全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(6)：529~533
Journal of Wuhan Botanical Research
CBF3基因过量表达的拟南芥细胞质膜组分的变化
严海燕h。，STEPONKUS P L z
(1．中国科学院武汉植物园，武汉 430074；z．Department ofCrop and Soil Science，Cornel University，Ithaca，NY 14853，USA)
摘 要：通过提取过量表达 CBF3基因和对照的拟南芥[Arabidopsis thaliana L．Heyn．(Columbia)]茎叶的质膜．
分离并分析其脂类成分和蛋白质含量，从中探讨 CBF3对膜脂成分的影响及与抗冷适应的关系。研究结果表明，过
量表达CBF3植株的质膜膜脂总量和膜蛋白总量分别是对照的 227％和 19O％，磷脂为 105％，与冷适应诱导的效
果相似。因此 CBF3表达的变化可能对冷适应过程中质膜组成的改变起重要作用。
关键词：拟南芥；冷适应；抗冻调控因子；CBF3；质膜；膜脂
中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：1000．470X(2004)06．0529—05
Changes of Components in Plasma M embrane of
Arabidopsis Plants oVerexpressed CBF3
YAN Hai．Yan ， STEPoNKUS P L
(1．Wuhan Botanical Garden，The Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430074，Chinal
2．Department of Crop and Soil Science，Cornell University，Ithaca，NY 14853，USA)
Abstract：The function of a cold response regulator gene CBF 3 on membrane composition was
studied．Plasma membrane from transgenic plant Arabidopsis Columbia constitutively expressing
CBF 3 gene and from control was extracted，membrane lipids and proteins were separated for fur—
ther analysis．The results show that total lipids，total proteins and phospholipids of plasma mem—
brane increased in constitutively expressing CBF 3 transgenic plant by 227 ，1 90 for totoal
lipids，and total proteins，by 105．05 for phophoslipids．This effect is similar to that Of cold ac—
climation．indicates that CBF3 induce the changes of the components in plasma membrane during
cold acclimation，and play an important role in this process．
Key words：Arabidopsis thaliana L．Heyn．(Columbia)；Cold acclimation；Cold response regula—
tor；CBF 3；Plasma membrane；M embrane lipids
植物对冻害的抵抗机制使它们能够渡过生存危
机。对植物抗冻适应机制的研究，将为农业生产提供
减轻冻害损失的措施和方案。有多方面的因素影响
植物抗冻性，如膜的稳定性、细胞内渗透性物质的含
量、抗冻蛋白含量等等。近年来，在拟南芥中发现的
CBF／DREB(C—Repeat／Dehydration Response ele—
ment Binding Factors)是诱导一系列抗冻基因表
达、引起多方面抗冻生理反应的一类调控因子。它们
通过作用于启动子的 CRT／DRE，诱导 COR 6、
COR15a、COR47等基因的表达[1]，也引起植株中
可溶性糖、脯氨酸含量的变化，类似于抗冷适应中发
生的变化[2]。CBF／DREB调控途径的成分在其它植
物中也存在[3]。CBF1、CBF3基因的过量表达可诱
导一系列抗冻反应，大大提高植物的抗冻能力[2“]。
其中CBF3的作用更强，能诱导伴随冷适应过程中
出现的多种反应L2]。
