全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(5)：380~384
Journal ol Wuhan Botanical Research
花青素合成基因bzl和 bz2在莲藕染色体上的定位
刁 英 一，刘静宇 ，周明全 ，胡中立h。’
(1．武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室，武汉 430072，
2．渝西学院生命科学系，重庆永川 402168；3．武汉大学莲藕中心，武汉 430072)
摘 要 ：Bronze l(bz1)是编码 UDP葡萄糖类黄酮葡糖基转移酶 (UFGT)的基因，UFGT是种子糊粉层中的花青
素生物合成酶。Bronze 2(bz2)是另一种花青素生物合成基因，与类黄酮的酰化、糖基化、转运、沉积等有关。以生物
素标记的重组质粒 pUC19中含有玉米 bzl和 bz2基因作为探针，与莲藕(Nelumbo nucifera L．)的有丝分裂染色体
标本进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)。结果显示，bzl和bz2基因分别位于莲藕的第2
和第 4号染色体长臂上 ，与着丝粒的相对距离分别为 79 和 67 。这是首次提供莲藕染色体上的FISH杂交信息，
从而为增加莲藕染色体组中的遗传标记和建立遗传图谱奠定基础。
关键词；莲藕(Nelumbo nucifera L．)；bzl基因；bz2基因；荧光原位杂交(FISH)，定位
中图分类号：Q343；$645．1 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2004)05—0380—05
Chrom osomal Localization
Genes bzl，
0f Anth0cyanin Biosynthetic
bz2 in Lotus
DIAO Ying ’。，LIU Jing—Yu ，ZHOU Ming—Quan。’，HU Zhong—Li ’。’
(1．Key Laboratory of MOE yor Plant Developmental Biology，Wuhan University．Wuhan 430072，Chinal
2．Department of Life Science，West Chongqing University，Yongchuan Chongqing 4021 68，China；
3．Lotus Research Center，Wuhan University，Wuhan 430072，China)
Abstract：Both bronze 1(bzj)and bronze 2(bz2)are anthocyanin biosynthetic genes，and related
to development of aleuronic layers of maize seeds．The bz l gene encodes UDP glucose flavonoid
glucosyl—transferase(UFGT)，an anthocyanin biosynthetic enzyme in the aleuronic layer of the
seed，which modifies purple aleurone and plant color to pale or reddish brown，anthers yellow—flu—
orescence．Bronze 2 is another anthocyanin biosynthetic gene，its potential function is reflavonoid
acylation，glycosylation transport or deposition．Using maize bz l and bz 2 gene inserted into
pUC19 labeled by the biotin as the probes respectively，bzl and bz2 genes have been assigned to
metaphase chromosome of lotus(Nelumbo nucifera L．)by fluorescence in situ hybridization
(FISH)．The red hybridization signals indicated the bz j gene and bz 2 gene on homologous chro—
