全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(６): ８０１~８０７
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５￣０８３７􀆰 ２０１５􀆰 ６０８０１
薇菜 ＳＳＲ分子标记的开发及遗传多样性初步探讨
赵 杰１ꎬ 王玢琪１ꎬ 贾 晓１ꎬ 童益琴１ꎬ 何义发２∗ꎬ 葛台明１∗
(１􀆰 中国地质大学(武汉)湿地演化与生态恢复湖北省重点实验室ꎬ 武汉 ４３００７４ꎻ
２. 湖北民族学院林学园艺学院ꎬ 湖北恩施 ４４５０００)
摘　 要: 利用改良 ＦＩＡＳＣＯ法(Ｆａｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＦＬＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＣＯｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ)开发出的 ９对多态性 ＳＳＲ
引物评价了薇菜(Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ.)２个野生居群(庐山和恩施)、 １个栽培居群(恩施)的遗传多样性和
遗传分化水平ꎮ 结果显示ꎬ ９个 ＳＳＲ标记在 ３个薇菜居群中共检测到 ４７ 个等位基因ꎬ 每个 ＳＳＲ 位点的平均等
位基因数为 ５􀆰 ２２２个ꎬ 观测杂合度和期望杂合度分别为 ０􀆰 ０００ ~ ０􀆰 ９４４和 ０􀆰 ５７７ ~ ０􀆰 ８３４ꎬ 香农指数为 ０􀆰 ９６２ ~
１􀆰 ８６０ꎬ 表明各 ＳＳＲ位点多态性较高ꎻ 各居群的平均期望杂合度均大于平均观测杂合度且种内近交系数均为正
值ꎬ 说明 ３个薇菜居群中都存在非随机交配现象ꎻ 对各居群的相关遗传多样性参数分析表明ꎬ 恩施野生居群遗
传多样性最高ꎬ 而其栽培居群最低ꎻ 庐山野生居群与恩施野生居群间遗传分化系数为 ０􀆰 ０９２ꎬ 说明两地野生薇菜
居群的遗传分化程度较低ꎬ ＡＭＯＶＡ分析也表明遗传变异主要存在于野生居群内部ꎮ
关键词: 薇菜ꎻ 遗传多样性ꎻ ＳＳＲꎻ ＦＩＡＳＣＯ
中图分类号: Ｑ７５　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０６￣０８０１￣０７
　 　 　 收稿日期: ２０１５￣０５￣２９ꎬ 退修日期: ２０１５￣０７￣１０ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金重点项目(４０９３０２１０)ꎮ
　 作者简介: 赵杰(１９８９－)ꎬ 男ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为生物化学与分子生物学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｚｊ１９８９８９０６１６＠１２６􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｈｂｍｙｈｙｆ＠ １６３􀆰 ｃｏｍꎻ ｇｅｔｍ＠２６３􀆰 ｎｅｔ)ꎮ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ Ａｓｓｅｓｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ.