收稿日期：2004—05·31。修回日期：2004—06·22。
基金项 目：Personal funding from Dr．Steponkus P L．
作者简介：严海燕(1961一)。女，研究员，博士，现从事植物生理生化、分子生物学方面的研究。本研究在Cornell大学农学院作物与土
壤系低温生理实验室完成。
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53O 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
Uemura等 s 对经过冷适应的拟南芥叶质膜的
脂 成分进 行 了分 析，经过 冷适应 的质 膜 中，PL
(phospho1ipids)含量上升(从 46．8 到 57．1 )同
冬黑麦叶子冷适应过程中磷脂成分的变化不同，
PC (phosphatidylcholine) 和 PE (phosphatidy—
lethanoamine)含量基本没有变化。CER(cerebro—
sides)含量略有 下降(从 7．3 降至 4．3 )，ASG
(acylated sterylglucosides)略有下降(从 3．4 9／6降
至 2．9 )。冷适应后的质膜没有发生 H II相变。
尽管 Gilmour等[2]对 CBF3过量表达的拟南芥
进行了多方面的分析，但对质膜的成分未进行分析。
我们对过量表达 CBF3基因的拟南芥膜脂成分和膜
蛋白含量进行了分析，研究了 CBF3基因在控制质
膜脂类的组成和含量，及其对质膜中蛋白含量的影
响；比较了CBF3基因过量表达的冷适应和非冷适
应植株与对照的异同。
1 材料和方法
1．1 拟南芥种植
采用由CaMV35S启动子控制的CBF3转基因
拟南芥 F36，对照为拟南芥 [Arabidopsis thaliana
L．Heyn．(Columbia)]。F36由 日本 的 Uemura
Matsuo实验室提供，在 Steponkus实验室自交繁殖
了多代，具有稳定的形态特征。作为对照材料、非冷
适应的拟南芥种植于 25℃恒温培养箱中，8 h光周
期 ，土壤表面光强 150 E·m ·s_。。冷适应拟南
芥在常温下萌发后转入 2℃冷室中生长，光周期同
上，土壤表面光强 125 E·m ·s u。。分别取冷处
理后第 7 d、14 d的叶和对照温度下同时播种的拟
南芥叶，用于提取膜蛋白和质膜脂。
1．2 细胞质膜的分离
根据 Uemura等[5]的方法，采用 PEG／dextran
两相分离系统分离。以每克鲜重叶片 4 mL提取液
[0．5 mmol／L 山梨醇，50 mmol／L MOPS／KOH，
pH 7．6，5 mmol／L EDTA，5 mmol／L EGTA，
1．5 (w／v)PVP(Mw 40 000)，0．5 (w／v)脱脂
BSA，1 mmol／L PMSF，4 mmol／L水杨氧肟酸
salicyl hydroxamic acid，2．5 mmol／L偏亚硫酸氢
钾]，在冰上用组织匀浆机(Polytron，Brinkmann)以
中速研磨 30～45 S。匀浆液用 4层纱布过滤，在0"C，
10 000 g离心10 min，上清在100 000 g离心1 h。沉
淀 在 0．25 mol／L 蔗 糖，10 mmol／L KH2PO4／
K HPO 缓冲液(pH 7．8)中，溶解后与前一天制备
好 的 两 相 分 离 系 统 [6．0 w／w PEG 3 350
(Sigma)，6．0 9／5(w／w)dextran T500(Pharmacia)，
0．25 mol／L蔗 糖，30 mmol／L NaC1，10 mmol／L
KH PO ／K HPO 缓冲液，pH 7．8]充分混匀，然后
在 0℃进行两相分离。将上相转移到新的系统再分
离，共计 3次。纯化的上相用含 0．25 mol／L蔗糖和
10 mmol／L MOPS／KOH (pH 7．3)缓冲液稀释后，
在 156 000 g，0℃离心 30 min，弃上清，沉淀即为细
胞质膜。马上用于脂类的提取。质膜的纯度用质膜
的vanadate一敏感的 ATP酶、液泡的硝酸盐敏感的
ATP酶、高尔基体 的 Tritoni X一100刺激 的 UDP
酶、线粒体的 Cytc氧化酶、内质网的 NADH Cytc
还原酶标记酶活性鉴定。蛋白质含量测定用 Brad—
ford L6 的方法 。
1．3 脂类分析
采用 Uemura等[5]的方法。总脂类用异丙醇抽
提，干燥后用 Sep—Pak硅胶柱(Waters)分离出中性
脂、糖脂和磷脂。脂类抽提物溶解于氯仿 ：乙酸
(100：1，v／v)中，转 移到 Sep—Pak硅胶柱上，用
20 mL氯仿 ：乙酸 (100：1，v／v)洗脱 中性 脂，
10 mL丙酮和 1 mL丙酮 ：乙酸(100：1)洗脱糖脂，
7．5 mL甲醇 ；氯仿 ：水(100：50：40，v／v／v)洗
脱磷脂，最后再用 2．25 mL氯仿和 3 mL水彻底洗