mosome 2 and chromosome 4，respectively．The percent distances from the centromere are 79
and 67 ，respectively．The current studies would advance the addition of genetic markers and the
construction of genetic map in lotus．
Key words：Lotus(Nelumbo nucifera L．)；Bronze j gene；Bronze 2 gene；FISH (fluorescence in
situ hybridization)；Localization
莲藕(Nelumbo nucifera L．)为睡莲科莲属多年 生大型水生草本植物 ，原产中国和印度，历史悠久，
收稿日期：2003—12—29，修回日期：2004—05—21。
基金项目：国家科技攻关项目(2002BA546C)；湖北省科技攻关重大项目(2002AA205A)，武汉市科技攻关重点项目(20022005132)。
作者简介：刁英(1978一)，女，在读硕士生，从事植物分子细胞遗传学与植物转基因研究。
通讯作者(Author for correspondence．E—mail：huzhongli@whu．edu．en，loyjzx@whu．edu．on)。
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第 5期 刁 英等 ：花青素合成基因bzl和 bz2在莲藕染色体上的定位 381
种质资源丰富 。它可供观赏、食用及药用，在全国
广泛分布并且是长江流域的一种重要的水生经济植
物，具有很高的经济开发潜力。
花青素属类黄酮物质的一种，在植物界广泛分
布，是植物主要的水溶性色素之一。据初步统计，有
27个科，72个属的植物含花青素。花青素作为一种天
然的食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有重要
的营养和药理作用[2]。莲藕中含有许多酚类物质，其
中藕头的总酚含量占13．37 ，藕皮占1O．61 [3]。目
前针对莲藕的花青素正进行大量的研究，有望开发
出一系列有市场潜力的医药保健产品[4 ]。Bronze 1
和 Bronze 2是与种子的糊粉层发育相关的花青素
生物合成基因。Bronze 1，编码 UDP葡萄糖类黄酮
葡糖基转移酶(UFGT)，这是种子糊粉层中的花青
素生物合成酶，可以使紫色糊粉层和植物变成白色
或微红褐色，花粉囊具有黄色荧光[6]。Bronze 2是另
一 种花青素生物合成基因，在玉米中编码 bz2产物，
与类黄酮的酰化、糖基化、转运、沉积等有关，执行花
青素生物合成的最后一步，导致红和紫色素在玉米
组织液泡中的沉积，也有人证实有关液泡转移的谷
胱甘肽 S一转移酶是 由bz2编码的[7]。本研究应用
FISH技术将玉米的花青素基因bzl和 bz2定位在
莲藕的染色体上，旨在检测该基因在莲藕基因组及
染色体组中的存在及其分布特点，为开发莲藕中花
青素提供遗传学依据。
1 材料和方法
1．1 供试探针
Bzl，bz2克隆到载体 pUC19，由美国密苏里大
学Prof．Coe提供，其大小分别为1 500 bp和300 bp，
酶切位点为 pstl。质粒的转化、提取、插入片段的酶
切鉴定和回收等参照 Sambrook等 的方法。
1．2 实验材料
武汉大学早藕(Nelumbo nucifera)，主要供食
用，为武汉大学莲藕中心选育的藕莲品种。
1．3 中期染色体的制备
参照陈瑞阳等[9 的方法稍加改进。在三、四月
份，待藕节间长出 1～2 cm 的白色须根时，取其 1～
2 mm的根尖，用固定液(甲醇：乙酸 3：1)固定过夜，
用双蒸水充分洗净根尖，2．5 的果胶酶及纤维素酶
1：1混合 28℃下酶解 4～5 h，加水终止酶解，轻轻
水洗 2～3次，将白色的伸长区去掉，只留下乳 白色
的部分，然后用吸管轻轻吹打，使溶液变成乳白色的
悬液，3 600～4 000 r／min离 L-5 min，轻轻搅散，每
张片子上滴 1滴悬液，迅速在酒精灯上通过 2次，使
载玻片上出现小雨点现象即可。一20~C储存备用。
1．4 探针标记与纯化
采用随机引物法进行标记，生物素标记物为 Bio一
11一d UTP。随机引物标记体系及反应时间如下(在冰
