全 文 ：第 16 卷
第 5 期

Vol. 16
No . 5
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2008 年
9 月

Sep.
2008
白羊草成熟胚组织培养及植株再生体系的建立
于
娜 , 董宽虎*
(山西农业大学动物科技学院, 山西 太谷 030801)
摘要: 以白羊草( Bothr iochloa ischaemum ( L . ) Keng )成熟胚为外植体, 研究不同激素及其不同配比对愈伤组织诱
导发生与生长状态及其绿苗分化能力的影响。从而建立了白羊草植株再生体系,为开展生物技术育种提供参考。
结果表明:在愈伤组织诱导培养基中添加 2. 0 mg / L 2, 4
D诱导频率为 86. 7% , MSB和 MS 培养基对愈伤组织诱导
效果相近;在其继代培养基中添加 1. 0 mg/ L 2, 4
D愈伤组织增殖快, 且保持胚胎发生能力; 适宜的分化培养基为
6
BA 0. 1 mg/ L+ NAA 0. 05 mg/ L, 分化率达 61. 3% ; 愈伤组织在不添加任何生长调节剂的培养基上即可生根。
关键词: 白羊草; 成熟胚; 愈伤组织; 植株再生
中图分类号: S336




文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2008) 05
0466
04
Tissue Culture and Establishment of Plant Regeneration System from
Mature Embryo of Bothriochloa ischaemum ( L. ) Keng
YU Na, DONG Kuan
hu*
( College of Anim al Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricu ltural U nivers ity, T aigu, Sh anx i Province 030801, China)
Abstract: Effects of hormones and their combinat ions on callus induct ion, g row th state, and shoo t reg ener

at ion w ere studied using the mature embryos of Bothr iochloa i schaemum ( L . ) Keng as example plants. At
same t ime, in order to prov ide gr oundw o rk for the biotechnolo gy breeding, the plant r eg eneration sy stem
of B. i schaemum was set up. Results indicate that the callus induct ion f requency reached 86. 7% in the cal

lus induct ion medium supplemented w ith 2. 0 mg / L 2, 4
D and similar ef fectiveness w as detected betw een
MSB and MS medium . Rapid grow th of callus and embr yogenesis w ere maintained in the callus subculture
medium w ith addit ion of 1. 0 mg/ L 2, 4
D. A fter callus subculture, the shoot reg enerat ion rate from callus
w ere 61. 3% in the dif ferentiat ion medium supplemented w ith 0. 1 mg/ L 6
BA and 0. 05 mg/ L NAA. and
the r oot development w as independent upon any ho rmone composit ions.
Key words: Bothr iochloa i schaemum ( L. ) Keng ; M ature embryo ; Embryogenic cal lus; P lant regener at ion


组织培养技术作为生物技术的主要组成部分和
基础,只有建立起成熟的高频再生无性系,才能进行
细胞工程育种和基因转化的研究。白羊草( Bothr i

ochloa ischaemum ( L . ) Keng )是禾本科孔颖草属
多年生草本植物 [ 1] ,是一种丛生、具匍匐茎的多年生
暖季型牧草,具有固土保水,生活力强, 高产耐牧、耐
践踏,适口性好等优点,是饲用价值较高的放牧型禾
草之一,广泛分布于我国暖温带落叶阔叶林地带, 是
控制水土流失和提供家畜饲草的重要草种[ 2]。目前
关于白羊草组培再生体系的研究较少, 仅上个世
纪 90年代肖辅珍等分别以白羊草成熟胚和幼穗
为外植体, 诱导出胚性愈伤组织, 但在诱导植株时
需转至无激素培养基进行分化, 这样会直接影响
再生植株的诱导频率 [ 3] 。因此, 本试验以白羊草
成熟种子为外植体, 在愈伤组织诱导、分化阶段中
试图寻求更适宜的激素组合配比, 以建立白羊草
的植株再生体系, 为白羊草的育种及转基因研究
奠定基础。
收稿日期: 2008
02
29; 修回日期: 2008
05
26
基金项目: 国家科技支撑计划项目( 2007BAD56B01)
作者简介: 于娜( 1979
) ,女,山西阳城县人,硕士研究生,研究方向为草地资源与草地管理, E
mail: yu na1023@ 126. com ; * 通讯作者: Au