ＺＨＡＯ Ｊｉｅ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｂｉｎ￣Ｑｉ１ꎬ ＪＩＡ Ｘｉａｏ１ꎬ ＴＯＮＧ Ｙｉ￣Ｑｉｎ１ꎬ ＨＥ Ｙｉ￣Ｆａ２∗ꎬ ＧＥ Ｔａｉ￣Ｍｉｎｇ１∗
(１. Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｗｅｔｌａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎꎬ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｗｕｈａｎ
４３００７４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓꎬ Ｅｎｓｈｉꎬ Ｈｕｂｅｉ ４４５０００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｎｉｎｅ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＦＩＡＳＣＯ ( Ｆａｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＦＬＰ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＣＯｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ) ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ. ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｗｏ ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
ｆｒｏｍ Ｌｕｓｈａｎ ａｎｄ Ｅｎｓｈｉ ａｎｄ ｏｎｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｅｎｓｈｉ. Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ４７ ａｌｌｅｌｅｓ ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓꎬ ｗｉｔｈ ａ ｍｅａｎ ＮＡ (ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓ) ｏｆ ５􀆰 ２２２. Ｔｈｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ
ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ｗｅｒｅ ０􀆰０００－０􀆰９４４ ａｎｄ ０􀆰５７７－０􀆰８３４ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｔｈｅ Ｓｈａｎｎｏｎ ｉｎｄｅｘ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ０􀆰 ９６２ ｔｏ １􀆰 ８６０. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｉ
ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ. Ｆｏｒ ｅａｃｈ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ｗａｓ
ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｎｏｎ￣ｒａｎｄｏｍ ｍａｔｉｎｇ. Ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓꎬ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｅｎｓｈｉ ｈａｒｂｏｒｅｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ａｂｕｎｄａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ
ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｈａｄ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ. Ｌｏｗ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ (ＦＳＴ ＝ ０􀆰０９２)ꎬ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ＡＭＯＶＡ ａｎａｌｙｓｉｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ.ꎻ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎻ Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔꎻ Ｆａｓｔ Ｉｓｏ￣
ｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＦＬＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＣＯｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ
　 　 紫萁(Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ.)为紫萁科紫
萁属多年生草本蕨类植物ꎬ 主要分布于我国长江流
域以南各省区ꎬ 尤以武陵山区分布较多ꎮ 由于紫萁
嫩叶具有较高的营养价值和一定的药用价值ꎬ 且
富含维生素、 氨基酸和人体新陈代谢必需的多种
微量元素[１] ꎬ 加工成山野菜被人们广泛食用ꎬ 称
为薇菜ꎮ 随着日本、 韩国等国家对其大量进口ꎬ
薇菜的研究和开发利用也愈受关注[２] ꎮ 人工栽培
的薇菜繁殖系数较低[３] ꎬ 目前其主要来源是野生
资源ꎬ 然而自然环境下ꎬ 薇菜的配子体生长周期
长且需要水湿环境ꎬ 自然更新的速度无法满足市
场需求[４] ꎻ 此外ꎬ 由于不合理的开发利用ꎬ 野生
薇菜无法完成其正常的生活周期ꎬ 致使我国薇菜
野生资源面临枯竭的风险ꎬ 应尽快采取措施对薇
