全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(1)：24～28
Journa／of Wuhan Botanical Research
欧洲黑杨 MARs的分离克隆及序列分析
王瑶，黄慧珍，张 勇，杨宝玉，陈士云
(中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071)
摘 要：为获得林木植物核基质附着区(MARs)序列，诱导欧洲黑杨(Populus nigra)愈伤组织并制备悬浮细胞，裂
解释放细胞核，除去非 MARs的游离 DNA片段，得到核基质。碱性缓冲液分离残留DNA与结合蛋白，回收并克隆
残留DNA，测序后得到两个具有 MARs序列特征的DNA片段 A7和 A23。序列特征分析结果表明它们都含有
MARs的特征基元，通过与其他已发表的MARs序列比较，认为是从杨树中分离到的两个 MARs片段，并预测了其
功能。该研究是首次从木本植物获得 MARs序列。
关键词：核基质附着区(MARs)；欧洲黑杨(Populus nigra)；分离；序列分析
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2007)01-0024-05
Isolation and Sequence Analysis of MARs from Populus nigra
W ANG Yao。 HUANG Hui—Zhen，ZHANG Yong，YANG Bao—Yu，CHEN Shi-Yun’
(Wulmn Institute ofVirology，The Chinese Academy ofS !，l( ，Wuhan 430071，China)
Abstract：In order to obtain matrix atachment regions(MARs)from woody plants，calli ofPopulus nigra
were induced from young leaves，and suspension cultured cels were prepared from the cali an d used as
starting materials for MARs isolation．The nuclei were released after digestion of the cels with pectinase
an d celulase，an d nuclear matrixes were obtained after removal of the non—MARs segments．Separation of
residual DNA and proteins were further performed by employing a high saline bufer，an d the residual
DNA was recovered an d cloned．Two DNA fragments named A7 and A23 with typical MARs characteris—
tics were obtained．Sequence analysis showed that both of the two isolated DNA fragments have the cha—
racteristic motifs of MARs．Comparison with other known MARs sequences suggested that these two frag—
ments were two new MARs isolated from Populus，and their functions were also predicted．To our know—
ledge，this is the first report of MARs isolated from a woody plant．
Key words：MARs；Populus nigra；Isolation；Sequence analysis
核基质附着区(matrix atachment regions，MARs)
是真核生物染色质中与核基质或核骨架特异结合的
DNA序列，能有效提高转基因表达水平和遗传稳定
性u J，提高转化率和降低表达差异 J，抑制转基因
沉默 。目前有关 MARs的研究仍有许多问题亟待
解决，突出表现在同一 MAR序列在不同植物或不
同MAR序列在同一植物可能产生不同甚至矛盾的
研究结果 J。解决这些问题有赖于从不同植物来
源分离得到新的 MARs序列，深人认识其结构组成
和作用机制，并最终得到重组的高效 MARs调控元
件用于转基因研究。近年来先后有报道从大豆、水
稻、拟南芥、烟草、玉米、高梁等植物分离得到 MARs
序列 J，但尚无从木本植物分离 MARs序列的报道。
本研究采用高盐和内切酶处理相结合的方法，
首次从木本植物欧洲黑杨(Populus凡 口)分离得到