thor for corresponden ce, E
mai l: dongk uanhu@ 126. com
第 5期 于娜等: 白羊草成熟胚组织培养及植株再生体系的建立
1
材料与方法
1. 1
材料
供试的白羊草种子 2006年 10月采自山西省太
谷县凤山, 海拔 1100 m,植被为喜暖灌草丛类草地,
建群种为白羊草 ( Bothr iochloa ischaemum ( L . )
Keng) ,种子千粒重约 0. 70 g[ 4]。
1. 2
方法
1. 2. 1
白羊草种子的处理
取完全成熟、结构完整的白羊草种子,人工拨去
外稃,先用无菌水浸泡 10 min, 去除杂质并使其沉
淀,然后用 75%酒精浸泡 30 s,用无菌水冲洗 3次,
再用 0. 1%升汞溶液消毒 15 min,期间不断摇动, 用
无菌水冲洗 3次后, 用滤纸吸干水渍。
1. 2. 2
愈伤组织的诱导
将消毒晾干的白羊草种子接种于不同的愈伤组
织诱导培养基上, 每瓶 25粒种子, 重复 3次, 置于
25
2
,完全黑暗条件下诱导产生愈伤组织, 自种
胚开始萌发时每隔 4 d记数 1 次, 包括发芽数和出
愈数, 直到出愈数稳定时停止计数。诱导培养基分
别为: 1) M SB+ 2, 4
D, 2, 4
D 浓度设置 6个梯度分
别为: 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、6. 0 mg/ L ; 2) M S、MSB
+ 2, 4
D, 2, 4
D浓度为 2. 0 mg/ L ;
MSB培养基: M S 无机盐+ B5 有机成分, 以及
蔗糖( 30 g/ L) , 琼脂( 5 g/ L ) ,以上培养基的 pH 值
调至 5. 8,在 121
条件下灭菌 20 min。
1. 2. 3
愈伤组织的继代改造
25
30 d后将初生愈伤组织从母体上切下,转移
至降低2, 4
D浓度的改造培养基上,继代 4~ 5 d, 继
代培养基为 MSB+ 1. 0 mg / L2, 4
D。
1. 2. 4
愈伤组织的分化
将继代生长致密的胚性愈伤组织转移到附加不
同浓度的 KT、ZT、6
BA、NAA 以及蔗糖( 30 g/ L )、
琼脂( 5 g/ L) MSB分化培养基上进行分化。培养温
度 25
2
, 光照强度 2000~ 3000 Lx, 光周期为
16 h/ d。接种 30 d统计分化率,待芽长到 6~ 7 cm,
根长 3~ 4 cm 时转至无激素的培养基上生根。
1. 3
离体培养方法
种子在愈伤组织诱导培养基上培养 25 d后,将
愈伤组织转移到愈伤组织继代培养基上。挑选外表
呈干燥、紧密、颗粒状愈伤组织在愈伤组织继代培养
基上继代培养 4
5 d,经继代培养的愈伤组织转到愈
伤组织分化培养基上,培养 30 d 后统计绿苗分化率。
2
结果与分析
2. 1
不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响
成熟胚接种到固体培养基后, 大多数愈伤组织
从幼苗的下胚轴处形成, 有发芽能力的种子均能诱
导产生愈伤组织, 不萌动的种子则没有愈伤组织产
生,少数是在种子的胚着生处直接形成愈伤组织。
在黑暗条件下2 d种子开始萌动, 出芽后 7 d形
成可见的愈伤组织, 25 d 增长到出愈高峰, 愈伤组
织质地和外形均为一致, 表面呈乳白色,质地松软,
水浸棉絮状。2种培养基的培养效果如表 1。在供
试的两种培养基中, 出芽率和愈伤组织诱导率都在
80%左右, 但 MSB 培养基显著高于 MS 培养基
( P< 0. 05)。愈伤组织质地和外形在这两种培养基
上较为一致,都呈水渍状,透明, 松软(见图 1A)。
表 1
不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响
Table 1
Effect of differ ent basal medium on callus induction o f mature embryo s
培养基种类
Basal m edium
种子数
S eed num ber
出芽数
Bud number
出愈数
Cal lus num ber
出芽率( % )
Budding rate
出愈率( % )
Induct ion rate
MS
75 61 61 80. 09
1. 74b 80. 09
1. 74b
MSB 75 65 65 86. 28
2. 80a 86. 28
2. 80a