菜野生居群进行保护ꎮ 朱英东[５]研究提出ꎬ 薇菜
野生资源的恢复策略为先通过有性繁殖(孢子繁
殖)产生大量幼苗ꎬ 再将幼苗移栽至适宜的野生
环境ꎬ 但由于物种的遗传多样性直接关系到其生
存及发展[６] ꎬ 因此实施薇菜野生资源恢复措施前
应充分了解其居群遗传多样性现状ꎮ 近年来ꎬ 关
于薇菜的研究主要集中在营养成分和经济价值等
方面[１ꎬ７－９] ꎬ 目前尚未见薇菜 ＳＳＲ 分子标记的开
发及其遗传多样性研究的报道ꎮ
ＳＳＲ (Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｒｅｐｅａｔ)分子标记以
其共显性的遗传方式[１０]和高度变异性[１１]等特点被
广泛用于居群遗传多样性分析、 种质资源鉴定和遗
传图谱构建[１２ꎬ１３]ꎮ 为了分析不同地区薇菜居群的
遗传多样性ꎬ 需开发具有较高多态性的 ＳＳＲ 分子
标记ꎬ 本文拟采用改良的 ＦＩＡＳＣＯ (Ｆａｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｂｙ ＡＦＬＰ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＣＯｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ) [１４]技
术开发薇菜的 ＳＳＲ 分子标记ꎬ 并评估庐山和恩施
的 ３个薇菜居群的遗传多样性ꎬ 以期为薇菜资源的
保护和可持续发展提供一定的理论依据ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
对江西庐山和湖北恩施的 ２个野生居群以及栽
培于湖北民族学院内的一个人工薇菜居群(由恩施
薇菜野生居群的孢子繁育而来)进行随机采样ꎬ 且
每居群选择 ３０株个体采集幼嫩叶片(表 １)ꎬ 放入
置有碎冰(低温保存)的保温箱中带回实验室ꎬ 并
于－８０℃保存、 备用ꎮ
表 １　 供试微菜样品
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ
ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
居群编号
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
ｃｏｄｅｓ
来源
Ｌｏｃａｔｉｏｎ
个体数目
Ｎｏ. ｏｆ
ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ
特征
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
居群 １
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ １
庐山 Ｌｕｓｈａｎ
(２９°３４′２１″ Ｎꎬ
１１５°５８′２４″ Ｅ)
３０ 野生Ｗｉｌｄ
居群 ２
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ２
恩施 Ｅｎｓｈｉ
(３０°１６１３" Ｎꎬ
１０９°２８３０" Ｅ)
３０ 野生Ｗｉｌｄ
居群 ３
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ３
恩施 Ｅｎｓｈｉ
(３０°２９′５２″ Ｎꎬ
１０９°４９′４９″ Ｅ)
３０ 栽培Ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 薇菜基因组 ＤＮＡ的提取
采用 ＣＴＡＢ法[１５]并结合异丙醇沉淀提取薇菜
叶片(约 ０􀆰 ５ ｇ)基因组 ＤＮＡꎻ 利用 Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎ￣
ｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ / ２０００Ｃ 分光光度计测定提取
ＤＮＡ的浓度和纯度ꎬ 再通过 １􀆰 ５％琼脂糖凝胶电泳
检测 ＤＮＡ的完整性ꎮ ＤＮＡ 样品于－２０℃保存、 备
用ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 ＳＳＲ分子标记的开发
随机选取一份薇菜个体的基因组 ＤＮＡꎬ 采用
改良的 ＦＩＡＳＣＯ法[１４ꎬ１６]分离其 ＳＳＲ 序列ꎬ 主要实
验步骤包括: ①基因组 ＤＮＡ 的酶切和连接反应同
时进行ꎮ 反应体系为 ２０ μＬꎬ 包含 ２５０ ｎｇ 薇菜基
因组 ＤＮＡ、 ０􀆰 ４ Ｕ ＣｖｉＱＩ 限制性内切酶 (ＮＥＢ)、
１􀆰 ０ μｍｏｌ / Ｌ ＣｖｉＱＩ接头(５′￣ＴＡＧＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ￣
３′/ ５′￣ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣ￣３′)、 ２０ ｍｇ/ μＬ ＢＳＡ、
０􀆰 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＡＴＰ、 ０􀆰１２ Ｕ Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶 ( Ｐｒｏ￣
ｍｅｇａ)和 １ ×ＣｖｉＱＩ Ｂｕｆｆｅｒ３(ＮＥＢ)ꎬ ２５℃条件下温
育１６ ｈꎻ ②反应结束后ꎬ 将连接产物稀释 １０倍ꎬ 并
用含 ＰＩＧ￣ｔａｉｌ的 ＣｖｉＱＩ￣Ｎ 引物对连接产物进行单引
物 ＰＣＲ扩增ꎬ 然后向扩增产物中加入 ０􀆰２５ μｍｏｌ / Ｌ
生物素标记的(ＧＡＴＡ) ６、 (ＡＡＡＧ) ６、 (ＧＡＴ) ８探
针进行杂交ꎬ 杂交条件为: ９４℃变性１ ｍｉｎꎬ 探针
退火 １ ｍｉｎꎬ ７２℃保温 １ ｍｉｎꎻ ③目的片段用链霉
亲和素包被的磁珠富集[１７]后进行第二次 ＰＣＲ 扩
２０８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
增ꎬ 扩增产物经纯化后转入 ＴＯＰ１０ 感受态细胞ꎬ
３０℃恒温培养 １６ ｈ后挑选阳性克隆子送往武汉擎
科创新生物科技有限公司进行测序ꎮ 通过 ＳＳ￣
ＲＨｕｎｔｅｒ １􀆰 ３软件[１８]查找 ＳＳＲ 序列ꎬ 并用 Ｐｒｉｍｅｒ
Ｐｒｅｍｉｅｒ ５􀆰 ０ 软 件 ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ􀆰 ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ.
