全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2002) 04-0287-06
羊草自交不亲和性初步研究
张卫东1, 刘公社+ 1 , 刘　杰1 , 刘　凡2,
齐冬梅1 , 李芳芳1, 董贵俊1, 赵晶晶1
( 1.中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093;
2. 北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京 100089)
摘要: 在自然条件下进行羊草自交、异交结实性实验。采用 FDA 染色法检测羊草小孢子活力, 观测雌、雄蕊发育的
时空特点。结果表明, 在草原上羊草异交结实率远大于其自交结实率。在成熟花药中有生活力的花粉平均达95. 2%
以上。在发育时间顺序和空间结构上,雌、雄蕊并不妨碍自体授粉。另外, 利用禾本科植物自交不亲和性( SI )有关的
硫氧还蛋白 h 基因设计的引物在羊草 DNA 中检测到预期片断。因此,笔者认为,羊草自交不结实或结实率低的主
要原因可能在于基因控制下的自交不亲和反应机制,硫氧还蛋白 h 基因可能与羊草的自交不亲和性有关。这仅为
初步结论, 仍需在细胞学和分子生物学方面取得更多的依据。
关键词: 羊草; 自交不亲和性; 结实率; 花粉活力; 自花授粉; 硫氧还蛋白 h
中图分类号: S 543　　　文献标识码: A
A Preliminary Study on Self-incompatibility of Leymus chinensis
ZHANG Wei-dong
1 , L IU Gong-she
+ 1, L IU Jie
1, LIU Fan
2 , QI Dong-mei
1,
L I Fang-fang
1 , DONG Gui-jun
1, ZHAO Jing-jing
1
( 1. Key Laborator y of Photosyn th es is and Environm ental Molecular Physiology,
Ins t itu te of Botany, Chinese Academy of Sciences , Beijing 100093, Ch ina;
2. Beij ing Vegetable Research C enter, Beijing Academy of Agriculture and Fores t ry S ciences, Beijing 100089, China)
Abstract: The self ing and outcrossing seeding capability of w ildry e ( L eymus chinensis) w er e invest igated
under the natural environments. The viabil ity of pollens w as est imated by the w ay of FDA fluorescent
staining and the developmental characters of pistals and stamina at t ime and space w ere observed. T he
results show ed that the selfing set t ing percentag e w as far less than the outcrossing set t ing percentag e in
the fields. T he mean value of viable pollens w as above ex ist tempo ral and spat ial iso lat ion betw een st igmas
and anthers. In addition, thior edox sin h gene w as consider ed to be related to self-incompat ibility in
poaceae plants. Using the pr imer s designed fr om it , the anticipated f ragment was detected in the genome
of L eymus chinensis by PCR amplificat ion. So, the author s considered that no or much low er sel fing
seeding percentage may l ie in the self-incompat ible mechanism under the genet ic contro l in L eymus
chinensis, and the thior edox sin h gene may be related to it s self-incompat ibility . How ever , this is only an
init ial conclusion and much evidence is needed to pro ve this in cytolog y and mo lecular biolog y.
