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Analysis of the Chemical Constituents of Hypericum hubeiense by HPLC/DAD/ESI-MS

湖北小连翘中化学成分的高效液相色谱与电喷雾离子化质谱联用分析



全 文 :武汉植物学研究 2008,26(1):87~90
Journal of Wuhan Botanical Research
湖北小连翘中化学成分的高效液相色谱与
电喷雾离子化质谱联用分析
白洁 ,王冬梅 ,杨得坡
(1.中山大学药学院,广州 510080;2.清华大学化学系,北京 100084)
摘 要:湖北小连翘(Hypericum hubeiense L.H.Wu et D.P.Yang)是 2004年在我国发现的一个金丝桃属(Hyper/一
cum)植物(藤黄科)新种。利用高效液相色谱与质谱联用技术对该植物中主要化学成分进行了分离分析,初步鉴
定出金丝桃素类、黄酮类等12种化学成分。同时,以金丝桃素为外标,采用HPLC法在590 nm波长下测定了金丝
桃素类成分的含量。
关键词:湖北小连翘;金丝桃素类化合物;黄酮类化合物;高效液相色谱与电喷雾离子化质谱联用
中图分类号:Q949.95;Q946.8 文献标识码:A 文章编号:1000—470x(2008)01.0087.04
Analysis of the Chemical Constituents of Hypericum hubeiense
by HPLC/DAD/ESI.M S
BAI Jie ,WANG Dong—Mei ,YANG De—Po
(1.School ofPharmaceutical Sciences,Sun Yat—sen University,Guangzhou 510080,China;
2.Chemical Department ofTsinghua University,Beijing 100084,China)
Abstract:Hypericum hubeiense L.H.Wu et D.P.Yang is a new species of Hypericum(Clusiaceae)
distributing in China.The qualitative and quantitative analysis of the chemical constituents in the
hydroalcoholic extract of H.hubeierise was performed by using HPLC/DAD/ESI—MS.12 main constituents
were identified or tentatively identifed.The contents of hypericins in the hydroalcoholic extract of
H.hubeiense were measured by HPLC analysis monitored at 590 nm using synthetic hypericin as the exter-
nal standard compound.
Key words:Hypericum hubeiense;Hypericins;Flavonoids;High performance liquid chromatography/
Electrospray ionization—mass spectrometry
湖北小连翘(Hypericum hubeiense L.H.Wu et D.
P.Yang)系藤黄科 (Clusiaceae)金丝桃属 (Hyperi—
cum)植物,是 2004年由中山大学药学院生药学与
天然药物化学实验室吴立宏等首次在我国湖北省巴
东县发现并命名的新种 j¨,有关湖北小连翘化学成
分方面的研究尚未见报道。液相色谱与质谱联用技
术应用于金丝桃属植物化学成分的分析鉴定的报道
较多,其中主要集中在贯叶连翘( pelforatum L.)
的化学成分分析上 j。鉴于同属植物往往具有相
似的化学成分,本研究利用 HPLC/DAD/ESI—MS对
湖北小连翘中的化学成分进行了分析鉴定,并对其
中的主要成分萘骈二蒽酮类(金丝桃素类)成分金
丝桃素(Hypericin)和伪金丝桃素(Pseudohypericin)
进行了含量测定。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
湖北小连翘(Hypericum hubeiense L.H.Wu et D.
P.Yang)样品采于湖北巴东县,于盛花期采集植物
地上部分,阴干后备用。样品经中山大学药学院杨
得坡教授鉴定,为藤黄科金丝桃属植物湖北小连翘,
模式标本存于中山大学生命科学学院生物博物馆。
金丝桃素由本实验室经半合成制备纯化得到,
经 UV、MS、NMR、IR进行了结构确认,纯度大于
99.6%(HPLC),;芦丁(Rutin)、绿原酸 (Chlorogenic
acid)购自Sigma公司;槲皮素(Quercitrin)购自Acros
公司;金丝桃苷(Hyperoside)购自Merck公司;HPLC
分析用甲醇、乙腈 (美国Tedia公司,色谱纯);冰乙
收稿13期:2007—05—15,修回13期:2007—09—17。
基金项目:国家自然科学基金资助项 目(30470188)。
作者简介:白洁(1976一),女,博士,从事天然产物的药学研究。杨得坡,博士,教授,博士生导师。
} 通讯作者(E—mail:lssydp@mail.sysu.edu.cn)。
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88 武 汉 植 物 学 研 究 第 26卷
酸、磷酸和三乙胺(科密欧,天津,色谱纯);双蒸水