ｃｏｍ / ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ / )设计 ＳＳＲ 序列的特异性引物
(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 位点多态性的检测
经扩增条件优化并确定设计的 ４２对 ＳＳＲ引物
的最适退火温度后ꎬ 对随机选取的 ２０ 份薇菜个体
基因组 ＤＮＡ进行 ＰＣＲ扩增ꎬ 筛选可稳定扩增的多
态性 ＳＳＲ标记ꎮ ＰＣＲ扩增体系为 １０ μＬꎬ 包含 １ ×
ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ (北京百泰克生物技术有限公司)、
２ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２、 ０􀆰２ ｍｍｏｌ / Ｌ ｄＮＴＰ、 ０􀆰２ μｍｏｌ / Ｌ
的上下游引物、 ０􀆰 ２５ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶(北京百
泰克生物技术有限公司)、 约 ２００ ｎｇ 模板 ＤＮＡꎻ
ＰＣＲ 反应程序为: ９４℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ ９４℃变性
１ ｍｉｎꎬ ４９℃ ~ ６１℃退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延伸 ３０ ｓꎬ 共
３０个循环ꎻ 最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ 所有 ＰＣＲ 产
物经 ６％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染[１９]ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４　 数据分析
依据 ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ (２０ ｂｐ或 ５０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄ￣
ｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒꎬ ＴａＫａＲａ)判读各 ＳＳＲ 位点等位基因
的扩增片段长度ꎬ 若存在某等位基因则记为 １ꎬ 反
之记为 ０ꎬ 并用 Ｅｘｃｅｌ 软件将基因型数据转化为
０ / １ 数据矩阵ꎻ 利用 ＭＩＣＲＯ￣ＣＨＥＣＫＥＲ ２􀆰２􀆰 ３ 软
件检测分型错误[２０]后ꎬ 使用 ＰＯＰＧＥＮＥ １􀆰３１统计
分析软件[２１]对数据进行分析ꎬ 分别计算 ３ 个居群
的等位基因数(ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓꎬ ＮＡ)、 有效等位
基因数(ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓꎬ ＮＥ)、 观测杂
合度(ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬ ＨＯ )、 期望杂合
度( ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬ ＨＥ ) 和香农指数
(Ｓｈａｎｎｏｎ ｉｎｄｅｘꎬ Ｉ )等遗传多样性参数ꎬ 以及居
群内近交系数 ( ｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒ￣
ｐｈｉｓｍ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔꎬ ＦＩＳ )、 居群总近交系数 ( ｔｏｔａｌ
ｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔꎬ ＦＩＴ)、 居群间遗传分化系
数(ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔꎬ ＦＳＴ)和基因
流(ｇｅｎｅ ｆｌｏｗꎬ Ｎｍ＝ ０􀆰２５(１－ ＦＳＴ) / ＦＳＴ [２２ꎬ２３])ꎻ 利
用 Ａｒｌｅｑｕｉｎ ３􀆰 ５软件[２４]对居群进行分子方差分析
(ＡＭＯＶＡ)ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 ＳＳＲ多态性引物的筛选
对随机挑取的 ２００个克隆进行测序ꎬ 共有 １５３
条序列含有目标 ＳＳＲ 序列ꎬ 阳性率为 ７６􀆰 ５％ꎬ 表
明本研究采用改良的 ＦＩＡＳＣＯ 法开发薇菜基因组
ＳＳＲ标记的效率非常高ꎮ
根据引物设计的主要原则[２５]ꎬ 我们共设计了
４２对薇菜 ＳＳＲ 特异性引物ꎬ 并对 ２０ 份薇菜个体
基因组 ＤＮＡ进行了 ＰＣＲ 扩增ꎬ 结果显示有 １０ 对
引物可稳定扩增(图 １)ꎬ 其中 ９ 对具有多态性(图
２ꎬ 表 ２)ꎬ 可用于薇菜居群的遗传多样性分析ꎮ
M
2000 bp
750 bp
250 bp
Ｍ: ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ.
图 １　 ＳＳＲ位点 ＯＪＴ４２的琼脂糖凝胶电泳检测
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＳＳＲ ｌｏｃｕｓ ＯＪＴ４２
M
250 bp
Ｍ: ５０ ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ ｍａｒｋｅｒ.
