全 文 ：第 16 卷 第 2 期
Vol. 16 No . 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 3 月
Mar . 2008
四脊裸胞壳 Dh菌株侵染对钩麦蛾幼虫
体内保护酶的影响
朱建兰1, 2, 王国利1 , 刘 谨1 , 张自和2
(1.甘肃农业大学草业学院, 草业生态系统教育部重点实验室, 兰州 730070;
2. 兰州大学农业部草地农业生态系统重点开放实验室, 兰州 730020)
摘要: 对四脊裸胞壳( Emer icell a quadr ilineata) Dh 菌株侵染苜蓿钩麦蛾( A p roaer ema anthy l idell a Hbner)幼虫
后其症状、体内保护酶活力进行研究, 以期为害虫生物防治提供依据。结果表明: 用菌悬液为 5 107 个/ mL 孢子
处理 ,幼虫校正死亡率达 88. 38% ;感病虫体表皮发黑, 保湿后体壁受害部长出大量 Dh 菌株的菌丝和分生孢子; 感
病幼虫体内过氧化物酶( POD)活性和过氧化氢酶( CAT )活性呈先下降后上升趋势, 但 POD 酶活性上升程度较
CAT 酶活性大;而超氧化物歧化酶( SOD)活性呈平稳上升趋势;从整体上看,用 Dh 菌株处理后钩麦蛾幼虫体内的
3 种保护酶的活性随时间的延长而呈上升的趋势。
关键词: Dh 菌; 钩麦蛾; 超氧化物歧化酶( SOD) ; 过氧化氢酶( CAT ) ; 过氧化物酶 ( POD)
中图分类号: S551. 7; S45 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2008) 02012105
The Protective Enzyme Activities of the Larva of Aproaerema anthy lidella
Hbner Infected by Emericella quadrilineata Dh Strain
ZHU Jianlan1, 2 , WANG Guoli1 , L IU Jin1 , ZHANG Zihe2
( 1. Pratacultu ral College, Gan su Agricultural University and Key Laboratory of Gras sland Ecosystem, Minist ry of Educat ion, Lanzhou,
Gansu Province 730070, China;
2. Key Laboratory of Grassland AgroE cosystem s, M inist ry of Agricu lture and Lanzh ou U nivers ity,
Lan zhou, Gansu Province 730020, Chin a)
Abstract: T he entomopathogenic fung i, Emer icel la quadr il ineata Dh strain, w ere isolated fr om the dead
body of larva of A pocheima ciner ar ius Erschof f co llected in f ield. The symptom and changes of protect ive
enzymes activ it ies of A p roaer ema anthy l idella Hbner larva infected by E . quadr il ineata Dh strain w ere
assayed. T he r esults indicate that the correct ion death rate of the larvae w as 88. 38% when inoculated w ith
the conidial suspension of Dh st rain at the tr eat ing concentrat ion of 5 107 spores / mL. T he surface of
cor tices of the lar va infected by Dh st rain w as black w ith lo ts of hyphae and conidia o f the fung i on the epi
derm o f the illness larva af ter mo ist incubat ion. T he POD and CAT act ivit ies of the larvae infected by Dh
st rain w ere signif icant ly low er at the beg inning and afterw ard higher than that o f the contro l, but the speed
of POD act ivity ascended relat ively faster than that of CAT, and the SOD act iv ity of the larvae w ent up
smoothly in comparison to control. Generally , the activit ies of the above thr ee pr eser vative enzymes of the
A. anthy l id el la worm infected E. quadri l ineata Dh str ain show ed a rising t rend along w ith the time pro
ceeding.