上加样)：4 L Bio一11一d UTP(O．35 mmol／L)，4 pL
5×标记缓冲液，2 L d NTP标记混合液(1 mmol／L
dATP，dCTP，dGTP)，1U Klenow 酶，1 L质粒
DNA，2 gL BSA(O．4 mmol／L)，9 L H2O。
先将模板DNA 100~C变性 2 min，立即放冰上，
依次加入混合物，混匀后短暂瞬间离心，于 37 C温
浴过 夜，加 2 L标 记 反 应 终 止 液 (0．5 mol／L
EDTA，pH 8．O)终止反应并纯化备用。具体步骤详
见 Promega公司的随机引物标记试剂盒说明书。
1．5 荧光原位杂交(FIsH)
参,~Jong的方法[1o]略加修改，具体为：将制好的
片子65℃烤30 min，RNA酶(O．1mg／mL)37℃处理
30 min，用 2×SSC(O．3 mol／L氯化钠0．03 mol／L
柠檬酸钠混合缓冲液)洗 3×5 min，然后用胃蛋白
酶 (5 gg／mL)37℃处理 15 min，用 2×SSC洗 3×
5 min，1 的福尔马林处理 10 min，用 2×SSC洗
3×5 min，70 、95 和 100 梯 度 酒 精 脱 水 (各
2 min)，干燥。用随机引物法标记含 bzl，bz2基因片
段的质粒作为探针，配成杂交液 (杂交液为 25 L
2O 硫酸葡聚糖 ，6 L探针，18 L 5O 甲酰胺与
50 mmol／L磷酸缓冲液的混合溶液)，50 gL／片 ，
80~C共变性2．5 min，然后 37℃杂交 48 h。
2O 的 甲酰胺 (用 2×SSC稀 释 )42℃处理
3× 5 min，依次用 2×SSC和 1×TN (O．1 mol／L
Tris-HC1，0．15 mol／L NaC1缓 冲液)洗，然 后用
100 gL／片 TNB (TN+0．5 blocking)37℃处理
30 min，接着：①用链抗亲和素一Cy3(Strepavidin—
Cy3)稀释 液 (每 100 gL TNB缓 冲液 加 0．4 L
Strepavidin—Cy3)50 gL／片，37℃处理 1 h，1×TN
洗 3次；②加生物素化链抗亲和素(Biotinylated—an—
ti—streptavidin)稀释液(每 100 gL TNB缓冲液加
0．8 L Biotinylated—anti—streptavidin原液)，50 L／片，
37℃处理 1 h，1×TN洗 3次；③加链抗亲和素一Cy3
稀释液，50 gL／片，37"C处理 1 h，重复步骤②和⑧依
次用 1×TN和 2×SSC洗，梯度酒精脱水，干燥。观
察时，载玻片用 1 gg／mL DAPI复染。制片在Olym—
pus BX60荧光显微镜下观察。利用 Sensys CCD
1400E系统和 V++软件合成图象，Photoshop软件
处理图片。
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第 22鞋
A红也信号 为 kj整 在莲 辩 2号 色悼上的朵交信号，lI红色情 为 基 n 盘幅幕 一I 色
悼上的杂文信号 ；C 红 色信 点为 6 』堆 在莲帮问期控十竹 交庸号 D 红色信号点为 0基 在琏
司期愤中的杂文信号
A The rcd hybr【dIz lion a15 indle~t d 1he =』z llE【，n hf～ 10 m1s chromo⋯ c l；B The red hyb⋯idiz
1⋯ ‘ k indlcat d the ：2 gene‘m homolo~o．s ch⋯ 1 c)n1c 4．c The red hvb⋯i li atlun signak indlc~ted
lhe ： enPininterhpasc n~olei；D The red hybndl Tion 5 Ennls LI dlca ￡dthe 6z2 Meneinmterhpasc⋯ lei
图 1 花青素基因(6=』．6zj)在莲藕上的 FISII定位结果
F g I Th⋯ ts of chromoson~ loealzati n oflotusk1 aJ d 2 cncs bv FISII
2 结果与讨论
FISH定位结果见图 1．染乜体用 DAPI染成监
色．信号点为红色 本文中莲藕育丝分裂中{I【j染色体
核型分析 王宁珠等文献为依槲 ．即根据染色体
的卞日对长度束识别符条染色体 探针 k 和 k2各
在一对同源染包体上显示出信号 k1的杂交信号
出现在第 2染包体的长臂上，可 看到『刮源染色体