两条 MARs序列，并与其他已报道的序列进行了基
元特征比较分析。
1 材料与方法
1．1 材料
欧洲黑杨(Populus nigra)无菌苗为本实验室保
存。蛋白酶 K、果胶酶购 自Merck公司；纤维素酶
(Onozuka R一10)购 自 Duchefa公 司；Pereol购 自
Amersham Phamarcia公司。限制性 内切酶、碱性磷
酸酶(CIAP)、T4连接酶均购 自TaKaRa公司；DNA
凝胶回收试剂盒购 自 Omega公司；精胺、亚精胺、
IPTG、X—gal购自Sigma公司；其它化学试剂均为国
产分析纯。
收稿 13期 ：2006-07-06，修回13期：2006-09-26。
基金项 目：国家 自然科学基金青年基金项目(30200222)资助。
作者简介 ：王瑶(1972一)，女，汉族，博士，副研究员，主要从事分子生物学研究(E-mai：ywang@wh．iov．cn)。
· 通讯作者(E-mail：sychen@wh．iov．cn)。
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第 1期 王 瑶等：欧洲黑杨 MARs的分离克隆及序列分析
1．2 杨村悬浮培养细胞的获得
取欧洲黑杨无菌苗幼嫩叶片，在固体培养基
(MS+0．1 mg／L 2，4一D)中26~C黑暗诱导愈伤组织
挑选疏 松的愈 伤组织 转移到液体培养基 中，于
26c、200 r／min摇床黑暗培养获得悬浮细胞，细胞
生长至对数期(约 7 d)继代一次
1．3 细胞核的分离
参照文献[6]的方法加以改进。取适量对数期
悬浮细胞，离心，细胞沉淀用0．2％果胶酶及2％纤
维素酶室温温和振荡 l h破坏细胞壁，破壁后的
细胞重 悬 于 GMC (30％ 甘 油，400 retool／L蔗 糖 ，
20 rmnol／L MES pH 5．8，l0 mmol／L KCI．10 mmol／L
CaCI ，0．2 mmol／LPMSF)中，匀浆释放细胞核；将粗
核液先后通过 100目和400目筛过滤。离心管中注
人60％的 Pertoil，上层轻轻铺上35％ Percol，最后
加粗核液于梯度最上层，Perco1一蔗糖密度梯度离
心，12000 r／rain 20 rain，纯化的细胞核分布在中问
相 吸取核层液体，用 GMC洗涤除去Percol，将细
胞核悬浮于保存液 (50％甘油，20 mmol／L MES
pH 5．8．10mmol／L KCI，】0mmol／L CaC12)中，每管
分装 100～200“L，一8O℃保存备用。
1．4 细胞核镜检
采用吕氏碱性美蓝染色法。将吕氏美蓝0．3 g
溶解于 3O mL 95％乙醇中，与 100 mL 0．O1％ KOH
溶液混匀 取少量制备的细咆核液滴加于载玻片
上，将涂片在火焰上固定，滴加染液染色 1～3 rain，
水洗，待干，镜检。
1．5 核基质的制备
参照文献[7]的方法进行。解冻储存 的细胞
核，用 2 mol／L NaCI高盐 溶液于 冰上作用 10～
20 min，除去组蛋白及可溶性蛋白，得到基因组 DNA
与核基质蛋白的结合体．EcoR I 37℃消化2～3 h，
其间温和搅动，除去非 MARs的 DNA片段，离心得
到核基质蛋白与 MARs的结合体即核基质。
1．6 MARs片段的分离与克隆
将用 EcoRI处理 的 核基 质沉 淀 悬浮 于 含
50 r~mlol／L Tfis—HC1(pH 7．6)、10 mmol／L EDTA和
1％ SDS的碱性缓冲液中，用等体积酚 ：氯仿分别抽
提以去除蛋白，水相加入冷乙醇沉淀与核基质结合
的 DNA。1％琼脂糖凝胶电泳．回收300～4000 bp
的 DNA片段+克隆到 pUCI9载体的EcoR I位点，转
化大肠杆菌 DH5cL，用蓝 白斑筛选阳性克隆进行酶
切鉴定 ．选取酶切图谱不同的克隆测序
1．7 序 列分析及 比对
DNA序列相似性搜索采用 NCBI的 Blast程序
进行。使用不同算法的 MARs预测软 件 MARWiz
(htep：∥Wnh~-．fumresoft．or#MAR—Wiz／)和 MAR—
SCAN(htp：／／bioweb．pasteur．fr／seqana}／interfaces／
rflars~at．hml1)以及序列分析软件 MatInspectc．r(h[．
【p：∥ ．genomatLx．de／cgi·bin／matinspeetor—pro[／)
进行序列鉴定和特征分析 用 于功能 已证实的
MARs序列比较采用软件 S／MARt Database(htp：
f smandb．b[oinf．med uni—goetingen．de／cgi—bin／
SMARtDB／)。
2 结果与分析
2．1 分离制备细胞核及核基质
将分离到的细胞核用吕氏碱性美蓝染色，镜检
结果显示裸露的细胞核近似圆形或椭圆形 ，外表毛
糙．呈鸟窝状(网1：A)。从图 1：B可以看出除了细
胞核外 ，还有一些细小的杂质，这些杂质是破碎的细
胞器 这些细胞碎片的存在．会降低 MARs制备过
程中的限制性内切酶的酶切效率