为本实验室自制。
1.2 仪器和设备
Finnigan LCQⅢDECA XP高效液相色谱.质谱
联用仪(美国Thermo Quest Finnigan公司):HPLC系
统,P4000四元泵,UV 6000LP二极管阵列检测器
(DAD),电喷雾电离 ESI接 口。Waters高效液相色
谱仪(美国Waters公司):600E型四元梯度泵,2487
型 UV检测器。
1.3 湖北小连翘醇提取物的制备
湖北小连翘样品粉碎成粗粉(约 20~4O目),
称取 500 g于玻璃缸中加入 3 L 90%的乙醇避光浸
提 3次,每次浸提约 20 h,搅拌 ,过滤,合并滤液,
40~(2以下减压浓缩除去溶剂,冷冻干燥,得到提取
物,提取率为9.94%,避光冷藏,备用。
1.4 样品溶液的制备
精密称取湖北小连翘醇提物约 30 mg,置于
10 mL容量瓶中,加入90%甲醇超声使其充分溶解,
并定容至刻度。0.45 m微孔滤膜过滤后,进行
HPLC-MS分析及含量测定。
1.5 定性分析——瑚)LC/DAD/ESI-MS分析条件
液相色谱条件:色谱柱 Nucleodur C (250 mrn×
4.6 mm,5 m)(美国Macherey-Nagel公司);流动
相:A相为水 :甲醇 :乙酸(94.8:5:0.2,三乙胺调
pH值至4.50),B相为甲醇,c相为乙腈。流动相梯
度洗脱程序见表 1。进样量:20 IxL,流速0.8 mL·
m l’n ~
。 DAD波长扫描范围200~700 nm。
质谱条件:电喷雾电离(ESI)采用负离子模
式;毛细管电压 24 V,毛细管温度 350~(2,喷雾电
压 4.5 kV,鞘气流速 60 mL·min一,质荷比扫描范
围 m/z 100~700。
表 1 流动相线性梯度洗脱程序
Table 1 Linear solvent gradient program for HPLC analysis
注:A,水 :甲醇 :乙酸(94.8:5:0.2,三乙胺调 pH值至4.50);
B,甲醇;c,乙腈。
Notes:A,water:methanol:acetic acid(94.8:5:0.2,adjusted pH
of the solvent mixture to 4.50 by using triethylamine);B,met-
han ol;C,acetonitrile.
1.6 金丝桃素类成分的含量测定
按照参考文献[2]的方法,对湖北小连翘醇提
物中金丝桃素和伪金丝桃素进行了含量测定。
(1)液相色谱 条件 Nova-Pak色谱柱 C
(150 mm×3.9 mm,5 m)(美国Waters公司);流
动相:等度洗脱,A:B:C=45:45:10,其中A相为
水 :甲醇 :磷酸(94.9:5:0.1,三乙胺调 pH值至
4.50);B相为甲醇;C相为乙腈;检测波长:590 nm,
流速:1.0 mL·min一。
(2)金丝桃素对照品溶液的制备 精密称取金
丝桃素13.6 mg于100 mL容量瓶中,以90%的甲醇
超声溶解定容至刻度。
(3)金丝桃素标准曲线的测定 精密吸取金丝
桃素对照品溶液(0.136 mg/mL)5 mL于 50 mL容
量瓶中,以甲醇定容至刻度,从中分别精密吸取 1、
2、4、6、8、10 mL于 10 mL容量瓶中,甲醇定容。每
个浓度重复进样 3次,计算峰面积与浓度的回归
方程。
(4)方法学考察
精密度:取金丝桃素对照品溶液重复进样 5次,
计算峰面积 RSD。
稳定性:取金丝桃素对照品溶液,于 0、4、8、12、
24 h分别进样分析,计算峰面积的RSD。
重现性:取湖北小连翘醇提物 5份,按 1.4项下
所述方法制成供试样品溶液,进样分析,测定金丝桃
素含量的RSD。
加样回收率:取贯叶连翘醇提物3份,各加入对
照品溶液(O.136 mg/mE)5 mL,按 1.4项下所述方
法制成供试溶液,进样分析,测定金丝桃素含量,计
算平均回收率及 RSD。
(5)醇提物中金丝桃素类成分的含量测定 按
照1.4项下所述制备醇提物样品溶液,在上述液相
色谱条件下进行含量测定分析。伪金丝桃素由于缺
少化学对照品,其含量测定结果是以金丝桃素的标
准曲线来计算的。
2 结果与分析
2.1 湖北小连翘醇提物中主要化学成分的液-质联
用定性分析
湖北小连翘醇提物在 254 nm及 590 nm处的
HPLC色谱图及各色谱峰对应的uV和 ESI-MS数据
分别见图 1和表2。各个色谱峰的纯度,通过对各色
谱峰在不同峰位处的MS数据以及200~700 nm波长
范围内的uV吸收光谱图进行检查,确定均为单峰。
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第l期 白洁等:湖北小连翘中化学成分的高效液相色谱与电喷雾离子化质谱联用分析 89
590nm


枷 /200 400 600
.?
L ■
O 1O 30 40 50
Time(min)
图 1 湖北小连翘醇提物的 HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of the extract of Hypericum
hubeie, e detected at 254 nm and 590 nm
表 2 湖北小连翘醇提物各主要化学成分的
HPLC/DAD/ESI-MS数据
Table 2 MS and UV spectra data obtained from the
HPLC/DAD/ESI-MS analysis of the hydroalcoholic extract of
H.hubeiense
罄 c化om poun ~V最hm大ax(吸nm收)波长
所示化合物为仅根据 UV和ESI—MS数据初步推足的结构。
Tentatively identified only by the UV and ESI—MS spectra.