图 ２　 ＳＳＲ位点 ＯＪＴ３０的聚丙烯酰胺凝胶电泳
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＳＳＲ ｌｏｃｕｓ ＯＪＴ３０
２􀆰 ２　 薇菜居群的遗传多样性分析
采用 ＭＩＣＲＯ￣ＣＨＥＣＫＥＲ ２􀆰２􀆰 ３ 软件对 ＳＳＲ 扩
增片段的分型检测表明ꎬ 未发现由无效等位基因
(ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅｓ)、 影子带 (ｓｔｕｔｔｅｒｓ)等引起的错误ꎮ ９
个微卫星位点在 ３个薇菜居群中扩增的遗传多样性
参数(表 ３)显示ꎬ 共检测到 ４７ 个等位基因ꎬ 其平
均等位基因数为 ５􀆰 ２２２ꎬ 平均有效等位基因数为
３􀆰 ８２２ꎻ 观测杂合度和期望杂合度分别为 ０􀆰 ０００ ~
３０８　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 赵 杰等: 薇菜 ＳＳＲ分子标记的开发及遗传多样性初步探讨
表 ２　 薇菜 ＳＳＲ分子标记
Ｔａｂｌｅ ２　 ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ
位点
Ｌｏｃｕｓ
序列号
ＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.
重复单元
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ
引物序列(５′－３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
目标片段大小
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｉｚｅ
(ｂｐ)
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
(℃)
ＯＪＴ６ ＫＣ９２４７４７ (ＣＡＴ) １１
Ｆ: ＧＧＧＴＣＣＣＣＡＡＡＴＧＴＧＣＴＣ
Ｒ: ＣＧＧＡＡＴＣＣＣＣＡＣＧＡＴＧＴＡＧＴ １７６ ５１
ＯＪＴ７ ＫＣ９２４７４８ (ＣＡＴ) １８
Ｆ: ＧＧＧＴＣＣＣＣＡＡＡＴＧＴＧＣＴＣ
Ｒ: ＣＧＧＡＡＴＣＣＣＣＡＣＧＡＴＧＴＡＧＴ １９１ ５５
ＯＪＴ１５ ＫＣ９２４７４９ (ＴＣＴＴ) ９(ＧＴ) １０
Ｆ: ＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＣ
Ｒ: ＴＣＣＡＣＣＣＡＡＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＡＡＣ ２２７ ５９
ＯＪＴ３０ ＫＣ９２４７５０ (ＡＡＡＧ) ５(ＡＧ) ５
Ｆ: ＣＴＣＴＧＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＴＡＧ
Ｒ: ＣＣＧＣＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＴＴＴＧ ２１９ ６１
ＯＪＴ３１ ＫＣ９２４７５１ (ＴＣ) １２(ＡＣ) １０
Ｆ: ＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＴＣ
Ｒ: ＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＣ １２０ ５２
ＯＪＴ３２ ＫＣ９２４７５２ (ＴＣ) ９(ＣＡ) １１
Ｆ: ＧＧＧＡＴＴＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣ
Ｒ: ＴＴＴＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴ ２２０ ５５
ＯＪＴ３３ ＫＣ９２４７５３ (ＴＧ) １４
Ｆ: ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＡＴ
Ｒ: ＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣ １２２ ５３
ＯＪＴ４０ ＫＣ９６１９５７ (ＣＴＴＴ) ９
Ｆ: ＡＡＣＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡ
Ｒ: ＣＡＣＧＡＣＧＡＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ ２６２ ４９
ＯＪＴ４２ ＫＣ９２４７５５ (ＴＣ) ２２(ＴＣＴＡ) ６
Ｆ: ＡＧＡＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＣＧ
Ｒ: ＧＡＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＴＣＣＴＣ ２３９ ５１
表 ３　 薇菜居群的遗传多样性参数
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｌｏｃｉ
位点
Ｌｏｃｕｓ
等位基
因数
ＮＡ
有效等位
基因数
ＮＥ
观测杂
合度
ＨＯ
期望杂
合度
ＨＥ
香农
指数
Ｉ
ＯＪＴ６ ４ ２.４０４ ０.０００ ０.５８７ ０.９９１
ＯＪＴ７ ５ ４.２２１ ０.０８３ ０.７６８ １.５０７