：
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● 穗圄—■■■■_
’ 、 渭■霸 ■■—■●
■■■
图 1 从 欧洲黑杨悬浮细胞分禽到的细胞核
(A，x100；B，X 201
Fig．1 Nuclei isolaled from the suspensien
ceUs ofPop rdt~ n／gra
2．2 MARs片段的分离及克隆
1％琼脂糖凝胶电泳分析结果(圈2)表明，与核
基质共同分离得到的随机DNA片段大小在100 bp至
9 kb之间，因大部分MARs片段一般在300～4000 bp
之间，而且考虑到 DNA操作的可靠性．切胶回收位
于300—4OOO bp的 DNA片段，并克隆到 pUC19载
体的EcoR【位点。平板上得到的阳性重组克隆用
EcoR I单酶切进行筛选鉴定．见图3。从图3中可以
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武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
1．2：MARs：M DNA marker
圈 2 MARs的分级分离
Fig 2 Cradual separation of MARs
l一6：Difervm e[on~t 7：pUC19 v~ tor；M：DNA marker
图 3 部 分克 隆子 的酶切鉴定
Fig 3 Identifcation of clones by enzyme restriction
看出，克隆到 pUCI9载体中的随机MARs DNA片段
的大小约在600 bp至3 kb之间，而且酶切图谱差异
比较大，说明克隆到的是不同的片段 经酶切鉴定，
共啼选到92个连接外源片段的阳性克隆子．初步建
立了欧洲黑杨部分 MARs序列文库 ，说明采用我们
的方法分离木本植物的MARs序列是可行的。
2．3 序列测定及生物信息学分析
随机挑选两个克隆子A7和 A23涮序。测序结
果表明，所得片段大小分别为 884 hp和 882 bp，在
GenBank中用Blast进行核苷酸序列相似性检索，未
发现与其具有显著相似性的DNA序列，克隆得到的
MARs序列 A7和A23已经在GenBank登录，登录号
分别为：DQ005950和 DQ005951
使用不 同算法 的 MARs预测软 件 MARWiz
(MARFINDER)和 MARSCAN对 A7和 A23序列进
行功能预测，结果表明它们均具有 MARs功能，具有
MARs的典型序列特征：如 AT含量分别为 61．2％
和72．3％；含有MARs的郝分特征基元如90％ A．T
box，A—box，T—box；拓扑异构酶 Ⅱ识别位点；自主复
制序列(ARS，attonomously replicating sequences)；碱
基非配对区(BUR．base unpaifng region)；MAR识别
序列(MRS．．~L4R recognition sequence)；复制起始点
(ORI．origin of replication)；弯曲 DNA序列(curved
DNA motifs)等 。详细序列特征见表 1。
表1 欧洲黑杨A7和 A23的序列特征殛与不同植物来源的MARs序列比较分析
Table 1 Properties 0fA7 and A23 from P nigra and cetml3~．rison with MARs from diferant D1
名称
Nm e
植
P
物
la
来
nl~ 气辩 A +T) 9 0％ A -个bo xl-个bo)x H(-十bo xA个RS， ㈩ORI B个UR M千I~．S
l^7
2^3
RB7
S／M1
S／MIl
H83．MAR
PC—MAR
A1m 一
5MAR
杨树
P印 nfgm
杨树
Popt~ nfg陌
烟 草
Nicc~ ⅡbⅡcLlm
烟草
N ， kⅡ肌
烟 草
M 2dk a m
l搬草
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水稻
[ ～ saliva
水稻
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水稻
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玉米
玉米
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拟南芥
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$h2-3MAR 禳
Ala-5MAR lor
Bx7-SMAR m ‘西帆
Phs-5MAR 如
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·SeqIence8 of each ofthe motifs aIe given below folowed by the number ofmismatches alowed in the searches．90％ A_T—box=w20(2 mismat—