脱磷脂。分离的各部分脂类经硅胶薄层层析(TLC)
进一步分离。中性脂分离液为石油醚 ：乙基醚 ：乙
酸 (80：35：1，v／v／v)，糖脂 用氯仿 ：甲醇 ：水
(65：25：4，v／v／v)，磷脂用氯仿 ：甲醇 ：乙酸
(65：25：8，v／v／v)。硅胶板为 0．25 mm厚(Merck，
Darmstadt，Germany)。甾醇的定量以胆固醇为标准
品，采用Zlatkis和Zakm的方法。糖脂的分析以Glc
为标准 品，用 Dubois等L8]的方法 测定。磷脂 以
KH2PO4为标准品，采用 Marinetti L9 的方法测定。
2 结果
2．1 CBF3基因过量表达对细胞质膜蛋白总含量
和膜脂总含量的影响
在未经过冷适应的植株中，转有 CBF3基因的
F36植株细胞膜膜蛋白总含量、膜脂总含量、单位膜
蛋 白的膜脂含量均高于 对照，分别提高 了 90 、
127 9／6和 18 。差异均为极显著，表明CBF3基因在
细胞膜组成方面起关键作用(表 1)。
在对照的拟南芥中，经过冷适应的植株单位鲜
重膜蛋白含量变化不大，差异不显著。处理 14 d后
的结果没有再增加。而未经冷适应的F36的膜脂含
量比经过对照冷适应 7 d的膜脂含量还要高 43 。
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0．042 8± 0．006
0．041 8士0．Ol4
0．042 9士0．016
0．O81 3士0．006
0．061 3士0．014
0．045 7±0．019
0．060 9士 0．006
0．096 7士 0．030
0．O91 1士0．009
0．138 2士0．Ol 7
0．1O2 6士0．013
0．081 5士0．009
1．445 8士0．265
2．58O 6士 1．58O
1．756 9士0．O21
1．7l1 5±0．295
1．719 1士0．344
1．541 1± 0．496
Notes：NA—non acclimated；Acc7days—acclimated 7 days；Acc14days—acclimated 14 days．“一statistic results for
diferences between cold treated samples and the sample of the same strain at one week before．“at F36
NA is the result between NA of F36 and NA of control Columbia．1“l>2．58，has significant difference
at a=O．O1 level；l“l>1．96，has significant difference at d一0．05 level；l“l<1．96，has no significant
difference．
这个结果说明冷适应所造成的质膜蛋白和脂类成分
的变化与 CBF3基因过量表达引起的变化不同
(表 1)。
在F36植株中，经过冷适应的植株细胞膜蛋白
和膜脂含量反而减少，差异均为极显著。膜脂与膜蛋
白的比例几乎没什么变化。没有转CBF3的植株在
经过 7 d的冷冻后的膜蛋白和膜脂含量不再有更明
显的变化，膜脂与膜蛋白的比例反而下降。冷适应
后 7 d各项数据基本达到冷适应的最高值。结果表
明，CaMV35S启动子控制的CBF3的作用达到和
超出了冷适应引起的最高值(表 1)。
2．2 CBF3基因过量表达对细胞质膜中不同类型
脂类含量的影响
未经过冷适应的F36植株和对照脂膜脂类成
分中，F36植株的磷脂(PL)比例高于对照，提高了
5 。甾醇(SG+AsG)的比例低于对照(28 )，差异
均为极显著，变化趋势与 Uemura等[s]1 995年所得
结果一致。说明CBF3基因在抗冷适应中磷脂和甾
醇成分的改变中起重要作用。F36和对照的质膜脑
苷脂的成分差别不大(表 2)。
表 2 质膜总脂的脂类构成
Table 2 Lipids composition in total plasma membrane lipids
Notes：NI 一neutral lipids；PI 一phospholipids；SG—sterylgluc0side(s)；ASG—acylated sterylgluc0sides；CER—cerebro—
sides．U the same as in table 1．
在冷适应处理 7 d后，对照中性脂降低 11．5 ，
甾醇降低 8．78 ，磷脂增加 5．26 ，显著性检验 “
值分析结果差异均为极显著。这与 Uemura等的结
果一致[s]。在冷适应处理 7 d后，脑苷脂增加 17 9／6，
在冷适应处理 14 d后，相对于处理 7 d的下降了
3O ，差异极显著(表 2)。
2．3 CBF3基因过量表达对细胞质膜磷脂各成分
的影响
对未经冷适应的F36和对照质膜磷脂的成分进
行分析，结果表明，F36的PC、PI+PS比例高于对照