对、两蛆衅染色单体均有信号(凹1：A) k2的杂交
信号存第4号染色体上【罔1：B) l叫时．在间期棱中
也能现察到 4个信号 电(图 ]：C，D)。我们测量了信
号点到着丝粒百分距离即信号 甑巾心到着丝粒的距
离与后号点所 染色体背长度的比值，结 见丧1
表 1 花青素基因(6z，，bz2 在莲藕上的
FISH定位结果分析
Table 1 R⋯ l1s dnalvsIs f)f ： ：0 t s a~signed
0u lOl⋯ ch 一 ⋯ 1es}1v FISH
由于愤物细咆与动物细胞不『iv]，其原生质外有
甚细胞壁．用一般的方法很啦将堪壁破坏掉 椭物
常用的巾期染色体制什方法 ：委肯两种．·种由
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第 5期 刁 英等：花青索合成基因bzl和 bz2在莲藕染色体上的定位 383
压片法，一种为酶解法，另外对于具有小染色体的植
物还有滴片法，我们对几种方法都进行了尝试。结果
发现，由于莲藕的染色体之间大小差异比较大，但染
色体整体偏小，应该属于小染色体。因此对根尖没有
进行前处理，而是洗净后直接固定，同时采用了酶解
火焰干燥法结合滴片法。这种方法比较简便，并且由
于火焰干燥和固定液的蒸发使载玻片上细胞质和细
胞壁的碎片去除比较干净，背景比较干净，同一分裂
相的染色体比较集中，染色体丢失现象少于其他方
法。用这种方法制作的片子比较适合用来做荧光原
位杂交实验。
FISH在染色体上可以进行重复序列的定位，
而且检出效率比较高，但是在植物中进行单或低拷
贝检测的报道比较少，普遍报道的低拷贝序列定位
的灵敏度在 10 kb范围，作为探针单基因检出的基
因大小在 1 kb左右，杂交信号的检出率也在 10 ～
20 左右[1引。从实验结果可以看出，bzl和 bz2的杂
交检出率在 10 左右。Gustafson等[1。]以0．7 kb的
单拷贝 DNA序列作探针，检出率只有 6 左右。我
们的检出率比他们略微高一点。这 2个基因在玉米
上的检出率为 30 9，6以上[1‘。，高于在莲藕上的检出
率。一般来讲 ，同源性越强，检出率越高Ds]。bzl的检
出率大于 bz2，这可能是因为 bzl的长度大于 bz2，
因为探针长度越长，与靶 DNA结合的机会越多，结
合的荧光分子越多，检出的可能性越高。同时，我们
注意到在间期核中信号点的出现频率要高于在中期
染色体上的出现频率，这是因为间期核中染色质呈
弥散状态，DNA纤维为松散状态，利于探针与其同
源序列杂交及信号的检出。2个基因均来自玉米，而
通过荧光原位杂交可以在莲藕的染色体上观察到信
号点，说明莲藕和玉米的这 2个基因具有同源性，这
也可能反映了一种普遍存在的在进化上比较保守的
花青素序列。已经证实，bzl基因在胚胎组织中的表
达依赖于 C1和 R的等位基因 R ，这些基因与
myb原癌基因和 myc—like基因具有同源性[1引，myb
的识别序列 (TAACTG)也在玉米 bzl基因的启动
子中发现[1 。可见这一基因不仅与花青素生成有
关 ，还有可能也参与发育调控。
我们还观察到在姐妹染色单体上同时检出双点
的概率较低，大部分是单点，这也与许多曾经报道过
的单低拷贝的 FISH结果类似。这可能是杂交信号
受到染色体内部空间构型动态变化的干扰，而常常
出现部分阴性杂交信号现象(即指同源染色体之一
无信号或姊妹染色单体之一无信号现象)[ ]。也有
可能是因为植物细胞中存在细胞壁遗留一些碎片影
响探针的渗入，而且低拷 贝序列检测 FISH信号太
弱，通常难以辨别真正的信号(由特异杂交的探针产
生)和背景信号(由探针或检测试剂非特异结合产
生)。
花青素在眼科学[1。]及治疗各种血液循环失调
疾病 z。。、炎症[z 等方面有疗效。由于花青素和相关
黄酮物质具抗氧化特性 ，许多文章争先报道它们在
减少冠心病方面的作用[。引。目前针对莲房原花青素
的抗氧化作用[23,24]进行的研究表明，其可能具有护
肝作用。由于花青素在莲藕里的含量比较高 ，因此研
究开发莲藕中的花青素具有很高价值。本研究定位
这 2个基因，一方面旨在为莲藕也存在该基因的同
源序列提供依据 ，增加莲藕染色体上的遗传标记以
便获得有关莲藕染色体及基因组信息，从而有助于
在细胞和分子水平上对莲藕进行系统的研究；另一
方面也为进一步开发应用莲藕的花青素提供帮助。
致谢 ：感谢本实验室宋运淳教授，李宗芸博士 ，余朝文博
士和熊志勇博士提供宝贵的研究资料和研究材料。
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