che8)：A—box=从 TAAAY从 A(2 mismatches)；T—box=，兀W nT r(1 mismatch)；ARS=唧 Y^R咖 ；TopoI：G耵 WAYA1T_
NATNNR(果蝇)或RNYNNCNNGYNGKTNYNY(脊椎动物)；BUR=A^TATATrr和AATAVY；MItS=T^wAw NNAwwRTA Nw—
WG(fIlUMRSwith2mismatchesbutmust endinG)orTAWAWWW+A TA^ NN rwG(1 mismatch butmust endinG)；ORI=ATI．A or
K zk or K k．
2．4 不同植物来源 MARs的序列特征比较
采用 S／MARt Database软件，对 目前已经报道
并证实功能的植物 MARs的序列特征进行比较，结
果(表 1)发现，所有 MARs的 AT含量均在 6o％以
上，其中 A+T含量是表 明 MARs与核基质结合能
力的一个指标，从烟草、拟南芥和菜豆中分别分离的
S／MI、S／MI、ATB2-5MAR 和 Phs-5MAR其 (A +
T)％含量都较高，与之相对应，这些 MARs与核基
质的结合能力也都很强，(A+T)％含量最低的来源
于水稻的 S~-5MAR(60．2％)结合能力则 比较弱，
表明高 A+T含量对于植物 MARs是必需的。但并
非所有分离的植物 MARs都含有 MAR识别序列
MRS，说明该基元并非植物 MARs所必需，因此采用
MRS作为唯一标准预测MARs的软件 MARSCAN错
漏率较高，只适合作为 MARs预测 的辅助软件。
Michalowski等 通过对分离到的烟草 MARs特征
分析以及结合力的推算等理论分析，认为90％ A—T
box与MARs对核骨架的体外结合能力相关性最
高，MAR识别序列以及复制起始点的相关性次之，
而序列中拓扑异构酶 II的数 目则几乎与 MARs的
结合能力没有相关性。所有这些都是基于理论上的
推测，实际的结合能力则需要将其克隆到植物表达
载体并转化植物后才能确定，毕竟体外的结合能力
和体内对转基因表达的作用并不一定成正比 ]。
关于这两个序列对转基因表达的作用研究正在进行
中。
3 讨论
核基质附着区是广泛存在于真核生物染色质中
与核基质特异结合的富含 AT非编码序列。MARs
通过与核基质的结合使染色质形成独立的环状结
构，参与调控基因的转录和表达，在提高转基因表达
水平 J、抑制转基因沉默 训¨等方面起着重要 的作
用。MARs通常含有 A—box，T-box，拓扑异构酶 Ⅱ识
别位点，自主复 制序列 (ARS)，碱基 非配对 区
(BUR)等特征基元-8 J，这些特征基元序列是通过生
物信息学方法发现和鉴别新的 MAR序列的基础。
MARs的分离通常有3种方法，从植物核基质
中直接分离，依据已知序列 PCR扩增和在已知基因
的两侧克隆¨¨ 。本研究采用改 良的高盐方法从木
本模式植物欧洲黑杨悬浮细胞中分离并构建了部分
随机MARs文库，随机挑选的2个克隆子A7和A23
测序，结果表明二者都具有 MARs的序列特征，为获
得其它木本植物的 MARs序列提供 了参考方法。
A7和 A23相比较大小相当，但 AT含量差异较大，
所含特征基元的数 目差异明显，比如 T—box、ARS 、
TopoI、弯曲DNA序列等，这暗示它们在调节基因表
达的功能上也可能不同。我们对不同植物来源的功
能确定的MARs序列特征进行 比较，结果同样表明
不同植物均含有特征差别明显的多种 MARs，暗示
不同 MARs可能具有不同的功能，这可能就是文献
报道的不同MARs对转基因表达的调节作用不同的
原因之一。
近几年从各种植物如豌豆、大豆、水稻、拟南芥、
烟草、玉米、高粱分离出了 MARs片段，但关于木本
植物 MARs的研究尚没有报道。MARs对提高转基
因的稳定、高效表达作用已得到证实。我们从烟草
分离的MARs序列也证明具有提高转基因表达水平
的功能 。由于树木生长周期长，而且常采用无性
繁殖方式，本研究获得的 MARs序列将有可能提高
木本植物外源基因表达水平，使外源基因能在几十
年的生长期中保持表达稳定，不仅为深入了解其作
0 0 0 1 0
4 ：。 7 8
∞ 加
7 M 7 5 6
3 1 1 1 1
s! n 儿
4 2 7 8 2
1 5 1
m 8 H 2
3 8 1 4
∞ =2
l 1 1 3 2 =合 勰 ∞
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用机制提供了新的材料和调控元件，也可以用于转
基因树木外源基因的长期、稳定、高效表达，在林木
． ．
基因工程育种领域具有理论与现实意义。分离的杨
树 Mars序列体外结合以及对转基因表达水平的影
响正在研究中。
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