全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2006) 03-223-08
多花黑麦草遗传连锁图的构建
丁成龙1, 2 , 沈益新1, 顾洪如2, 三浦 优一3
( 1.南京农业大学动物科技学院, 南京　210095;
2.江苏省农业科学院畜牧研究所, 南京　210014; 3.日本畜产草地种子协会饲料作物研究所, 枥木　329-2742)
摘要: 利用多花黑麦草( Lolium multif lorum)细胞质雄性不育( CMS) F1 群体( 124个个体) , 以来自父本和母本的分离位
点采用SSR、AFLP、EST-CAPS(表达序列标签酶切扩增多态性)和RGA-CAPS (抗病基因类似物酶切扩增多态性)等标
记方法进行多态性的选择并对父、母本分别构建遗传连锁图。母本连锁图包含362 个标记位点, 分别包含SSR 标记 240
个、AFLP标记84 个、EST -CAPS 标记24个和RGA-CAPS 标记14 个, 由7个连锁群组成,覆盖全长776. 4cM ,各连锁群长
度在85. 8 至 135 cM 之间,相邻标记之间的平均距离为2. 14 cM ;父本7 个连锁群, 包含376 个标记, 其中SSR 标记252 个、
AFLP 标记82个、EST-CAPS 标记 29 个和RGA-CAPS 标记 13 个,连锁图全长 710. 0 cM , 相邻标记之间的平均距离为
1. 89 cM ;标记密度高、标记分布均匀、连锁图长度中等。
关键词: 多花黑麦草( L olium multif lorum) ; 遗传连锁图; SSR(简单重复序列) ; AFLP (扩增片段长度多态性)
中图分类号: S 812; Q943　　　　文献标识码: A
Construction of Ggenetic Linkage Map in Lolium multif lorum
DING CHeng-long
1, 2, SHEN Yi-xin
1, GU Hong-ru
2, YUICHI M iu-ra
3
( 1. College of An imal S cience and Tech nology, Nanjin g Agriculture University, Nanjin g, J iangsu province 210095, China;
2. Ins t itute of Anime S cience, J iang su, Jiangsu province Academ y of Agr icultur al Scien ces , Nanjin g 210014, China;
3. In st itute of Forage Crop, J apan Gr as sland Farming and Forage S eed Associat ion, Tochigi 329-2742, Japan)
Abstract: Italian ry eg rass ( L ol ium mult if lor um) is one of the most important w arm season fo rage grasses w ide-
ly cult ivated in the temperate zone of the w orld. and so is it in southern of China. One pseudo-test cr oss full-sib
F 1 population generated for the genet ic analy sis of cytoplasm ic male sterility ( CM S) analy sis, consist ing of
124 individuals, w as used to const ruct a high-density linkage map of Ital ian ryeg rass. M ale and female molecu-
lar-marker linkage maps w er e developed using SSR, AFLP, EST -CAPS, and RGA -CAPS markers, a to tal of
362 marker loci in the female par ent linkage map, consisting o f 240 SSR marker s, 84 AFLP mar kers, 24 EST -
CAPS markers, and 14 RGA-CAPS marker s, w ere made up of seven linkage groups, covered a total length of
776. 4cM. Each l inkage group r anged from 85. 8 to 135. 0 cm w ith an average distance of 2. 14 cm to a neighbor-
ing mar ker. The paler nal linkage map o f seven l inkage gr oups consisted of 376 mar ker lo ci, of w hich 252 were
SSR markers, 82, AFLP markers, 29, EST-CAPS markers, and 13 RGA-CAPS markers, w ith a total map
distance o f 710. 0 cm . T he average distance betw een neighbo ring markers was 1. 89 cm. Compar ed to the link-
age maps of per ennial ryegrass, the present maps show ed much higher density of markers o f mor e even dist ri-
but ion , and w ith moder ate lengths.