注:同列不同小写字母表示差异显著( P< 0. 05) ,下表同此注
Note: Mean s with dif feren t sm all let ters in the same column are signif icant ly diff erent at the 0. 05 level , the same as below
2. 2
激素浓度对白羊草出芽、出愈的影响
从表2中可看出,白羊草的出芽率在不含激素的
处理 6培养基上最高,经激素处理,出芽率反而下降。
2, 4
D浓度对白羊草种子出愈率有一定影响,随着 2,
4
D浓度提高, 出愈率下降。在 2, 4
D 浓度为
2. 0 mg/ L的条件下,白羊草种子有较高的出愈率;在
浓度为 6. 0 mg/ L 时,出愈率下降到 46. 11%;处理 2,
3, 5次之;处理6的种子萌发后,生长为完整的幼苗,
即无菌苗,在整个发育过程中均未形成愈伤组织。考
虑到高浓度 2, 4
D对愈伤质量和分化的影响,诱导白
羊草愈伤组织的 2, 4
D浓度以 2. 0 mg/ L为宜。
2. 3
白羊草愈伤组织的可改造性
本试验中白羊草成熟胚的胚性愈伤组织只能在
形成松软的非胚性愈伤之后, 通过降低培养基中 2,
4
D的浓度,使致密或疏松的颗粒中胚性愈伤组织发
生率提高(见图 1B)。
467
草
地
学
报 第 16卷
表 2
不同 2, 4
D浓度处理种子的出芽、出愈率 (第 30 d)
Table 2
Budding and induction r ates from seeds on the 30 th day under the treatment of differ ent concentrations o f 2, 4
D
编号 No. 2, 4
D浓度( mg/ L)
Concent rat ion of 2, 4
D, mg
L
1
种子数
Number of seeds
出芽率( % )
Buddin g rate, %
出愈率( % )
Induct ion rate, %
1 6. 0 75 63. 36
8. 44d 46. 11
2. 42c
2 4. 0 75 81. 19
2. 08c 59. 79
1. 94b
3 3. 0 75 85. 51
1. 60bc 61. 23
2. 09b
4 2. 0 75 86. 57
7. 95ab 86. 56
7. 95a
5 1. 0 75 82. 03
1. 51bc 47. 83
1. 72c
6 0 75 90. 62
1. 72a 0d
表 3
不同激素配比组合愈伤组织的分化情况
Table 3
Callus differentiation under different combinat ion of hormones
编号 No.
激素配比组合( mg/ L)
H ormon e composit ion mg
L
1
NAA KT ZT BA
接种愈伤数
Number of inoculat ion
胚性愈伤组织发生率( % )
Induction f requency of
embryogen ic cal lus, %
分化率( % )
Dif ferent iat ion f requency, %
1 0. 1 0 0 0. 2 87 41. 64
2. 31bc 18. 35
1. 50ef
2 0 0. 2 0 0. 2 89 31. 33
2. 39cd 24. 95
2. 94de
3 0 0 0. 5 0 81 20. 42
4. 57d 16. 69
3. 21f
4 0 0 0. 1 0. 04 86 81. 94
3. 59a 43. 47
2. 65b
5 0 0 0. 1 0. 05 87 51. 52
3. 55b 59. 73
2. 34a
6 0 0 0. 1 0. 06 88 90. 90
2. 62a 34. 62
2. 65c
7 0 0 0. 1 0. 07 86 85. 56
9. 88a 28. 26
2. 22cd
2. 4
不同激素配比对白羊草愈伤组织分化的影响
由表 3可知,白羊草在 4、5、6三种分化培养基上
的分化率较高,分别达到 43. 47%、59. 73% 、34. 62%,
而在 1、2、3三种培养基上分化率较低。对于不同的
激素组合愈伤组织均可以分化出绿色小苗。以 6