ＯＪＴ１５ ４ ２.３４３ ０.０９５ ０.５７７ ０.９６２
ＯＪＴ３０ ８ ５.８２９ ０.０１２ ０.８３４ １.８６０
ＯＪＴ３１ ４ ３.０３１ ０.１２５ ０.６７５ １.２０５
ＯＪＴ３２ ４ ３.２３５ ０.０６３ ０.６９６ １.２４４
ＯＪＴ３３ ５ ４.４３５ ０.２５０ ０.７８０ １.５４０
ＯＪＴ４０ ６ ４.６１６ ０.９４４ ０.７８９ １.６３２
ＯＪＴ４２ ７ ４.２８７ ０.１９５ ０.７７２ １.６３５
Ｍｅａｎ ５.２２２ ３.８２２ ０.１９６ ０.７２０ １.３９７
Ｎｏｔｅｓ: ＮＡꎬ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓꎻ ＮＥꎬ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌ￣
ｌｅｌｅｓꎻ ＨＯꎬ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎻ ＨＥꎬ ｅｘｐｅｃｔｅｄ
ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎻ Ｉꎬ Ｓｈａｎｎｏｎ ｉｎｄｅｘ. Ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
０􀆰 ９４４ 和 ０􀆰 ５７７ ~ ０􀆰 ８３４ꎬ 均值分别为 ０􀆰 １９６ 和
０􀆰 ７２０ꎻ 香农指数范围为 ０􀆰 ９６２ ~１􀆰 ８６０ꎬ 均值为
１􀆰 ３９７ꎬ 表明各 ＳＳＲ位点均具有多态性ꎬ 可用于薇
菜居群的遗传多样性分析等研究ꎮ
在 ３个居群中(表 ４)ꎬ 恩施野生薇菜居群(居
群 ２)的平均有效等位基因数(３􀆰 ３０５)和平均期望
杂合度(０􀆰 ６６６)最高ꎬ 但其居群平均近交系数最低
(０􀆰 ５９２)ꎻ 庐山野生薇菜居群(居群 １)的平均有效
等位基因数(３􀆰 １２９)和平均期望杂合度(０􀆰 ６６３)次
之ꎻ 恩施栽培居群(居群 ３)的相关参数均值都较
低ꎬ 说明恩施薇菜野生居群的遗传多样性最高ꎬ 而
恩施薇菜栽培居群遗传多样性最低ꎮ ３个薇菜居群
中ꎬ 期望杂合度均值都大于观测杂合度均值ꎬ 表明
３个群体中均存在非随机交配现象ꎮ
表 ４　 ３个薇菜居群的遗传多样性参数
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ
Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
居群
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
平均有效
等位基因数
Ａｖｅｒａｇｅ
ｏｆ ＮＥ
平均观测
杂合度
Ａｖｅｒａｇｅ
ｏｆ ＨＯ
平均期望
杂合度
Ａｖｅｒａｇｅ
ｏｆ ＨＥ
居群内近
交系数
Ａｖｅｒａｇｅ
ｏｆ ＦＩＳ
居群 １
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ １ ３.１２９ ０.１２０ ０.６６３ ０.８１５
居群 ２
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ２ ３.３０５ ０.２７２ ０.６６６ ０.５９２
居群 ３
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ３ ３.０６４ ０.１９８ ０.６１８ ０.６７３
４０８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
２􀆰 ３　 薇菜居群间遗传分化分析
由表 ５可见ꎬ 居群 １ (庐山野生居群)与居群 ２
(恩施野生居群)间、 居群 ２与居群 ３ (恩施栽培居
群)间的居群总近交系数分别为 ０􀆰 ７７０ 和 ０􀆰 ６５８ꎬ
说明庐山与恩施野生薇菜居群、 恩施野生与栽培薇
菜居群间均存在近交现象ꎮ 居群１与居群２的平
表 ５　 薇菜居群遗传分化分析
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
居群
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
居群内近
交系数
ＦＩＳ
居群总近
交系数
ＦＩＴ
遗传分
化系数
ＦＳＴ
基因流
Ｎｍ
庐山与恩施野生居群
Ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ
Ｌｕｓｈａｎ ａｎｄ Ｅｎｓｈｉ
０.７４６ ０.７７０ ０.０９２ ２.４６８
恩施野生与栽培居群
Ｗｉｌｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｅｎｓｈｉ
０.６３０ ０.６５８ ０.０７５ ３.０８６
Ｎｏｔｅｓ: ＦＩＳꎬ Ｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔꎻ
ＦＩＴꎬ Ｔｏｔａｌ ｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔꎻ ＦＳＴꎬ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒ￣
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔꎻ Ｎｍꎬ ｇｅｎｅ ｆｌｏｗ.