在湖dtd,连翘醇提物的 HPLC色谱图中,峰 1
和峰2的准分子离子[M—H]一为m/z 353,紫外最大
吸收波长相似,通过比较对照品的 HPLC保留时间
以及质谱数据,并参考文献[3],可以推测峰 1、峰 2
为同分异构体,分别为绿原酸(Chlorogenic acid)和
隐绿原酸(Cryptochlorogenic acid)。峰 3和峰 4的
[M—H]一分别为m/z 421和447,Jirgenliemk等 报
道,贯叶连翘在使用 RP—C。 柱以及相似流动相系统
的 HPLC条 件下,在对应 的保 留时 间处鉴定 出
Magniferin和 Isoorientin,由此我们初步认为峰 3和
峰 4分别为上述 两种成分。峰 5、峰 6、峰 8的
[M—H]一准分子离子分别为 m/z 609、463和 301,
通过与对照品比较,鉴定出峰5、峰6和峰 8分别为
芦丁 (Rutin)、金 丝桃苷 (Hyperoside)和槲 皮素
(Quercetin)。峰7的准分子离子峰[M—H]一为 m/z
447,碎片离子为m/z 301,说明失去了一个质量数为
146的戊糖碎片,紫外吸收图谱与峰6相似,结合文
献[3,4]推测其为槲皮苷(Quercitrin)。峰9和峰 10
的准分子离子峰[M—H]一同为 m/z 537,且两峰的紫
外最大吸收峰均为268 nm和328 nm,与化合物 Bia—
pigenin一致。根据文献[3,4],同属植物贯叶连翘
在与此相似的HPLC色谱条件下,相同的出峰顺序
和相对应的保留时间的数据,初步推测图 1中峰 9
为双芹菜素(I3,I8一Biapigenin),而峰 10为其同分
异 构 体 阿 曼 托 黄 酮 (Amentoflavone,I3’,II8一
Biapigenin)。
从图 1可见,峰 11和峰 12有相似的紫外吸收
光谱特征,在590 nm附近有最大吸收峰,ESI—MS的
质谱图中[M—H]一分别为 m/z 519和503,通过与金
丝桃素对照品比较,并参考文献[5]报道,鉴定峰 12
为金丝桃素(Hypericin),而峰11则是多了一个甲基
的伪金丝桃素(Pseud0hypericin)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第26卷
2.2 醇提物中金丝桃素类成分的含量测定
在前述条件下进行金丝桃素类成分含量测定的
方法学考察,精密度、稳定性、重现性考察中所测得
的相应色谱峰或 金丝桃素含量 的 RSD分 别为
0.46%、2.90% 和 1.32%;平 均 加 样 回收 率 为
96.7%,RSD 为 3.35%。金 丝 桃 素浓 度 ( )在
1.36~13.6 mg/mL范围内与峰面积(Y)的线性关
系良好 ,回归方程为:Y=(1E+O8) 一73127,r=
0.9998。以上结 果表明该方法符合含量测定 的
要求。
对湖北小连翘醇提取物中的金丝桃素和伪金丝
桃素进行含量测定的结果显示,金丝桃素的含量为
3.7%,伪金 丝桃素 的含量 为 1.2% (以金 丝桃
素计)。
3 结论
金丝桃素类 、黄酮类和酚酸类化合物均具有羟
基等官能团,ESI源电离条件下,易失去质子而产生
负离子,获得较好的质谱信号,因此本研究对湖北小
连翘醇提物中金丝桃素类、黄酮类和酚酸类化合物
的定性分析采用了 HPLC/ESI(一)一MS检测方式,鉴
定或推测出12种化合物,并对其中的金丝桃素和伪
金丝桃素进行了含量测定,所得研究结果可为湖北
小连翘这一植物新资源的进一步开发利用提供重要
的参考。
参考文献:
[1] 吴立宏,杨得坡,王发松,张宏达.国产金丝桃属(藤黄科)新
植物[J].植物分类学报,2004,42:73—78.
[2] 杨得坡 ,甘 良春 ,王冬梅.贯叶连翘薄膜片中金丝桃素和金丝
桃素类化合物的HPLC和 uV测定[J].中国医药工业杂志,
2004,35:548—550.
[3] Jtlrgenliemk G,Nahrstedt A.Phenolic compounds from Hyper/cum
perforatum[J]. 口Med,2002,66:88—91.
[4] Brolis M,Gabetta B,Fuzati N,Pace R,Pan~fi F,Peterlongo F.1一
dentification by hish·-performance liquid chromatography·-diode ar-
ray detection-·nla$s spectrometry and quantification by hish·-per-
formanee liquid chromatography—UV absorbance detection of active
constituents ofHypericumperforatum[J].J Chromatogr A,1998,
845:9—16.
[5] Piperopoulos G,Lotz R,Wixforth A,schmie『er T,Zeler K—P.De—
termination of naphthodianthrones in plant extracts from Hypericum
perforatum L.by liquid chromatography—electrospray mass spcc—
trome~[J].,ChromatogrB,1997,695:309—316.
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