, 于凝胶成像系统观察照相。
1. 5 数据分析
每个样品的扩增带按有 ( 1)或无 ( 0)记录, 重
复 2次,对于多态性位点,仅在重复试验中能稳定
出现, 且清晰的 DNA 带用于数据分析, 利用 NT-
SYS软件计算品种间的遗传相似系数, 对得到的
遗传相似性矩阵进行非加权组法 ( U PGMA )聚
类分析,建立柱花草材料与亲本间的聚类分析树
状图。
337
草 地 学 报 第 16卷
2 结果与分析
2. 1 基因组 DNA
结果表明,改良 CTAB 法得到的 DNA沉淀呈透
明状, DNA 在紫外分光光度计测定的浓度为 388~
661 Lg/ mL ,其OD260/ OD230比值大于 2. 0, OD260/
OD280比值在 1. 8左右,电泳呈现一条迁移率很小
的整齐条带, 无弥散状态出现,表明其 DNA 的质量
较高,所提样品较纯,基本无 RNA、蛋白质或酚污染
及残留的盐和小分子杂质, DNA 无降解, 说明完整
性好,可用于 RAPD研究。
2. 2 扩增产物多态性分析
选用上海生工的 50对随机引物,分别用 4个柱
花草材料进行引物筛选, 选出 11条扩增带型清晰且
具多态性的引物再次扩增 28个 DNA 样品,图 1为
随机引物 S80扩增得到的多态性带结果。
共扩增出 77 条带, 大小在 300bp~ 1500 bp 之
间,其中多态性带 53条, 占总带数的 68. 8% ; 非多
态性带 24条,占总带数的 31. 2%。不同引物扩增的
多态性带数目为 5~ 9条, 平均每个引物扩增出多态
性带 4. 8条(表 2)。在所选引物扩增的多态性带中,
未产生品种特异性带。因此,要从基因组水平上把太
空搭载柱花草材料相互区分,还需要利用更多的随机
引物或使用特异性引物对柱花草的基因组进行检测。
图 1 引物 S80 对柱花草扩增的 RAPD图谱
F ig. 1 RAPD fingerprint of Sty lo santhes materials with pr imer S80
注: 1~ 26表示太空搭载柱花草后代所选育出来的 26份材料, 27为-热研 2号. 柱花草, 28为-热研 5号. 柱花草。M 表示
100 bp DNA 分子量标准, M 条带大小(由上至下) : 1500、1000、900、800、700、600、500、400、300 bp
Note: Th e number of 1 to 26 represents the 26 S ty losanthes m aterial s af ter spaceship-carried seed induction; No. 27 and No. 28 represen t
S . g uianensi s cv. Reyan No. 2 and S. g uianensi s cv. Reyan No. 5, respect ively; M r epresen ts 100 bp DNA molecular w eight stan dard, th e lad-
ders ( u p-dow n) : 1500、1000、900、800、700、600、500、400、300 bp
表 2 随机引物名称、序列与扩增的结果
T able 2 L ist of pr imers, their sequences and amplified r esult
序号
No.
引物( 5.- 3. )
Primers ( 5.-3. )
扩增条带
Amplif ied bands
多态带数
Polym orphic bands
多态百分比( % )
Percentage of polymorphic bands
1 ACTT CGCCAC 7 5 71. 4
2 CCGAATT CCC 5 3 60. 0
3 ACGCGCAT GT 7 5 71. 4
4 ACGCACAACC 8 5 62. 5
5 CAGCACCCAC 6 4 66. 7
6 CTGACCAGCC 7 4 57. 1
7 TGAGAGGGT G 8 6 75. 0
8 TCGGACGTGA 7 5 71. 4
9 GGT GCGGGAA 7 4 57. 1
10 GGT GCGGGAA 9 7 77. 8
11 ACGCACAACC 6 5 83. 3
总计( Total) 77 53 68. 8
平均值( Average) 7 4. 8 68. 8
338
第 3期 白昌军等:太空搭载-热研 2号. 柱花草后代的 RAPD多态性分析
2. 3 28份材料的聚类和遗传距离分析
28份柱花草材料相互之间的相似系数为 0. 73~
0. 95,表明其遗传关系比较近。依相似系数 0. 77的
水平,可将供试的 28份材料分为 5类, 各组的具体
情况如下:
类群 1 为: 材料 1、3、4、5、6、7、10、11、13、15、
16、17、18、19、20、23、27。
类群 2为:材料 21、22、24、25、26。
类群 3为:材料 2、8、9。
类群 4为: 材料 12、14。
类群 5为: 材料 28
从以上类群分析可见, -热研 5 号. 柱花草 ( 28
号)明显与其它各材料区分开,这主要是因为-热研 5
号.柱花草是从-热研 2号. 群体中早花单株选育而来。
而绝大部分材料与-热研 2号. 柱花草( 27号)归为一
类,说明以-热研 2号.为亲本的柱花草种子经太空育
种后所得的后代与其亲本关系密切, 而只有少量的材
料与其亲本有所区别,如类群 2、3和 4所包含的材料。
图 2 28 份柱花草材料的聚类分析树状图
F ig . 2 T ree diag rams of 28 Sty losanthes variet ies.