Key words: L ol ium multif lorum; Genet ic map; Simple sequence repeat markers ( SSR ) ; A mpl if ied f ragment
leng th po lymo rphism markers( AFLP)
收稿日期: 2006-01-04; 修回日期: 2006-04-05
基金项目: 中日合作项目“饲料作物基因组解析”,日本赛马协会提供资助
作者简介: 丁成龙( 1969-) ,男,汉族,博士,副研究员,从事牧草育种及栽培利用研究,发表研究论文 20余篇, E-mai l: d ingcl@ jaas. ac. cn
第 14 卷　第3 期
　Vol. 14　 No . 3
草　地　学　报
ACTA AGREST IA SINICA
　　　2006 年　 9 月
　Sep.　　 2006
　　遗传连锁图的构建为基因组结构、单基因和多基
因控制的性状的研究提供了方便,对位图基因克隆等
具有重要作用[ 1～3]。黑麦草属( L olium spp. )牧草遗传
连锁图的构建工作同水稻( Ory z a sativa L. )等农作物
相比进展较慢, 有学者利用多年生黑麦草 ( Lolium
per enne L. ) 和多 花 黑麦 草 ( L ol ium multif lorum
Lam. )的种间杂交构建F1 群体和遗传连锁图[ 4] , John
等[ 5]利用 SSR 标记、Ber t 等[ 6]利用 AFLP 标记进行了
多年生黑麦草遗传连锁图的构建。多花黑麦草为自交
不亲和异花授粉植物,通常单个个体的遗传组成为高
度异质,杂种F 1代即发生分离, 因此,可以利用具不同
遗传背景的两个多花黑麦草单株进行杂交,构建F1 群
体并进行分子标记、连锁分析和遗传连锁图构建。
1　材料与方法
1. 1　植物材料
日本育成品种 Waseaoba 细胞质雄性不育个体
11S (母本)和育性恢复个体11F(父本)杂交F 1代群体
(简称CMS 群体) , 群体含124 个个体,全部用于群体
分析。
1. 2　基因组DNA提取
参照Murry [ 7]的方法并稍作改动。将1. 5 g 的叶片
和幼茎在液氮中研磨成粉末,加入10 ml 2% CTAB 提
取液 ( 2% CT AB, 1. 4 mmol / L NaCl, 100 mmol/ L
Tr is-HCl pH8. 0, 20 mmo l/ L EDTA pH8. 0, 1%
PVP-40, 0. 2%
-巯基乙醇) , 混匀置于65℃水浴1 h; 加
等体积氯仿/异戊醇( 19∶1)提取2次, 10000 r/ min 离
心 30 m in; 取上清液加入2/ 3体积异丙醇沉淀DNA,
10000 r / min离心10 min;分别用2 mL 70%和100%酒
精洗涤DNA, 吸干酒精,静置干燥,加400
L TE 缓冲
液( 10 mmo l/ L T ris-HCl, 1 mmol / L EDTA , pH7. 4)
溶解;加入100
L 浓度为5 mmol/ L 的NaCl;混匀后室
温下静置 15 min;加入 Rnase A 使其最终浓度达100

g/ mL, 混匀后 37℃水浴1 h; 用等体积氯仿/异戊醇
( 19∶1)抽提;取上清液,加入1/ 2体积7. 5 mmo l/ L 醋
酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA ; 70%乙醇洗涤沉
淀,静置干燥,加适量双蒸水溶解DNA。
用0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取质量,
DNA 浓度用紫外分光光度计波长 260 nm 测定, 将其
调至100 ng /
L 待用。
1. 3　SSR分析
利用396对引物(由日本畜产草地研究所和日本
畜产种子协会提供,分别经HEX或FAM 荧光标记)对
亲本的基因组DNA 进行PCR 扩增和多态性的检测,
选择在亲本中出现多态性的引物检测F 1群体多态性。
PCR 反应总体积 10
L, 其中 DNA ( 100 ng /
L ) 1. 0

L, 10×buf fer 1. 0
L, dNTP0. 8