Key words: Emer icel la quad ri lineata ( Dh ) ; A p r oaer ema anthy l idel la Hbner; Superox ide dismutase
( SOD) ; Catalase ( CAT ) ; Perox idase ( POD)
收稿日期: 20070416; 修回日期: 20080115
基金项目: 甘肃省农牧厅生物技术专项( GNSW200408)
作者简介: 朱建兰( 1956) ,女,宁夏中宁人,博士,教授,主要从事植物病理学及病虫害生物防治研究, Email: zhujl@ gsau . edu. cn
草 地 学 报 第 16卷
苜蓿( Med icago sativa L. )具抗逆性强, 分布
广,产量高,品质好, 经济价值高等优点,被誉为牧草
之王 [ 1]。苜蓿钩麦蛾 ( A p r oaer ema anthy lidella
Hbner)以幼虫卷叶危害苜蓿、三叶草( T r if ol ium
rep ens L. )等。幼虫吐丝液将苜蓿叶片从边缘缀合
成 1个小包,在其内取食叶肉和上表皮,仅留下维管
束和外表皮,当取食完 1个叶包时便在此叶包中部
或上部打眼, 转移取食其它叶片, 一生可危害 10~
20个叶片,对苜蓿造成严重的影响。利用昆虫病原
真菌对苜蓿进行生物防治,是保护环境,实现苜蓿无
公害生产的重要手段之一。四脊裸胞壳( Emericel
la quadr i lineata) Dh 菌株,是从沙枣尺蠖( Ap ochei
ma ciner ar ius Erschof f )田间自然死亡虫体上分离
所得的一种真菌[ 2] 。据报道, Dh 菌株对小菜蛾
( Plutella x y lostel ia L. )、梨树尺蠖( Yala py r icola
Chu)、棉铃虫( H elicoverp a armiger a Hbner )、桃
蚜(Myz us p ersicae Sulzer)、和苹果全爪螨( Panon
y chus ulmi Koch)几种害虫均有致病作用[ 3, 4] 。像
大多数昆虫病原真菌一样, Dh 菌株需菌丝穿透体
壁才能侵染寄主,侵入后会遇到昆虫防御系统的抵
抗。李周直等[ 5] 研究表明菜青虫( P ier i s r ap ae L. )
体内存在着超氧化物歧化酶 ( SOD)、过氧化氢酶
( CAD)和过氧化物酶 ( POD)等保护酶。当菜青虫
受感染后,就会启动机体内的保护酶系统进行防御,
即存于昆虫体内的 SOD、CAT、和 POD三者协同作
用,使自由基保持在一个较低水平,来维持昆虫体内
正常的生理活动。张仙红等[ 6] 研究也表明, 菜青虫
感染拟青霉后, SOD 活力迅速提高, CAT 和 POD
活力均表现出升高或降低趋势。陈尚文、李周直
等[ 7, 8]研究均表明昆虫体内存在过氧化氢酶和过氧
化物酶的活性和昆虫对外界刺激物相应强度的反应
有关,与其耐药性、抗逆性有关。
本文研究钩麦蛾受到虫生真菌四脊裸孢壳 Dh
菌株侵染后体内保护酶系统活性的变化, 以便探讨
钩麦蛾对 Dh菌株侵染的反应,为害虫生物防治提
供依据。
1 材料与方法
1. 1 供试虫种、菌株及接种方法
甘肃农业大学草业学院苜蓿试验田中苜蓿叶片
上采集的钩麦蛾 3~ 4龄幼虫,将钩麦蛾幼虫连同新
鲜叶片一起采回,用毛笔把幼虫从包叶中刷下置于
干净培养皿中, 选取虫龄一致的幼虫供试。
供试菌株由甘肃农业大学草业学院植病实验室
提供。将供试菌种于 PDA 上活化培养 4- 5 d, 用
含有 0. 1%的土温80 加入无菌水, 用毛笔洗下菌落
孢子,配成浓度为 5 106 和 5 107 个/ mL 的孢子
悬浮液待用。
采用虫体直接浸蘸法[ 9] 接种。将 3~ 4龄钩麦
蛾幼虫直接放在供试的孢子悬浮液中浸蘸 3 s,然后
将幼虫放回养虫瓶中, 用新鲜苜蓿叶片饲养。在室
温( 27 左右)自然光周期( L/ D= 14/ 10)下饲养,每
天定时更换新鲜叶片。从接菌 24 h 开始取样, 以后
每隔 12 h取样 1次。取样时分别取对照和处理,每
处理 200头幼虫, 每次取样 3个重复。
对照用含有 0. 1%的土温80的无菌水处理,条
件同上。
1. 2 酶活性的测定
1. 2. 1 酶液制备 将用 5 107 个/ mL 孢子 Dh菌
液处理后的钩麦蛾供试幼虫 40头放入研钵中, 加入
1. 5 mL pH 6. 0的磷酸缓冲液, 在冰浴中研磨后,放