Key words : L eymus chinensis; Self-incompat ibility ; Set ting percentage; Pollen v igor ; Self-pollinat ion;
T hio redox sin h
收稿日期: 2002-04-04; 修回日期: 2002-07-04
基金项目: 本项目由中国科学院知识创新重大项目( KSCX1-08-03)和国家十五攻关项目( 2001BA707B02)支持
+ 通讯作者: 刘公社, E-mail: l iugs@ 95777. com
作者简介: 张卫东( 1968-) ,男,河北东光人,讲师。本科和硕士研究生毕业于山东师范大学, 2001年 9月考入中国科学院植物研究所攻读
博士学位
第 10 卷　第 4 期
　Vol. 10　　No . 4
草　地　学　报
ACTA AGREST IA SINICA
　2002 年　12月
Dec. 　2002
　　羊草( L eymus chinensis ( T rin. ) kitagaua) , 属
禾本科赖草属,是广泛生长于我国东北、华北和西北
的优良牧草, 品质优良,营养价值高, 抗逆性强, 适口
性好,目前在发展人工草地、改良退化草原方面占重
要地位[ 4]。
　　但是,羊草的抽穗率、结实率、种子萌发率都较
低,尤其是自然状态下结实率低,限制着羊草种子产
量及人工草地建设。围绕羊草低结实率的原因和解
决方法,前人在羊草的生态环境、栽培条件、生理、细
胞学特征等诸方面进行了研究。马鹤林等认为, 羊草
群体抽穗期长、开花不集中,导致结实低[ 1] ; 另外,线
虫病也是影响结实率的因素[ 1]。潘国富等发现在羊
草小孢子母细胞减数分裂过程中, 出现不同程度单
价体、落后二价体、染色体桥等异常行为, 它们对花
粉活力有较大影响, 但同时认为这种异常行为并不
是羊草结实率低的主要原因 [ 12] ,进而提出羊草结实
率低的原因可能是基因作用直接引起生理代谢障碍
或者环境引起生理失调,从而影响受精作用及合子
的正常发育, 但这一观点缺乏关键的实验支持[ 12]。
在实践中,人们试图通过各种途径提高羊草结
实率。王梦龙认为羊草结实受生态环境、生长年限、
营养物质分配等多种因素的影响, 因此强调在生产
过程中应选择水热条件好的地区种植羊草 [ 5]。杜建
材等人尝试通过体细胞杂交导入外源基因改变羊草
遗传特性,为改良羊草结实力寻找新的突破点[ 8]。
总之,关于羊草结实率低的原因,目前还没有一
致认识。本研究试图通过对比羊草自交、异交的结实
率,检查成熟花粉的活力和测定开花时雌、雄蕊发育
的时空特点, 检测与自交不亲和性有关的硫氧还蛋
白 h基因等实验方法探索羊草自交不亲和性与结实
性之间的关系。
1　材料和方法
1. 1　羊草自交、异交实验
实验材料全部采用本实验室搜集的羊草种质资
源。实验材料于 1999年 10月下旬播种于中科院植
物所植物园内,小区面积 6m2 ( 2m×3m )。2000年 3
月下旬返青, 2000 年 6月中旬陆续进入孕穗、开花
期。选取种质间形态、生长状态差异较大生长发育较
为整齐一致的 10份材料用于本项研究,其中包括王
克平等选育的吉生一号 [ 3]育成品种(在本实验中编
为 1号,作为对照)和 9份野生种质资源,其中 2份
引自于黑龙江省扎龙自然保护区(编为 7、10号) , 另
7份引自内蒙多伦县编为 13、14、15、16、17、18、19
号)。
羊草孕穗后,当整穗的 1/ 3抽出超过旗叶时, 在
选定的 10份材料中, 每份随机取 10株, 采用套袋
法,使其自交。种子成熟时收获每 1单穗,统计每份
材料每个单穗的小花数和结实数, 计算自交结实率。
同时,每份材料随机选定 10株,在自然条件下开花、
授粉。种子成熟时单穗收获,统计单穗小花数和结实
数,计算自然结实数。自然结实率与套袋自交结实率
的差值是自然条件下异交结实率。
1. 2　成熟花粉活力检查
1. 2. 1　供试羊草材料为 7号。选择小穗的标准是,
小穗基部的第 1、2朵小花已可外露的花药,其余的
尚未开放。这个时期花药内的小孢子已经发育成熟。
取不同小穗上的 8 朵小花,编号 1～8, 剪取出每朵
小花中的 3个花药并移到载玻片上, 用手术刀将花
药横切开,再用玻璃棒轻轻挤压花药,使小孢子游离
于等渗溶液中。
1. 2. 2　采用 FDA 法染色[ 5, 13] ,　用盖玻片覆盖小
孢子溶液。在普通显微镜( 200X)和荧光显微镜
( 200X)下观察照相, 同时记录每个视野小孢子总数
和正常花粉数, 统计每朵小花有活力的花粉百分数。
1. 3　雌、雄蕊显现的时间和空间特点
在供试材料(同 1. 2. 1)中随机取 10个整穗, 在
整穗中间的小穗确定 10朵待开放小花,分别挂牌编
号 1～10。观察记录每朵小花柱头完全出现的时间,
花药开始出现时间, 花药完全出现以至下垂时间, 以
及花药开始破裂散粉时间,并计算各时段的间隔。同
时,选择另外10朵小花,在花药完全伸长但尚未散粉
时,观测花药、子房、柱头顶端三者之间的空间距离。
1. 4　硫氧还蛋白 h基因片段 PCR扩增检测
1. 4. 1　供试材料( 7、9号) ,栽培条件同 1. 1。