注: 1~ 26表示太空搭载柱花草后代所选育出来的 26份材料, 27为热研 2号柱花草, 28为热研 5号柱花草
Note: Th e number of 1 to 26 represents the 26 S ty losanthes m aterial s af ter spaceship- carried seed induct ion; No. 27 and
No. 28repr esent S . guianensi s cv. Reyan No. 2 and S . guianensi s cv. Reyan No. 5, respect ively
供试柱花草材料间的遗传距离为 0. 056~ 0. 509。
其中材料 8与 9的遗传距离最短,仅为 0. 056,说明
二者在基因组组成和核苷酸序列上极为相似。而最
远的是材料 28与材料 22, 遗传距离为 0. 509,可能
是由于其品种不同而引起, 材料 28来自-热研 5号.
柱花草(早花对照品种) ,而材料 22为-热研 2号. 柱
花草种子经太空搭载后所选出的材料, 由于其变异
程度大而引起遗传距离大。
3 讨 论
3. 1 关于太空条件下诱发突变的分子生物学研究
已有不少报道[ 10, 11] 。王斌等[ 12] 对绿豆( Vigna r a-
diata ( L . ) Wilczek)和张健等[ 13]对菜豆( Phaseolus
v ulgar i s L. )品系的研究结果表明, 与原始对照材
料相比太空诱变后代突变系在 DNA 水平上发生了
变异;易继财等用 RAPD和 AFLP 两种分子标记方
法研究了空间搭载诱变水稻种子与原种子 DNA 之
间的关系,结果表明诱变后的部分种子与原种子之
间存在不同程度的多态性差异, 在分子水平上证明
了空间环境确实对植物存在诱变作用[ 14] 。因此太
空处理能够诱导作物产生变异,有望为高产、优质的
作物品种选育提供新种质。
3. 2 尽管近几年来有一些有关 RAPD 缺陷的报
道,主要是在不同实验之间、PCR仪之间及 DNA 聚
合酶之间 RAPD结果常有不一致的现象,但是通过
适当控制影响 RA PD稳定性的因素, 重复实验, 同
时去除那些不稳定及模糊的条带, RAPD仍不失为
一种测定基因组变异的有用工具[ 15] 。为确定利用
随机引物扩增出现特异性谱带的代表性, 本研究根
据柱花草的遗传特性, 运用每份材料混合 DNA 样
品通过重复实验,建立最佳的反应条件和反应体系,
339
草 地 学 报 第 16卷
在一定程度上克服 RAPD 分子标记技术存在的局
限性,在不同材料中扩增出稳定、可靠的多态性条
带。毛培胜等证实混合样品扩增出现的多态性谱带
具有较好的代表性[ 16]。本实验利用 RA PD技术检
测 28个株系的基因位点,发现多个基因位点发生变
异。变异类型分为 2类,扩增的片段数增多和减少。
3. 3 本实验证实了太空诱变-热研 2号. 柱花草材料
与对照亲本之间的确存在一定的差异, 遗传多态性高
达 68. 8%,表明太空处理能够诱导作物产生变异,为
柱花草品种选育提供较好的新种质。傅小霞等利用
RAPD分子标记方法能将 11个柱花草品种按其亲缘
关系进行聚类,说明用这些条带作为品种鉴别的依据
是可靠的[ 17] 。这为太空诱变柱花草材料的进一步分
子生物学鉴定奠定了良好的基础。此外,刘波等对搭
载坛紫菜( Por phyr a haitanensis T. J. Chang et B. F.
Zheng)的RAPD研究表明, 太空诱变组 DNA与对照
相比具有部分差异性条带,说明利用太空诱变的手段
可以使部分基因片段不定向变异[ 18] 。
3. 4 有研究表明, 利用 RAPD分子标记对植物的
遗传多样性进行分析时,所得结论与形态学研究结
果及其亲缘关系基本一致 [ 19, 20]。本研究结果表明,
尽管在所选引物扩增的多态性带中, 并没有产生品
种特异性带将-热研 2号. 柱花草太空诱变育种材料
区分,但依据这些多态性标记获得的各品种间的遗
传距离变化较大, 说明 RAPD技术能有效地检测出
柱花草太空诱变育种材料间的遗传变异, 具有较高
的遗传多样性,且这种变异与材料来源及性状有一
定的联系,如晚花 8号与 9 号, 共同来源于 9804-8
单株种子, 因此遗传距离最近, 在聚类分析中归一
类;由于-热研 5号. 柱花草( 28)作为另一品种对照
品种而单独为一类;早花材料与亲本归为一大类。
4 结 论
4. 1 选用 50对随机引物, 分别用 4 个柱花草材料
进行引物筛选,选出 11条扩增带型清晰且具多态性
的引物。
4. 2 多态性的引物共扩增出 77条带,大小在 300~
1500 bp 之间, 其中多态性带 53 条, 占总带数的
68. 8%;非多态性带 24条,占总带数的 31. 2%。
4. 3 供试柱花草材料间的遗传距离为 0. 056~
0. 509。
4. 4 28份柱花草材料相互之间的相似系数为 0. 73~
0. 95, 其遗传关系比较近。依相似系数 0. 77 的水
平,可将供试的 28份材料分为 5类。
4. 5 太空处理能够诱导柱花草产生变异,有望为高
产、优质的柱花草品种选育提供较好的新种质。
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(责任编辑 张蕴薇)
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