入 4 下以 10 000 r/ min的高速冷冻离心 15 min,
取上清液作为酶液待用。
1. 2. 2 过氧化物酶( POD)活性的测定 过氧化物
酶( POD)活性的测定采用蒋志胜等的愈创木酚[ 10]。
POD活性单位= OD 反应液体积
6. 58 样液体积 样液稀
释倍数
( 6. 58为每个酶活单位在 1 min内使吸光度增
大值)
总活性= 单位活性 反应液总体积(反应液总
体积= 3+ 1+ 1+ 0. 25= 5. 25 mL;样液体积= 0. 25
mL)
1. 2. 3 过氧化氢酶( CAT)活性的测定 参照吴小
锋等的方法[ 11] 。
CAT 活性单位= OD 反应液体积
0. 0436 样液体积 样液稀
释倍数
( 0. 0436为 240 nm处 1 m的 H 2O2 的吸光度)
总活性= 单位活性 反应液总体积(反应液总
体积= 5+ 0. 2+ 0. 2 = 5. 4 mL; 样液体积= 0. 20
mL)
1. 2. 4 超氧化物歧化酶( SOD)活性的测定 超氧
化物歧化酶( SOD)活性的测定采用王惠生等[ 12] 和
吴小锋等[ 13]的方法。
SOD活性单位= (OD 0 - ODs) / OD 0
50%
反应液
122
第 2期 朱建兰等:四脊裸胞壳 Dh菌株侵染对钩麦蛾幼虫体内保护酶的影响
总体积 样液稀释倍数样液体积
( OD0 为邻苯三酚的自氧化率; ODs为 SOD 酶
的自氧化率)
总活性= 单位活性 反应液总体积(反应液总
体积= 5+ 4+ 0. 2+ 0. 25= 9. 45 mL; 样液体积=
0. 20 mL)
2 结果与分析
2. 1 Dh菌株对钩麦蛾的致病性及感病症状
试验结果表明,供试的 2 种浓度孢子悬浮液对
钩麦蛾幼虫均有致病性。在侵染速度上, 5. 0 107
个/ mL 浓度比 5. 0 106 个/ mL 孢子浓度快。处理
后 10 d, Dh菌液浓度为 5. 0 107 个/ mL 处理组校
正死亡率达 88. 38%, 菌液浓度 5. 0 106 个/ mL 处
理校正死亡率为 47. 38%。方差分析结果表明, 两
孢子浓度菌液处理之间, 以及与对照之间差异极显
著( P< 0. 01)。结果见表 1。
表 1 Dh菌株对钩麦蛾幼虫室内防治效果( 10 d)
Table 1 Contro l effect of Dh strain on the larvae o f
A . anthy lidella in 10d after inoculation
孢子浓度(个/ mL)
Concent rat ion of
spores, No. / mL
死亡率%
M ortalit y, %
校正死亡率( % )
Corrected
m ortalit y, %
5. 0 107 90. 7 1. 88aA 88. 38
5. 0 106 57. 9 0. 88bB 47. 38
CK 20. 0 0. 72cC -
注:同列中不同小写字母间差异显著( P< 0. 05) ,不同大写字母
间差异极显著( P< 0. 01)
Note: Th e differ ent let ters m ean signif icant diff erence betw een
the t reatments respect ively; small let ters( P < 0. 05) , capital let ters
( P < 0. 01)
接菌后,大量的 Dh 菌株分生孢子粘附在钩麦
蛾幼虫体壁上,接种 24 h就有幼虫感病死亡,第 3 d
进入死亡高峰期。感病死亡虫体大多弯曲成弓形,虫
体僵硬,感病部位表皮发黑,后期有黑色粘稠液体从
肛门流出。将死亡的钩麦蛾幼虫进行保湿培养 2-
3 d后,在幼虫体的腹部末端、体侧、头部均长有 Dh菌
株的大量菌丝及分生孢子梗和分生孢子(图 1)。
图 1 钩麦蛾幼虫感染 Dh菌株后症状
Fig. 1 Sym ptom of the lar vae of A . anthy lidella infected by the conidia of Dh strain
注:图 a 和图 b为感病部位虫体发黑,生大量病菌分生孢子梗和分生孢子;图 c虫体壁上病菌分生孢子梗顶端膨大处产生大量分生孢子
Fig. a and Fig. b S how the s ymptom of infected larvae w ith lot s of condiophore and conidia of the pathogen on the sus cept ; Fig. c show s lot s