1. 4. 2　基因组 DNA 提取　用常规 CTAB 法提取
羊草 DNA [ 11]。
1. 4. 3　PCR 程序及引物设计
1. 4. 3. 1　反应总体积 50Ll, 包括: 1×buffer;
c( dNTP) = 0. 2mmol/ L ; c ( Primer ) = 1Lmol/ L ;
288 草　地　学　报 第 10卷
m( DNA模板) = 100ng , Taq 酶 1. 5U (购自上海生
工公司)。
1. 4. 3. 2　根据文献报道[ 15] ,合成两对引物。引物对
1: 5’-CT ACGACCAGGAGAGGAGACC-3’、5’-
AGGGAGACGAAGACGA TGAGC-3’; 引物对 2:
5 ’-AAGCAAACAAGGATGGGAAAA -3’、 5’-
GCGGAAAAGACACGGAAACTG-3’。引物均由上
海生工公司合成。
1. 4. 3. 3　PCR 反应条件为: 94℃ t 1min, 一个循
环: H94℃ t 1min, H58℃ t 1min, H72℃ t 1min 30s, 36
个循环; H72℃延伸 t10min。采用英国 Techne公司
Gene E 型 PCR仪。
1. 4. 4　电泳并照相　1. 2g / 100mL 琼脂糖胶, 含
0. 5ml/ L EB(溴化乙啶) ,电压 80V 走电泳 1. 5h,电
泳后在紫外灯下观察并照相。( DNA M ar ker 为
DGL2000,购自北京鼎国生物技术中心)。
2　结果与分析
2. 1　异交结实率远大于自交结实率
在自然条件下,羊草自交结实率大多数为 0, 偶
有结实的材料, 结实率也很低( 2. 99%～3. 32%)。与
自交结果不同, 在相同条件下,虽然羊草自然异交结
实率也较低, 但远大于自交的结实率( P< 0. 01) , 最
低是 6. 5%, 最高为 56. 71%。由于羊草具有一定数
量的自然授粉结实率,说明至少有相同数目的大孢
子是有活力的(表 1)。
2. 2　成熟花粉具有较高成活率
2. 2. 1　羊草 7号材料的自交结实率为零(表 1) , 7
号的花粉是否正常? 采用 FDA 荧光染色法对其花
粉生活力进行检测。图 1的两张照片取自同一个显
表 1　在自然条件下羊草自交与异交结实率
Table 1　Compar ison of t he fer tilization percentag es fo selfing and cr ossing under the field condit ion
材料编号
No. of genotype
1 7 10 13 14 15 16 17 18 19
每穗小花数
Number of f lorets in a spike
133. 7 161. 3 224 69. 7 148. 0 103. 3 122. 0 236. 3 157. 0 150. 7
自交结实率( % )
S el fin g s et t ing percentage
3. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3. 3
异交结实率( % )
Outcross ing sett in g percentage
56. 7 43. 6 6. 5 19. 2 40. 1 45. 2 38. 0 12. 1 22. 3 9. 8
图 1　成熟小孢子 FDA 检验
(左图:光学显微镜 200X;右图:荧光显微镜 200X。箭头所指为丧失生活力的小孢子)
Fig. 1　Obser vat ion o f mature micr ospor es under micro scopes
( Left : General opt ical microscop e 200X; Righ t : Fluorescent micr os cope 200X. Nonviable microspores show ed w ith th e ar rows )
289第 4期 张卫东等:羊草自交不亲和性初步研究
微视野,左侧在白色光照下( 200X)花粉的形态, 花
粉大小和形状存在一些差异, 有的花粉较大且内含
物丰富,呈现深褐色;有的较小, 内含物较少(箭头所
示)。右侧照片是在荧光显微镜( 200X)下花粉的颜
色和形态,大多数花粉均有明亮的荧光,少数花粉荧
光暗淡或全无荧光(箭头所示) , 后者正是没有生活
力的花粉。结果表明, 在成熟花药中,有生活力的花
粉显著多于无生活力的。
2. 2. 2　为了获得花粉生活力的具体数据,进一步选
择 8朵小花,应用上述荧光检验法观测。结果显示,
在观察的不同小花中, 花粉成活率最低 92. 2% , 最
高达 97. 2% ,平均 95. 2%。说明 7号材料成熟花粉
具有较高的成活率, 花粉败育最高不到 8%。因此,
花粉生活力不是限制羊草自交结实的主要障碍(表
2)。
表 2　小孢子 FDA 活力检测结果
Table 2　Result s o f viable micr ospor es by micr oscopy o f FDA fluor escent staining
小花编号
No. of f loret s
1 2 3 4 5 6 7 8