BA、NAA 的培养基上的分化率较高, 但部分胚性愈
伤都会发生褐变。其中以 MSB+ 6
BA 0. 1 mg/ L
+ NAA 0. 05 mg / L 的配比最为合适, 分化率最高
为 59. 73%。适宜的低浓度 6
BA 和 NAA 组合分
化率较高,提高 NAA 浓度会抑制愈伤组织的分化,
以附加NAA 0. 05mg/ L 为最适浓度,低于或高于这
一浓度的分化率都会下降(见图 1C)。
2. 5
生根与移栽
经过 30~ 40 d培养,在愈伤组织表面会出现许
多绿色的点状组织区, 即芽点。3~ 6 d后芽点逐渐
发育为不定芽。当不定芽形成后,将其转移到不含
任何激素的培养基上[ 3] , 30~ 40 d以先长芽后长根
的途径分化出再生苗,苗高最高可达 10 cm ,并且有
发达的根系, 根长可达 4 cm。炼苗3~ 4 d后移入盆
栽,生长良好,小苗成活率达 100%(见图 1D)。
3
讨论与结论
3. 1
白羊草种子相对较小, 千粒重只有 0. 70 g 左
右,采用常规的灭菌时间和方法效果理想。白羊草
种子在消毒前必须浸泡, 以达到彻底消毒又不浪费
材料的目的。
3. 2
白羊草种子的愈伤是在发芽的基础上产生的,
出芽率与出愈率成正相关。接种后第 2 d 开始发
芽,第 6 d就可见白色非胚性愈伤出现, 且增长很
快,第 9 d时出现少量颗粒状胚性愈伤,第17 d达到
发芽高峰,第 24 d左右达到最大出愈率,第 27 d愈
伤组织直径可达 0. 5~ 0. 6 cm ,但大部分为疏松的
非胚性愈伤。2, 4
D在 1. 0~ 6. 0 mg / L 时都能诱导
出明显的体积较大的胚性愈伤组织,随着 2, 4
D 浓
度的增大,愈伤组织出现的比例下降,继代阶段胚性
愈伤出现也越迟, 以 2, 4
D 2. 0 mg / L 时愈伤组织
的出愈率高且诱导的愈伤组织致密而具有较强的胚
性。白羊草愈伤组织是由下胚轴处产生, 包裹着胚
芽,所以将愈伤组织从母体上切下的过程中,对愈伤
组织的处理至关重要, 试验发现切割下来的愈伤中
没有胚芽部分,继代后很容易产生胚性愈伤,否则容
易出现逆转现象, 可能是因为愈伤中的胚芽吸收培
养基中的营养,并在愈伤组织中生长,这样就抑制了
愈伤组织的分生能力, 使分裂减慢, 并使其逐渐老
化,变硬,最终失去转化为胚性愈伤组织的能力。
3. 3
本试验中白羊草成熟胚胚性愈伤组织只能在
形成松软的非胚性愈伤组织之后, 需在较低浓度的
2, 4
D 诱导培养基上继代培养, 才能产生致密的胚
性愈伤组织[ 6~ 7]。从而胚性愈伤发生率明显增大,
提高愈伤组织的分化率 [ 8~ 11]。由于胚性愈伤组织
经继代极易产生,因此继代时间较短。继代时挑选
的胚性愈伤组织在以后的连续继代培养过程中不会
发生逆转,能够顺利的分化出小苗,表现出较高的植
株再生能力,这与佘建明等的结论一致[ 12]。
468
第 5期 于娜等: 白羊草成熟胚组织培养及植株再生体系的建立
图 1
白羊草植株再生过程
Fig. 1
T he plant r eg eneration pr ocess o f B. is chaemum
A.种子诱导产生的愈伤组织; B.外表呈干燥、紧密、颗粒状愈伤组织; C.在分化培养基上愈伤组织分化绿苗; D.移植再生苗
A. Cal lus induced fr om mature s eeds; B. Dry, compact , and sm all pellet s tatus of callu s;
C. Sh oots reg enerated f rom callus; D. T ran splantat ion of the regen erated plan t in pot on the dif ferent iat ion medium.
3. 4
胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织是可以相互
转化的, 其中激素的作用尤为重要[ 13] 。本试验中
KT、ZT 与 NAA 的激素组合分化率低, 将褐化、不
分化愈伤组织从 KT、ZT + NAA 的培养基上转移
到 6
BA 和 NAA组合的培养基上时, 这些愈伤在一
周内长出芽点,进入分化阶段, 说明低浓度的 6
BA
和 NAA组合适宜愈伤组织分化,试验表明,愈伤组
织在分化阶段对 NAA浓度非常敏感, 以附加 6
BA
0. 1 mg / L+ NAA 0. 05 mg / L 为最适浓度, 低于或
高于这一浓度的分化率将会下降。
3. 5
本试验已摸索出一套再生频率较高的组织培
养方法,可以利用组织培养快速繁殖白羊草, 不受季
节、时间的影响,可大大提高繁殖系数和工作效率,
迅速获得大量优质苗, 为种质资源保存和加速良种
化进程提供条件,同时所诱导的愈伤组织可作为基
因研究的受体材料,可为进一步生物工程遗传改良
提供前提条件[ 14] 。
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(责任编辑
梁艳萍
李
平)
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