(9．2 和3．2 )，差异极显著和显著。PE差异不显
著。PG和PA与对照比有所降低，差异极显著。这表明
CBF3基因在磷脂成分的改变中起一定作用(表 3)。
经过冷适应 7 d的对照和 F36的 PC、PI+PS
均有下降，对照和 F36的 PC分别下降 11 和
20 ，PI+PS分别下降 28 和 1O 。对照和 F36的
PE经过冷适应均有增加，分别为 7 和 12 。上述
各项差异均极显著(表 3)。
他 地 m M M
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532 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
Columbia
NA
Acc7days
Acc14days
F36
NA
Acc7days
Acc14davs
35．24±2．33
31．23± 2．72
31．41±2．09
38．49±1．45
3O．96±2．04
33．6O±4．36
9．47±0．41
6．86±2．2O
7．04±0．96
9．77± 1．40
8．83± 1．45
8．16± 1．17
40．52± 3．6O
45．47± 1．03
44．53± 0．49
5．41± 1．6O
5．90±0．01
5．37±0．36
4．34±0．91
5．12±0．37
5．63±0．08
9．26± 3．00
12．O8±2．04
13．22±3．O1
6．88± 1．54
9．6O± 1．27
8．10± 5．93
Notes：PC—phosphatidylcholine；PI—phosphatidylinositol；PS—phosphatidylserine；PE—phosphatidylethanoamine；PG
phosphatidylglycerol；PA—phosphatidic acid．“一the same as in table 1．Avg．± STD．
3 讨论
Gilmour等[2 的研究表明，CBF3在拟南芥中的
过量表达，诱导脯氨酸、可溶性糖等大量合成，抗冻
能力大大提高。我们的研究揭示了CBF3基因对细
胞膜蛋白含量和膜脂含量的影响。由CaMV35S启
动子控制的CBF3基因的过量表达在很大程度上提
高了单位植物鲜重膜蛋白、膜脂总量的含量以及膜
脂与膜蛋白之比(表 1)。而对照冷适应诱导的植株
单位鲜重膜蛋白含量、膜脂含量以及膜脂与膜蛋白
之比的增加却远小于 CaMV35S控制的 CBF3表达
造成的影响。经过冷适应的CaMV35S控制的表达
CBF3基因的植株单位鲜重膜蛋白和膜脂总量反而
减少，但膜脂与膜蛋白比例变化不稳定。这表明在天
然冷适应过程中，CBF3基因表达调节膜蛋白和膜
脂的合成。同时冷适应过程中，也有降低膜脂和膜
蛋白成分的因素存在。Fowler和ThomashowC ]最
近的研究表明，在冷适应诱导表达的基因中，只有
l2％ 是 CBF调控途径的成员，至少 28 不属于
CBF调控途径。306个冷诱导的基因中，218个基因
是激活调控(up—regulation)，88个基因是抑制调控
(down—regulation)。而且，抑制调控多发生在冷处
理的 24 h以后，这进一步说明了冷适应过程中，质
膜成分变化的复杂性。
Uemura等[5]研究了冷适应过程对拟南芥质膜
脂类组成的影响，结果表明，冷适应后中性脂下降
l7．2 ，甾醇脂类下降了 7．3 mol ，磷脂增加了
10．3 mol 。恒定表达 CBF3基因的植株相应变化
的趋势与冷适应的变化一致，揭示 CBF3基因在抗
冷适应机制中对质膜磷脂和甾醇脂类的变化起重要
作用 。
CaMV35S控制的表达 CBF3的拟南芥植株质
膜磷脂中磷脂酰胆碱 比例略有增加(表 3)，与冷适
应造成的变化不同，说明CBF3对磷脂成分比例的
影响与冷适应的关系不大。
从上述结果来看，CBF3基因产物诱导膜总量
的大量增加，同时诱导膜蛋白的大量合成。因为许多
膜脂合成的酶类分布于膜上，所以这些膜蛋白中很
可能有许多是膜脂合成有关的酶。由于经过冷适应
的 F36膜脂有所下降，表明有降解作用，而对照则
没有这种作用。这表明CBF3也诱导有关的降解酶
合成。CBF3的调控作用有可能是在脂类代谢的某
个总开关处。
膜脂由中性脂、磷脂、甾醇、脑苷脂组成。CBF3
在磷脂和甾醇含量变化的趋势方面与冷适应一致，
表明在这两类脂的合成途径中起激活的作用。然而，
在各种磷脂组分变化中，CBF3诱导的变化却与冷
适应无关。这揭示了CBF3在磷脂合成方面的激活
作用是间接的。
Gilmour等[2]的研究证明了CBF3诱导拟南芥
中脯氨酸、可溶性糖含量及抗冻性的增加，我们的研
究表明，CBF3诱导与抗冷适应一致的细胞膜膜脂
含量的增加及相关组分磷脂、甾醇组成的变化。这个
结果进一步证明了CBF3是一个冷适应过程中关键
的调控因子，在植物抗冻、南方植物北移，换季节种
植等基因改良品种方面具有重要应用价值。