of conidia on conidioph ore apex of the fungi on the in tegument of lar va
2. 2 Dh菌株侵染对钩麦蛾幼虫体内过氧化物酶
( POD)活性的影响
从图 2可知, 用 Dh菌株处理后对钩麦蛾体内
POD活性有较显著的影响。从接菌 24 h开始到 60
h,处理虫体 POD酶活性明显低于对照,说明Dh菌株
侵染对钓麦蛾幼虫体内 POD酶活性有明显的影响。
由于幼虫感染初期对外界侵染的防卫能力较弱, 不能
及时对外界的侵染给予抵抗; 表现出对虫体内 POD
酶有明显的抑制作用。但从接菌 75 h 左右开始幼虫
体内 POD酶活性迅速升高,并明显高于对照, 这表
明, Dh菌株侵染苜蓿钩麦蛾幼虫后产生有毒的氧化
物质,受侵染虫体启动免疫系统合成 POD,因而表现
为POD活力迅速提高,以维持虫体正常的生理功能。
图 2 Dh菌株处理对钩麦蛾幼虫体内 POD活性的影响
Fig . 2 Chang of the POD activ ity o f the larv ae of
A . anthy lidella infected by the conidia of Dh strain
123
草 地 学 报 第 16卷
2. 3 Dh菌株侵染对钩麦蛾幼虫体内过氧化氢酶
(CAT)活性的影响
用 Dh 菌株处理后对钩麦蛾体内过氧化氢酶
( CAT)活性有较显著的影响, 其趋势呈先下降后上
升。从接菌 24 h 开始到 34 h左右, 处理虫体 CAT
酶活性明显低于对照,表明 Dh菌株处理对钓麦蛾
幼虫体内 CAT 酶活性具明显的抑制作用。但从 34
h开始到 60 h 这段时间表现出受侵染幼虫 CAT 酶
活性明显高于未外理幼虫的酶活性。说明 Dh 菌株
侵入幼虫体内后虫体内的 CAT 酶活性被激活, 以
消除病菌毒害的影响。从 60 h 后开始,接菌幼虫体
内的 CAT 酶活性升高的趋势减缓, 基本与未处理
的对照虫体一致。可能由于受感染虫体内部组织和
物质代谢受到严重破坏, 导致 CAT 酶活性逐渐下
降(图 3)。
2. 4 Dh菌株侵染对钩麦蛾幼虫体内超氧化物歧化
酶( SOD)活性的影响
从图 4可看出, 接 Dh 菌株处理对钩麦蛾体内
SOD酶活性有一定的影响, 但变化幅度不大, 其趋
势大体上与对照相一致。从接菌 24 h 开始到 30 h
左右,处理幼虫体内 SOD酶活性明显高于对照。说
明 Dh菌株侵染对虫体内代谢活动, 以及幼虫的保
护反应,使得虫体内 SOD酶活性迅速激活, 以此来
抵御Dh菌的侵染。但接菌处理 48- 60 h 幼虫体内
SOD酶活性略低于未处理虫体, 这表明随感病菌程
度的加重, 虫体内的各种代谢活动受到影响, SOD
酶活性受到一定程度的抑制。
3 讨论与结论
据报道, 昆虫受真菌感染死亡的真正原因是产
生毒素[ 14] 。毒素可通过胞内钙离子增加及膜内蛋
白酶磷酸化的级联反应最终导致了昆虫肌肉瘫疾和
机体内靶组织坏死和功能丧失, 造成虫体僵直表皮
黑化[ 15]。本试验结果显示, 供试的 Dh菌株对钩麦
蛾幼虫有较强的致病性, 死亡幼虫体表明显发黑特
别是受感染部位较为明显(如图 1所示) , 虫体僵硬,
表面失去光泽。这是否为 Dh 菌株产生毒素所致,
以及其致病机理尚需进一步研究探索。
本试验与其他学者[ 5~ 7, 10, 11, 13, 16] 的研究均表明,
昆虫体内存在的过氧化氢酶( CAT )、过氧化物酶
( POD)和超氧化物歧化酶 ( SOD)的活性和昆虫对
外界刺激物反应有关, 与抗逆性有关。试验结果表
明,钩麦蛾幼虫经四脊裸胞壳 Dh菌株处理后,其体
内的 POD、CA T 及 SOD酶活力水平较正常虫体有
明显的变化,说明钩麦蛾幼虫体内的 POD、CAT 及
SOD酶活力与对 Dh菌株侵染的反应有关。用 Dh
菌液处理钩麦蛾幼虫后, 初期阶段 ( 36h 前)可能由
于病菌未完全侵入幼虫体壁,幼虫体内过氧化物酶
( POD)和过氧化氢酶( CAT )活性受到抑制, 明显低
于对照,以后随着 Dh 菌株不断侵入并扩展可能导
致钩麦幼虫产生有毒氧化物质, 受侵染虫体启动免
疫系统合成 POD 和 CAT ,使这两种酶活性迅速提
高以消除病菌毒害的影响,以维持虫体正常的生理
功能。
据报道, 所有需氧生物的生理过程均有自由基