L, T ag DNAse
0. 05
L,引物0. 8
L 和水6. 35
L。扩增程序为: 95℃
变性 10 min, 随后进入循环, 94℃变性30 s, 60℃复性
30 s, 72℃延伸30 s,共35个循环,最后72℃延伸7 min
并保持在4℃。6%变性聚丙烯酰胺直板电泳,凝胶长
25 cm ,厚 0. 4 mm, 电泳缓冲液为1×TBE, 电泳电压
400 V,电流14 mA , 2 h。电泳结束后, 凝胶置于RED 扫
描系统中扫描图像,记录具多态性谱带[ 8]。
1. 4　AFLP分析
每个样品总基因组 DNA 250 ng , 限制性内切酶
EcoRI+ M seI( 1. 25 单位/
L)酶切, 反应体系总体积
12. 5
L, 37℃恒温培养 8 h, 70℃10 m in 灭活酶的活
性。酶切后的DNA( 12. 5
L)在T 4 DNA 连接酶的作
用下与接头连接, 25
L 反应体系, 20℃ 8 h,将连接产
物稀释10倍后进行预扩增,采用 E+ X/ M + X 组合,
94℃变性 30 s, 56℃复性60 s, 72℃延长 60 s, 20个循
环。E 代表的共同序列为: 5-GACT GCGTACCAA-
TT C-3 , M 的共同序列为: 5-GAT GAGT CCTCA-
CTAA -3, X 代表A、T、C、G 中某一碱基。预扩增产物
稀释后作为模板, 进行选择性扩增,选择性扩增所用的
引物为E+ XXX/ M + XXX,其中引物E经 IRD700或
IRD800荧光标记。扩增体系循环参数为: 94℃变性30
s, 65℃复性60 s, 72℃延长60 s进行一个循环,以后的
10个循环, 每个循环退火温度降低 1℃, 其余参数相
同。接着进行94℃变性30 s, 56℃复性60 s, 72℃延长60
s,共23个循环[ 9, 10]。
扩增产物加入等体积的缓冲液 ( 98%甲酰胺,
10 mmol/ l EDT A, 0. 025%溴酚蓝, 0. 025%二甲苯
青)。样品经94℃变性5 m in 后立即置于冰上并遮光待
加样。6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果由测序仪
( Long Readir 4200 LI-COR)自动扫描并保存。
1. 5　表达序列标签-酶切扩增多态性序列 ( EST-
CAPS)分析
分别利用多花黑麦草EST(表达序列标签)序列所
设计的ST S 引物 396对(由日本畜产种子协会饲料作
物研究所提供)对CMS 群体的两亲本基因组DNA 进
行PCR 扩增, 扩增条件: 94℃变性 5 min,接着进入循
环,分别为 94℃变性 1 min, 60℃或 65℃复性 1 min,
72℃延长2 min,计40个循环,最后72℃延长4 min 并
224 草　地　学　报 第 14卷
保持在4℃。扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳和EB 染
色检查,选择在双亲中只扩增出单一谱带且大小相同
的PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切,限制性内切
酶分别为 BamHⅠ、BglⅠ、BglⅡ、DraⅠ、HaeⅢ、Hha
Ⅰ、MspⅠ、RsaⅠ、SalⅠ和Eco rⅤ。酶切产物经2. 0%
琼脂糖凝胶电泳, EB染色和紫外灯下检测,最后进行
多态性结果统计。
1. 6　抗病基因类似物-酶切扩增多态性序列( RGA-
CAPS)分析
利用细胞质雄性不育( CM S) F1 群体的两亲本基
因组DNA 对根据多花黑麦草RGA 序列所设计的113
对STS 引物进行筛选, PCR扩增条件同1. 5, 限制性
内切酶分别为识别 4 到 6 碱基的 M seⅠ、AluⅠ、
HpyCH4Ⅳ、ScrFⅠ、Sau96Ⅰ、Hpy188Ⅲ、DdeⅠ、Nla
Ⅳ、HpyCH4Ⅲ、Fnu4HⅠ、Hpy188Ⅰ、AfaⅠ、M spⅠ、
HaeⅢ、HhaⅠ、MboⅠ、HindⅢ、和HinfⅠ。检测后, 用
双亲间存在多态性的引物及其对应的限制性内切酶组
合以同样的方法分析F1群体。
1. 7　数据统计和连锁分析
利用软件JoinM ap3. 0进行多态性数据统计。利用