参考文献 ：
[1] Stockinger E J，Gilmour S J，Thomashow M F．
Arabidopsis thaliana CBF 1 encodes an AP2 domain—
containing transcriptional activator that binds tO the
C—repeat／DRE，a cis—acting DNA regulatory ele—
ment that stimulates transcription in response tO
low temperature and water deficit[J]．Proc
Acad Sci．1997。94：1 O35— 1 O40．
2 3 O
9 5 8
2 1 3 ± ± ±
1 5 6
6 9 9
O 3 2
4 4 4
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 6期 严海燕等：CBF3基因过量表达的拟南芥细胞质膜组分的变化 533
[2]
[3]
[4]
[5]
Gilmour S J，Sebolt A M，Salazar M P，Everard J
D，Thomashow M F． Overexpression of the Ara—
bidopsis CBF3 transcriptional activator mimics mul—
tiple biochemical changes associated with cold accli—
mationl[J]．Plant Physiology，2000，124：1 854—
1 865．
Jaglo K R，Kleff S ．Amundsen K L，Zhang X，
Haake V，Zhang J Z，Deits T ，Thomashow M F．
Components of the Arabidopsis C—Repeat／dehydra—
tion·responsive element binding factor cold·response
pathwayare conserved in Brassica napUS and other
plant species[J]．Plant Physiology，2001，127：
910— 917．
Jaglo—Ottosen K R，Gilmour S J，Zarka D G，Scha—
benberger O，Thomashow M F．Arabidopsis CBF1
oVerexpression induces COR genes and enhances
freezing tolerance[J]．Science，1998，280：104—106．
Uemura M ，Joseph R A，Steponkus P I ．Cold accli—
mation of Arabidopsis thaliana—effect on plasma
[6]
[7]
[8]
[9]
[1O]
membrane lipid composition and freeze-induced le—
sions[J]．Plant Physiol，1995，109：15—30．
Bradford M M0L／L．A rapid and sensitive method
of total lipid extraction and purification[J]．Can J
Biochem Physiol，1976，37：911— 917．
Zlatkis A·Zak B．Study of a new cholesterol reagent
[J]．Anal Biochem，1969，29：143—148．
Dubois M，Giles K A，Hamilton J K，Rebers P A，
Smith F．Colorimetric method for determination of
sugars and related substances[J]．Anal Chem，1956。
28：50— 56．
Marinetti G V．Chromatographic separation．identi—
fication and analysis of phosphatides[J]．t，L
RPs，1962，3：1— 12．
Fowler S，Thomashow M F．Arabidopsis transcrip—
tome profiling Indicates that multiple regulatory
pathways are activated during cold acclimation in ad—
dition tO the CBF cold response pathway[J]．The
Plant Cell，2002，14：1 675— 1 690．
维普资讯 http://www.cqvip.com