的产生和清除,且两者之间存在平衡,若失去平衡,
便会损伤机体, 引起病变[ 17]。本试验结果表明, 接
菌 24 - 30 h, 钩麦蛾幼虫体内超氧化物歧化酶
( SOD)活性明显高于对照,可见接菌后幼虫体内的
SOD活力迅速提高, 以减轻过氧离子对虫体的毒
害, 也表明被感染的钩麦蛾幼虫体内自由基增多。
(下转第 140页)
124
草 地 学 报 第 16卷
[ 11] H aagenson D M, Cunning ham S M, Volen ce J J. Root ph ysi
ology of les s fall dorm ancy, w inter hardy alfalfa select ions
[ J ] . Crop Sci. , 2003, 43: 14411447
[ 12 ] Cunningham S M, Volence J J, T eu ber L R. Plan t sur vival
and root an d bud composit ion of alfalfa population s s elected for
cont ras tin g fal l d orm an cy [ J ] . Crop Sci. , 1998, 38: 962969
[ 13 ] Clos e T J . Dehydrins : Emergen ce of a biochemical role of a
family of plant dehydrat ion proteins [ J] . Physio. Plant , 1996,
97: 795803
[ 14] C hen T H H , H ow e G T , Bradshaw H D. Molecular g enetics
analysis of dormancyrelated t rait s in poplar s [ J ] . Weed S ci. ,
2002, 50: 232240
[ 15] Olsen J E, Jut t ila O. Far red en dofday t reatm ent restores
w ild typelike plan t len gth in h ybrid aspen overexpressing phy
t och rom e A [ J ] . Phys iol . Plant , 2002, 115: 448457
[ 16] Wel ling A, M or itz T, Palva E T , et al . Indep endent activa
t ion of cold acclimat ion by low tem perature and short photop e
riodin hybrid aspens [ J ] . Plan t Phys iol, 2002, 129: 1633
1641
[ 17] Olsen J E , Ju tt ila O, Mroit z T . Longday induce bud b reak in
salix pen tadra is associatedw ith t ran sien tly elevated levels of
GA1[ J] . Plant Cell Phys iol, 1997, 38: 536540
[ 18] Eriks son M E , Morit z T . Daylen gth and soat ial expression of
a gibb erellin 20oxidase is olated f rom hybrid aspen ( Populus
t rem ula L. xp. t remuloides Michx. ) [ J ] . Planta, 2002, 214:
920930
[ 19] Olsen J E , Jut t ila O, Mroit z T . A localized decrease of GA1 in
sh oot t ips of S alix pentandra s eedlings precedes cess at ion of
sh oot elongat ion under sh ort p hotoperiod[ J ] . Physiol. Plant ,
1995, 95: 627632
[ 20] 宋桂龙,韩烈保. 土壤配比对运动场草坪草生长的影响[ J] . 草