软件 JoinMap3. 0在杂交模式( CP)下的Haldane[ 11]图
功能进行连锁值计算和分群, 连锁图利用 MapChart
2. 0进行。
2　结果与分析
2. 1　SSR引物筛选与多态性分析
在单亲或双亲中能扩增出清晰扩增谱带的引物数
为358对,占总数的90. 4% ,有些引物的扩增结果难以
正确读取和统计, 仅选取 259对引物(占总数65. 4% )
用于群体分析, 群体分析过程中分离得较好的 240 对
引物(占总数60. 6% )的扩增结果用于分离结果统计。
获得仅母本或父本出现谱带, F1 群体中呈1∶1分
离的标记数分别为109和119个;双亲均出现谱带, 在
F 1代中呈3∶1分离的标记数146个,呈1∶1分离的标
记数34个,其中由引物14-8A (正向5-CGGTT -GAG-
TAGGTT AGGT GT CCAT-3, 反 向 5-CA CAT -
GTCGCAGCGAACGT C-3)扩增所得的SSR 多态性
图谱见图1。
2. 2　AFLP多态性检测
分析32对E+ XXX/ M + XXX AFLP 引物组合,
检测到 454个多态性位点,其中表现为父本或母本出
现谱带并表现为 1∶1的显性标记分别为 165 和173
个。双亲均出带, 并表现为3∶1的分离比例的多态性
位点 85个, 平均每对引物组合产生多态性位点 14. 2
个。进行连锁图构建时发现A FLP 标记具有簇聚现象,
为了简化连锁图, 进行了AFLP 标记的选择和删减, 最
后用于遗传连锁图构建的 AFLP 标记数为 139 个, 其
中由引物对E+ ACC 和M+ TAC 扩增获得的电泳图
谱见图2。
图1　引物 14-8A 扩增的SSR指纹图谱
F ig . 1　SSR fingerprint gener ated by pr imer 14-8A fr om
genome DNA of tw o par ents and a few of F 1 indiv iduals
注: P1和P2分别代表父本和母本, F1表示部分F1 代个体;
箭头所指为多态性谱带
Note: P1 or P2 in cate parents; F1 indicates ind ivid uals of F1;
Arrow indicates polymorph ism
图2　引物对 E+ ACC/M+ TAC扩增的AFLP指纹图谱
注: P1和P2分别代表父本和母本, F1表示部分F1 代个体;
箭头所指为多态性谱带
Note: P1 or P2 in cate parents; F1 indicates ind ivid uals of F1;
Arrow indicates polymorph ism
2. 3　EST-CAPS标记分析
筛选出41对引物在双亲中表现多态性,将其分别
用于F 1群体的多态性检测,检测出41个多态性位点,
其中由引物 p 260 ( AT GGCAT CGT CGT CTT CGT ,
GACCAAGT TGTGT TGGT CCC)扩增双亲和部分F 1
个体 DNA 并经 RsaⅠ酶切后所得的多态性图谱见
图3。
225第 3期 丁成龙等:多花黑麦草遗传连锁图的构建
图3　引物 p260 扩增和RsaⅠ酶切的
EST-CAPS指纹图谱
Fig . 3　EST -CAPS fingerprint amplified by pr imer p260
and dig ested w it h endonuclease MseⅠ
注:M 表示标准DNA; P1和P2分别代表父本和母本,
F1表示部分F1 代个体;箭头所指为多态性谱带
Note: M indicates ladder DNA; P1 or P2 incate parents;
F1 indicates individuals of F1; Arrow in dicates polymorp hism
2. 4　RGA-CAPS标记分析
80对引物在父、母本中能够扩增出单一目标大小
谱带( 300～500 bp) ,将其分别用于F 1群体中,检测到
25 个多态性位点, 其中由引物 RG 088C11-1( CTG-
GACAGT TGAACATCT TT TT C, TT TACCA-