均遗传分化系数 ( ＦＳＴ )为 ０􀆰 ０９２ꎬ 属于中等分化
(０􀆰 ０５ < ＦＳＴ< ０􀆰１５) [２６]ꎬ 说明仅有 ９􀆰 ２％的遗传变
异存在于居群之间ꎬ ９０􀆰 ８％的变异存在于居群内
部ꎬ 表明庐山与恩施的野生薇菜居群存在一定程度
的遗传分化ꎬ 但遗传分化程度较低ꎻ 恩施薇菜野生
居群与栽培居群之间的遗传分化水平也较低(ＦＳＴ均
值为 ０􀆰 ０７５)ꎻ 居群 １ 与居群 ２、 居群 ２ 与居群 ３
间的基因流均值(Ｎｍ)分别为 ２􀆰 ４６８ 和 ３􀆰 ０８６ꎬ 说
明庐山与恩施薇菜野生居群间、 恩施薇菜野生居群
与栽培居群间的历史基因交流频繁ꎮ
　 　 对居群 １与居群 ２、 居群 ２与居群 ３之间的遗
传变异进行的 ＡＭＯＶＡ分析(表 ６)表明ꎬ 庐山与恩
施薇菜野生居群的 １２􀆰 １０％遗传变异存在于居群
间ꎬ ８７􀆰 ９０％存在于居群内ꎬ 说明遗传变异主要来
自于居群内部ꎻ 恩施薇菜野生与栽培居群的遗传变
异也主要来源于居群内部ꎮ
３　 讨论
３􀆰 １　 薇菜居群的遗传多样性分析
ＳＳＲ分子标记具有多态性高、 重复性好以及
呈共显性遗传等优点ꎬ 已被广泛应用于蕨类植物的
遗传学研究中[２７]ꎮ 李磊等[１６]利用改良的 ＦＩＡＳＣＯ
法开发了 ９ 个蜈蚣草(Ｐｔｅｒｉｓ ｖｉｔｔａｔａ) ＳＳＲ 分子标
记ꎬ 且各位点的平均等位基因数为 ４􀆰 ５５６ 个ꎬ 香
农指数值为 ０􀆰 ５００ ~ １􀆰 １４６ (均值 ０􀆰 ７８３)ꎮ Ｗｏｏｄ￣
ｈｅａｄ等[２８]开发了 １０个蹄盖蕨属 Ａｔｈｙｒｉｕｍ ｄｉｓｔｅｎ￣
ｔｉｆｏｌｉｕｍ的 ＥＳＴ￣ＳＳＲ多态性分子标记ꎬ 且各位点的
平均等位基因数为 ４􀆰 ８００个ꎮ 本研究开发的 ９个薇
菜 ＳＳＲ分子标记在 ３个居群中共检测到 ４７个等位
基因ꎬ 各位点的平均等位基因数为 ５􀆰 ２２２ 个ꎬ 香
农指数范围为 ０􀆰 ９６２ ~ １􀆰 ８６０(均值 １􀆰 ３９７)ꎬ 均高
于李磊等[１６]、 Ｗｏｏｄｈｅａｄ 等[２８]开发的 ＳＳＲ 标记ꎬ
表明这 ９对 ＳＳＲ 分子标记具有较好的多态性ꎬ 可
应用于薇菜分子遗传学方面的研究ꎮ
利用开发的 ９ 个 ＳＳＲ 分子标记对庐山薇菜野
生居群、 恩施薇菜野生居群和恩施薇菜栽培居群进
行的遗传多样性评价表明ꎬ ２个薇菜野生居群的期
望杂合度均明显高于观测杂合度ꎬ 说明杂合子缺
失ꎬ 这可能是由于群体内的非随机交配导致的ꎮ 在
蕨类植物世代交替过程中ꎬ 因配子体对水环境的要
表 ６　 薇菜居群分子方差分析
Ｔａｂｌｅ ６　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｎｃｅ (ＡＭＯＶＡ) ｆｏｒ Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
变异来源
Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ
自由度
ｄ.ｆ.