地学报, 2007, 15( 2) : 199120
[ 21] 谢晓蓉,刘金荣, 李唯,等. 干热对草地早熟禾生理反应与坪
用质量的影响[ J] . 草地学报, 2007, 15( 6) : 572576
[ 22] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术[ J ] . 北京: 高等教育
出版社, 2000. 35160
(责任编辑 梁艳萍)
(上接 124页)
以后随着病菌在幼虫体内的大量繁殖, SOD的合成
受到抑制,自身的防卫能力迅速下降,因而在感病后
期的 SOD活力低于对照健康的幼虫。也可能是由
于感病幼虫体内自由基的增多, 使钩麦蛾幼虫体内
自由基的产生和清除之间失去了平衡, 因而损伤了
幼虫机体,使 SOD活力下降。
总之,苜蓿钩麦蛾幼虫受 Dh 菌株侵染后, 其体
内 POD、CAT 和 SOD活力均表现出升高或降低趋
势,表明幼虫保护酶系统与昆虫病原真菌对宿主的
侵染存在一定的相关性, 但其作用机理尚需进一步
研究探索。
参考文献
[ 1] 赵金梅,周禾,王秀艳.水分胁迫下苜蓿品种抗旱生理生化指标
变化及其相互关系[ J] .草地学报, 2005, 13( 3) : 184189
[ 2] 朱建兰,常永义,王国利,等.四脊裸孢壳 Dh菌株对小菜蛾等
害虫的室内防治效果 [ A] . 见:迈入 21世纪的中国生物防治
[ C] .北京:中国农业科学出版社, 2005. 231235
[ 3] 朱建兰,常永义. 四脊裸孢壳 ( Dh) 菌株的生物学特性及对沙
枣尺蠖的防治效果[ J] .中国生物防治, 2005, 21( 1) : 2932
[ 4] 朱建兰,张自和.虫生菌四脊裸孢壳 Dh菌株生理特性、致病性
和分子生物学研究[ J] .草地学报, 2006, 14( 2) : 198199
[ 5] 李周直,沈惠娟,蒋巧根,等.几种昆虫体内保护酶系统活力的
研究[ J ] .昆虫学报, 1994, 37( 4) : 399403
[ 6] 张仙红, 王宏民, 李文英,等. 菜青虫感染玫烟色拟青霉后血
淋巴蛋白质含量及几种保护酶活力的变化 [ J ] . 昆虫学报,
2006, 49( 2) : 230234
[ 7] 陈尚文. 马尾松毛虫过氧化物酶与耐药性的关系[ J] . 昆虫学
报, 2001, 44( 1) : 914
[ 8] 李周直. 马尾松毛虫蛋白质、核酸和羧酸酯酶与耐药性的关系
[ J] .昆虫学报, 1993, 36( 3) : 296301
[ 9] 王音,雷仲仁,张青文,等.小菜蛾感染绿僵菌后的病征及组织
病理变化[ J] .中国生物防治 , 2004, 20( 3) : 156160
[ 10] 将志胜,尚稚珍,万树青,等. 光活化杀虫剂三噻吩的电子自
旋共振分析及其对库蚊保护酶系统活性的影响[ J] .昆虫学报,
2003, 46( 1) : 2226
[ 11] 吴小锋,徐俊良,崔为正.家蚕血液过氧化氢酶活力及其与蚕体
抗逆性的关系[ J] .昆虫学报 , 1998, 41( 2) : 124129
[ 12] 王惠生,李建文.乳汁中超氧化物歧化酶( SOD)活性测定方法
的研究[ J] .黄牛杂志, 1994, 70( 1) : 1518
[ 13] 吴小锋,徐俊良,崔为正.家蚕血液超氧化氢酶活力及其影响因
素[ J] .蚕业科学, 1997, 23( 1) : 3841
[ 14] Ferr on P. M icrobial cont rol of pest s and plant diseas e, 1970
1980 [ M ] . London: Academic Press, 1981. 465482
[ 15] 宋肖玲, 李国霞. 昆虫病原真菌对昆虫的作用机制研究进展
[ J] . 微生物学报, 2002, 42( 3) : 388392
[ 16] Moran P J. Crossef fect s of infect ion of cucumber w ith fu ngal
an d bacterial pathogens, and the role of per ox idease [ J] . Bull .
Ecol. Soc. Amer. , 1997, 78( 4) : 287
[ 17] 李产毅,龚和. 昆虫体内抗氧化系统研究进展[ J] . 生命科学,
1998, 10( 5) : 240243
(责任编辑 梁艳萍)
140