CACTGGT GTAACT CTGG)扩增和M seⅠ酶切后得
到的多态性图谱见图4。
图 4　引物RG088C11-1 扩增和MseⅠ酶切的
RGA-CAPS指纹图谱
F ig . 4　RGA-CAPS fingerprint am plified by pr imer
R G088C11-1 and digested w ith endonuclease MseⅠ
注:M 表示标准DNA; P1和P2分别代表父本和母本,
F1 表示部分F1 代个体; 箭头所指为多态性谱带
Note: M indicates ladder DNA; P1 or P2 incate parents;
F1 indicates individuals of F1; Arrow in dicates polymorp hism
2. 5　高密度连锁图的构建
利用 SSR、AFLP、EST-CAPS、RGA-CAPS 标记
及 Joinmap 3. 0作图软件, 取似然比对数值( LOD值)
为4. 0构建遗传连锁图。由于双亲均处于杂合状态, 且
在F1 发生分离,因此分别以父本和母本中发生分离的
位点分别进行遗传连锁图的构建, 各构建7个连锁群,
分别命名为S1～S7和F1～F7(图5a, 5b)。利用连锁图
中共同的标记将分别由父本和母本分离位点构建的连
锁图建立起一一对应关系, 其中连锁群S1对应于连锁
群F1,连锁群S2对应于连锁群F2,依此类推。
以来自母本的分离位点进行连锁图的构建得
S1～S7共7个连锁群, 包含362个标记,占作图标记数
的88. 3%,标记组成分别为SSR标记240个、AFLP 标
记84个、EST -CAPS 标记24个和RGA-CAPS 标记14
个(表 1) , 覆盖全长 776. 4 cM , 连锁群的长度分别为
95. 0、126. 3、135. 0、89. 0、85. 8、120. 8和124. 5 cM, 其
中最长的为S3, 135 cM ,最短的为S5, 85. 8 cM, 相邻标
记之间的平均遗传距离为2. 14 cM。
以来自父本的分离位点进行作图所得的F1～F7
共 7个连锁群,包含 SSR 标记 252个、AFLP 标记 82
个、EST -CAPS 标记29个和RGA-CAPS标记13个(表
1) ,共376个标记, 占作图标记数的88. 1% ,连锁图全
长 710. 0cM , 7个连锁群的长度分别为 82. 0、118. 1、
113. 8、112. 1、86. 2、117. 3 和80. 5 cM , 相邻标记之间
的平均遗传距离为1. 89 cM。从以上数据可以看出, 无
论是利用父本抑或母本基因组的杂合位点作图, 其连
锁图的总长、标记数量及相邻两标记间的图距差异均
较小, 一定程度上说明本研究中所用的父母本其各基
因位点杂合程度相近。各标记位点在整个连锁图中的
分布相对较均匀,最大的两标记间的图距出现在连锁
图的两端, 分别为18. 0 cM ( S7)和13. 4 cM ( F4) (图5a,
5b)。
表 1　多花黑麦草各遗传连锁群中分子标记组成
T able 1　Marker composition o f g enetic linkage gr oups of it alian r yeg r ass
由母本构建的连锁图
L inkage map const ructed fr om fem ale parent
连锁群编号
Code of link age group
SSR AFLP EST -CAPS RGA-CAPS
由父本构建的连锁图
Lin kage map con st ructed f rom male paren t
连锁群编号
Code of linkage group
SSR AFLP EST -CAPS RGA-CAPS
S1 27 12 4 2 F1 20 10 5 2
S2 38 13 3 3 F2 35 13 5 3
S3 27 12 4 2 F3 31 13 3 2
S4 49 10 4 3 F4 60 7 5 1
S5 21 10 5 2 F5 45 11 2 0
S6 32 12 3 1 F6 28 16 6 1
S7 46 15 1 1 F7 33 12 3 4
合计 Total 240 84 24 14 合计 T otal 252 82 29 13