离差平方和
Ｓｕｍ ｏｆ ｓｑｕａｒｅｓ
ｄｅｖｉａｔｉｏｎ
方差分量
Ｖａｒｉａｎｃｅ
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
方差分量比率(％)
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ
ｖａｒｉａｔｉｏｎ
显著性
Ｐ
庐山与恩施野生居群 Ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｌｕｓｈａｎ ａｎｄ Ｅｎｓｈｉ
居群间 Ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ １ ５８.０６７ １.５５８ １２.１０ < ０.００１
居群内 Ｗｉｔｈｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ５８ ６５６.６００ １１.３２１ ８７.９０ < ０.００１
恩施野生与栽培居群 Ｗｉｌｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｅｎｓｈｉ
居群间 Ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ １ ６６.１００ １.８０９ １３.２５ < ０.００１
居群内 Ｗｉｔｈｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ５８ ６８６.９３３ １１.８４４ ８６.７５ < ０.００１
５０８　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 赵 杰等: 薇菜 ＳＳＲ分子标记的开发及遗传多样性初步探讨
求较高ꎬ 多通过自体受精的方式产生孢子体ꎬ 从而
导致了蕨类植物群体近交程度较高ꎬ 群体中杂合子
比例偏低[２７]ꎮ 本研究中ꎬ 居群内近交系数均为正
值ꎬ 证实了非随机交配现象的存在ꎬ 同样这也在蜈
蚣草群体多样性分析中得到了验证[１６]ꎮ
与庐山和恩施的 ２个野生居群相比ꎬ 恩施薇菜
栽培居群遗传多样性较低ꎬ 这可能是由于人工栽培
过程对薇菜进行了性状选择所导致的ꎬ 因此我们应
采取适当的措施ꎬ 在更大范围内采集野生种质ꎬ 以
丰富和恢复栽培群体的遗传基础ꎬ 避免人工驯化的
过程中发生种质退化ꎮ
３􀆰 ２　 不同薇菜居群遗传分化分析
本研究中的 ２个薇菜野生居群之间的遗传分化
较小ꎬ Ｆ ￣统计量的分析显示两居群间的遗传分化
系数为 ０􀆰 ０９２ꎬ ＡＭＯＶＡ 分析结果也表明 １２􀆰 １０％
的遗传变异存在于居群间ꎮ 此外ꎬ Ｆ ￣统计量和
ＡＭＯＶＡ分析均显示ꎬ 恩施的薇菜野生居群与栽培
居群间的遗传分化较小ꎬ 这可能是由于栽培居群的
来源是野生居群所导致ꎮ
虽然地理隔离是造成居群遗传分化的重要因
素ꎬ 但蕨类植物以孢子繁殖ꎬ 并借助空气进行传
播ꎬ 虽促进了不同居群间的基因交流[２７ꎬ２９]ꎬ 同时
也可能是导致不同居群间遗传分化较小的原因ꎮ
居群间遗传分化较小的现象在蕨类植物中较为
常见ꎬ 如荷叶铁线蕨(Ａｄｉａｎｔｕｍ ｒｅｎｉｆｏｒｍｅ ｖａｒ.
ｓｉｎｅｎｓｅ) [３０] 、 广西蜈蚣蕨(Ｐｔｅｒｉｓ ｖｉｔｔａｔａ) [３１]、 华
中铁角蕨 ( Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｓａｒｅｌｉｉ) [３２] 和披针莲座蕨
(Ａｎｇｉｏｐｔｅｒｉｓ ｃａｕｄａｔｉｆｏｒｍｉｓ) [３３]等ꎬ 其中对荷叶铁
线蕨自然居群的遗传多样性研究发现ꎬ ９８􀆰 ５１％的
遗传变异存在于居群内部ꎬ 居群间的遗传分化程度
较低ꎮ
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(责任编辑: 刘艳玲)
７０８　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 赵 杰等: 薇菜 ＳＳＲ分子标记的开发及遗传多样性初步探讨