观察花粉总数
Total pol lens observed
71 49 59 57 53 61 57 64
FDA 阳性数
Pos it ive number of FDA
69 46 57 55 50 58 55 59
有生活力花粉百分率
Viable pollens per cen t
97. 2 93. 9 96. 1 96. 5 94. 3 95. 2 96. 5 92. 2
2. 3　雌、雄蕊发育在时间上具有同步性, 在空间结
构上相互匹配
2. 3. 1　羊草开花时柱头显露的时间在一天内集中
于两个高峰,其一为上午 8: 30～9: 30 h 左右,其二
为下午 15: 00～16: 00 h左右。在一个整穗中, 位于
中上部的小穗最先开花,然后是向下、向上相邻的小
穗陆续开花。同一朵小花,先出现柱头,再出现雄蕊。
在雌蕊、雄蕊显现过程中, 各个时间阶段基本稳定。
从柱头出现至花药开始散粉全过程, 最长 350min,
最短 160min,平均 289. 6m in。花药散粉时柱头已经
完全伸展、舒张,适于接受花粉。花药大量散粉发生
在柱头开始萎缩之前。因此, 在开化过程中, 羊草完
全显露柱头、花药开始散粉基本上是同步进行。柱头
接受自体花粉不存在时间隔离(表 3)。
表 3　开花时, 雌、雄蕊显现时间顺序( min)
T able 3　T ime sequences o f appear ance o f the pistil and stamina dur ing flow er ing period( min)
植株编号
No. of plan ts
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
平均值
Mean
T1 183 210 155 162 330 331 332 333 334 335 270. 5
T2 14 14 3 56 5 6 7 8 9 10 13. 2
T3 6 6 2 12 3 4 5 6 7 8 5. 9
T4 203 230 160 230 338 341 344 347 350 353 289. 6
　　注: T1,从柱头开始出现到花药开始显现(长约 1mm)的时间; T2,从花药开始显现到花药完全伸长的时间; T 3,从花药完全伸长到花药破裂
散粉的时间; T4,从柱头开始出现到花药顶端破裂散粉总时间
Note: T 1: Th e t ime from st igma′s init ial appearance to anther′s init ial appearance( about 1mm long ) ; T2: The t ime fr om st igma′s init ial
ap pearan ce to anther′s init ial appearance; T 3: Th e t ime f rom s t igma′s init ial appear ance to anther′s init ial appearance; T4: T he total t ime f rom
st igma′s init ial appearance to pollens′spreading out f rom the anther
2. 3. 2　在一朵小花中,花药与子房,柱头顶端与子
房,花药与柱头间的平均空间距离分别为 5. 35, 1. 4
和 3. 85mm。羊草为穗状花序,柱头为蓬松、平展、宽
大的羽状柱头。在空间结构上,由于重力和风力的作
用, 柱头有机会接受同一整穗上部小花散落的花粉,
因此, 雌蕊柱头接受自体花粉的空间隔离可能性
较小。
2. 3. 3　以上几个实验数据表明,羊草自交不结实或
结实率较低,花粉(成活率较高)不足以成为限制因
素。自交也不存在时间与空间的隔离, 那么, 自交不
290 草　地　学　报 第 10卷
孕的原因很可能是位于特定的发育时期一花粉与柱
头的相互识别至双受精形成正常合子一即自交不亲
和性障碍。
2. 4　硫氧还蛋白 h基因 PCR扩增结果
在禾本科植物中有一种与自交不亲和性有关的
硫氧还蛋白 h, 其N 端为可变区,在不同物种中其序
列差异较大。其C 端则为保守区,具有催化功能,在
不同物种中具有相似的序列[ 18]。从羊草叶片中提取
总 DNA, 设计两对引物, 其中第一对引物用以扩增
部分可变区序列,第二对引物用以部分保守区序列。
PCR扩增结果图 2,在两个材料中, 第一对引物没有
扩增出明显条带; 第二对引物则扩增出预期的约
1500bp产物(右侧箭头所示)。扩增结果与其它具有
自交不亲和性禾本科植物的扩增模式相同,说明羊草
中也有与自交不亲和性有关的硫氧还蛋白h 基因。
表 4　雌、雄蕊空间距离观测结果(mm)
T able 4　Spat ial dist ances among anthers, ov ary and stigma in flow er ing spicula( mm)
植株编号
No. of plan ts
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
平均值
Mean
S 1 4 5 4 6 6 6 5. 5 5 6 5 5. 35