226 草　地　学　报 第 14卷
227第 3期 丁成龙等:多花黑麦草遗传连锁图的构建
228 草　地　学　报 第 14卷
3　讨　论
3. 1　SSR标记与连锁图构建
由于SSR 标记多态性高且为共显性,易于将单个
性状的SSR图谱同参照图谱进行比较和定位[ 5]。本研
究中利用父本和母本中各自的多态性位点构建不同的
遗传连锁图,可以通过共有的SSR 标记将不同的连锁
群进行一一对应和比较,并同前人所构建的黑麦草属
牧草的遗传连锁群进行比较。Warnke 等[ 4]将多年生黑
麦草的SSR引物应用到高羊茅遗传连锁图的构建, 并
成功地绘制于高羊茅遗传连锁图中, 利用这些共同的
SSR标记可将高羊茅和黑麦草遗传连锁图进行比较,
从而还可进一步对同特定性状紧密连锁的SSR 标记
在高羊茅—黑麦草属间进行比较研究。本研究中的
SSR引物在群体分析中绝大多数表现为单条谱带, 且
为共显性, 这些SSR引物同样可以应用于近缘的多年
生黑麦草和羊茅属牧草的基因组分析。
3. 2　AFLP标记与连锁图的构建
许多研究结果表明, AFLP 标记是随机分布且能
覆盖整个基因组, 可以将有必要进一步分析利用的
AFLP 标记转化为能够通用的RFLP 或STS 标记[ 12]。
亦有研究表明AFLP 标记在遗传图谱上存在簇集现
象[ 4]。为了简化连锁图的复杂性,多数研究者们在遗传
作图时常采用部分AFLP 标记,首先构建出遗传框架
图,然后再将其它分子标记加入其中,使得连锁图趋于
饱和,来避免连锁图中A FLP 标记过于聚集。本研究中
同样采用了此办法, 所得到遗传连锁图谱各标记间的
图距趋于均匀。
3. 3　EST-CAPS 标记、RGA-CAPS 标记效率及应用
前景
表达序列标签( Expressed sequence tags, EST )
是通过基因的表达产物mRNA 反转录 cDNA 的表达
序列片段,其本身即是表达序列。作为遗传标记, EST
比其它标记更能代表表达序列在染色体上的存在。遗
传标记方法的最终目的是将基因定位于并将之按一定
顺序线性排列于染色体上, 利用来源于 cDNA 片段的
EST 作为遗传标记, 可以真实并直接地反映基因在染
色体上的位置,因此有着其它标记方法无法比拟的优
越性。
RGA 在一定程度上同抗病基因间存在直接或间
接关系[ 13, 14] ,研究RGA 在基因组中的分布和演化在一
定程度上可以说明抗病基因的情况。本试验使用了113
对 RGA-ST S 引物,其中80对( 70. 8%)引物能在双亲
中扩增出单一且大小相等的谱带, 通过PCR的扩增和
分别应用18种限制性内切酶酶切, 共得到22个多态性
片断,占扩增引物数的27. 5%,与其它标记技术相比效
率较低,但其操作程序较为简单,所需的DNA量较少,
结果判断较容易, 仍不失为较好的分子标记方法。
3. 4　遗传连锁图的图距
由于F 1群体的种子全部来自同一个亲本,不育株
11S, 使得分别来自父本和母本的多态性构建两个连
锁图成为可能。本研究对分别来自不同亲本的多态性
所构建的两套连锁群其在大小上存在一定差异, 分别
为 776. 4cM 和710. 0cM , 所包含的标记数分别为362
和376个, 连锁图的长度同Warnke[ 4]、Jones [ 5]、Bert [ 6]
等人所报道的多年生黑麦草遗传连锁图的长度692～
930 cM 基本吻合, 而短于 Inoue等人[ 15]的1244. 4cM ,
可能与其以AFLP 标记为主进行连锁图的构建有关,
此外还可能与标记数的多少、所用的群体以及基因型
误差等有关。
另外,在遗传连锁图构建过程中,由父母本位点多
态性所构建连锁图过程中仍有部分标记(分别占总标
记数的11. 7%和11. 9%)不连锁而未能出现在连锁图
中。可以预计,随着标记位点的增多,多花黑麦草遗传
连锁图覆盖的长度会有所增加。
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(责任编辑　张蕴薇)
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《中国农业科学》中、英文版
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