S 2 1 1. 5 1. 5 2 1. 5 1 1. 5 1 1 2 1. 40
S 3 2. 5 4 4 3 4 4 5 5 3 4 3. 85
　　注: S1:花药与子房间的平均距离; S2:柱头与子房间的平均距离; S 3:花药与柱头顶端间的平均距离
Note: S1: Th e averag e distance b etw een anthers and ovary; S 2: Th e average dis tance betw een st igm a and ovary; S 3: Th e average dis tance
betw een anthers and the top of st igma
图 2　7 号和 10 号材料的硫氧还蛋白 h基因扩增结果
　　( 1～3是引物对 1的扩增结果; 4,分子量标记: 5～7是引物对 2
的扩增结果。1、5,空白对照; 2、6,材料 7; 3、7,材料 10。箭头所指为
保守区 1500bp特征带)
Fig . 2　The amplified fra gments fo t hior edox in h gene in
Geno type7 and Geno type 10 of Leymus chinens is by PCR
　　( 1～3: The result s ampl if ied b y primer pairs1; 4: DNA w eigh t
markers; 5～ 7: The resul t s ampl ified by prim er pairs 2; 1、5:
Negat ive con trol s; 2、6: Genotype7; 3、7: Genotype; 10: Th e arrow
indicates the specif ic conserved 1500bp bands in genotype 7 and
gen otype 10)
3　讨论与结论
3. 1　自交不亲和性是指雌雄同体植物能够产生同
期成熟、有正常功能的雌雄配子,在自花授粉或相同
材料异花授粉时不能受精的现象,其实质是自花授
粉时受粉过程受阻。正常受精现象是花粉在柱头上
萌发,花粉管穿过柱头,延伸至胚囊,精细胞、卵细胞
结合。如果其中任何一个环节受阻,都会造成自交不
亲和。自交不亲和实质上是由于花粉和雌蕊间相互
识别,表现出抑制花粉管萌发所致[ 9]。禾本科植物普
遍存在自交不亲和现象, 在 6 个亚科中有 5个亚科
存在自交不亲和的种,自交不亲和或以异花授粉为
主的种至少在 16个属中占有优势[ 14]。
3. 2　实验证明,在自然条件下羊草异交结实率远大
于自交结实率。有文献报道羊草正常花粉数目减少,
某中 50%是异常花粉[ 2]。另有报道 [ 10]则显示羊草花
粉大多是活力的,本实验的结果支持后者。本文的结
果还表明,在时间上,羊草雌蕊柱头接受花粉和雄蕊
花药散粉基本上是同步进行, 在空间上,柱头的形态
结构和花药、柱头的相对空间位置也不影响柱头接
受自体花粉, 羊草的自体授粉不存在时、空隔离障
碍。另外,由于羊草异交具有一定的结实率, 说明至
少有相同数目的大孢子为正常。在不存在自体传粉
的时、空隔离, 花粉活力正常的情况下, 自交结实率
远低于异交结实率,即自交时一定数量的可育大孢
子不能最终结实,可能是雌雄相互识别形成合子(自
交不亲和性)或胚胎发育过程中存在生理障碍。
3. 3　硫氧还蛋白 h( T hioH )基因最早从禾本科草
291第 4期 张卫东等:羊草自交不亲和性初步研究
芦属镳草( Phalaris coer ulescens)的花粉中分离而
来,镳草是自交不亲和植物。ThioH 基因是在成熟
花粉中特异表达, 在其它组织中微量表达或不表
达[ 18 ]。镳草的SI 突变体具有自交可育性, 其基因产
物一硫氧还蛋白 h的催化活性降低[ 17]。在其它自交
不亲和禾草中也分离到 T hioH 基因[ 15] ; 但另有不
同的报道认为 T hioH 并不在 S 位点上[ 14]。因此,目
前认为 ThioH 基因至少与镳草的自交不亲和性有
关。笔者通过 PCR 反应确定羊草中存在同样的基
因,该结果为羊草存在自交不亲和性提供了新的分
子证据。不过, ThioH 基因是否就是影响羊草自交
不亲和性的基因? T hioH 基因是如何调控自交不孕
的? 这些问题仍值得进一步深入研究。
3. 4　综上所述,认为羊草自交不结实或结实率低的
主要原因可能在于基因控制下的自交不亲和反应机
制。不过,该结论只是根据目前有限的实验所得出的
初步结论。仍需在细胞学和分子生物学方面取得更
多的依据。鉴于过去已在芸薹属、茄科的植物中克隆
出自交不亲和基因,并获得转基因植物,改变其不亲
和性状[ 13, 19]。禾本科植物自交不亲和性的分子机理
研究目前正成为生殖研究的一个热点[ 18] ,羊草的分
子标记研究业已取得一定进展 [ 6]。如果获得控制羊
草自交不亲和性的基因,就可以采用基因工程的方
法(例如反义 RNA 技术) ,调控羊草的自交结实率。
另一方面还可以利用羊草的自交不亲和性选配优良
组合,运用传统育种方式开发利用羊草的杂种优势。
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292 草　地　学　报 第 10卷