全 文 ：武汉植物学研 究 2006，24(2)：167～170
gourm~ of Wahan Botanical Research
泽苔草交配系统的 RAPD分析
董贞荣，陈进明，王青锋
(武汉大学生命科学学院植物系统学与进化生物学研究室 。武汉 430072)
摘 要：利用 RAPD显性标记位点对泽苔草(Caldesia parnassifolia)湖南茶陵湖里居群进行 了交配系统研究。采用
1O个家系共 240个子代样品测定了该居群花粉库基因频率、固定指数(F)、多位点异交率 (t )和单位点异交率
(t。)。结果显示该居群异交率处于较高的水平(t ：1．008)，多位点异交率与单位点异交率差异不显著(t 一t，=
一 0．021)，固定指数(，)的估计值小于0(F =一0．200)，表明该居群双亲近交不明显，而以异交为主。这可能是受
居群密度、传粉者的活动能力等因素影响的结果。
关键词：泽苔草；交配系统 ；异交率；克隆植物；RAPD
中图分类号 ：Q948 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2006)02-0167-04
RAPD Analysis for Mating System in Caldesia parnassifolia
DONG Zhen-Rong，CHEN Jin-Ming，WANG Qing—Feng
(Laboratory ofPlant Systernatics and Evolutionary Biology。Colege of Sciences，Wuhan Univers／ty，Wulum 430072，China)
Abstract：Outcrossing rate in an open—polinated breeding population(Huh population，Chaling，Hunan
Province)of Ca／des／a parnassifolia was estimated by the dominant RAPD makers using 10 open—polhnated
progeny arays of 24 individuals．The muhilocus outcrossing rate(t )was 1．008 and the single—locus
outcrossing rate(t，)was 1．028．The multiloeus outcrossing rate did not signifcantly difer from the sin—
gle—locus outcrosing rate(t 一t，= 一0．021)．The fixation index(F)was一0．200．The estimates of
t ，t。and F utilizing windows version of MLTR program clearly indicate that outcrossing is predominant in
the C．parnassifol／a open—polinated breeding population．This is possibly influenced by factors such as
plant density，the adaptability of pollinator and SO OPt．
Key words：Caldesia parnassifol／a；Mating system；Outcrossing rate；Clonal plant；RAPDs
导致植物濒危的因素很多，居群的生殖生物学
特点(包括生殖方式：有性、无性或兼性 ；交配系统：
自交或异交；传粉和受精；生殖能力；种子散布方式
等)是原因之一⋯。交配系统(mating system)是包
括某生物有机体中那些控制着配子如何结合以形成
合子的所有属性 J。作为连接两个有性世代之间
的桥梁，它也决定了后代群体的基因型分布和种群
动态，了解交配系统成为研究居群水平基因传递以
至进化机制与过程的前提-3 J。研究交配系统对探
讨物种的濒危机制有着重要的意义。
泽苔草(Caldesia parnas~olm)属于泽泻科(A1．
ismataceae)泽苔草属(Caldesia Par1．)，是多年生挺
水草本植物。泽苔草繁育系统同时具有有性繁殖
(自交或异交均能产生种子)和无性繁殖(花序上的
珠芽脱落后能形成新的植株)。尽管文献记载该种
分布于我国黑龙江、内蒙古、江苏、云南等地 ]，但
目前考察认为，泽苔草在中国可能仅存在一个 自然
居群，位于湖南省茶陵县湖里沼泽。对泽苔草的研
究也主要集中在形态学、细胞学、传粉生物学等方
面 ，而从 DNA水平上研究泽苔草的交配系统还
未见报道。
异交率(outcrossing rate)是交配系统的特征参
数-8 J。国内以往对异交率的估测主要是以等位酶
为主，由于等位酶本身是编码区，受环境选择压影响
较大，不易发生变异 ，对于多样性较低的物种，尤其
是对于高度克隆植物居群很可能缺乏用于研究交配
系统的酶位点上的变异-9 J。因此，有必要选择更具
变异性的 DNA水平上的分子标记。20世纪 80年
代以来，随着基于 PCR技术的分子标记的发展和应
用，显性标记如RAPD、ISSR和 AFLP等标记成功地
应用于植物交配系统参数的研究中[】。。”】。笔者通
过应用RAPD技术分析泽苔草的交配系统，旨在为
收稿日期：2005-07-08，修回日期 ：2006一Ol—l6。
基金项目：国家重点基础研究发展规划(973)项 目(G2000046805)资助；国家自然科学基金资助项目(30370098)。
作者简介：董贞荣(1974一)，男，在职硕士生，在三峡大学护理学院从事遗传学教学和研究工作。
·通讯作者(Author for correspondence．E-mall：qfl whu．edu．cn)。
维普资讯 http://www.cqvip.com
l68 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
深入研究其濒危机制奠定基础。
l 材料与方法
1．1 研究材料
供试材料泽苔草(Caldesia parnasifolia)取 自湖
南茶陵湖里居群 (该居群的面积虽然有 3 000～
4000 m ，但目前该居群中大约只有 300—500个个
体)。从该居群随机选取 l0株植物，收集植株上成
熟的瘦果，每家系抽取 24个瘦果，用每一瘦果中的
胚作为子代样本，共取 240个子代样本。野外考察
及取样时间为2004年 9月份，凭证标本存于武汉大
学标本馆(WH)。
1．2 DNA提取和 IL~_PD-PCR扩增
供试材料泽苔草胚 DNA的提取步骤参考文献
[14]进行。
PCR反应体系(25 ILL)含有双蒸水 l5．5 L，
dNTPs 2．5 ILL(2．5 mmol／L)，10×PCR bufer(含
10 mmol／LTris—HCI，1．5 mmol／L MgCl2和 50 mmoL／
L KCI)2．5 IL，Taq Polymerase 0．5 ILL(2 U／I．~L)，引
物(25 pmo1)1 ILL，模板(20 ng／ILL)3 ILL。PCR反
应在 PTC．100 。M扩增仪上进行，反应参数为：94qC预
变性 4 min；94℃变性 1 min，34℃复性 1 min，72℃
延伸 2 min，共 45个循环；72cC延伸 10 min。
本实验共选用了 100个随机引物进行初筛，有
42个引物可以扩增出清晰的带型。依据扩增结果，
对比可重复性、多态性后，筛选确定了扩增效果良好
的5个引物。引物购 自上海 Genbase公司，为十聚
体寡核苷酸随机引物。所选用的有效引物及序列见
表 1。
表 1 所用有效引物名称及序列
Table l Name and sequences 0f e
．
feetive
pnmem used in the present study
引物名称 Primers 序列(5’-3’)Sequences(5’-3’)
DO2
DO5
Ell
El2
Cl8
1．3 数据统计分析
对 PCR扩增产物在 1．2％的琼脂糖凝胶上90 V
稳压电泳，溴化乙锭处理后置于紫外光灯下检测，用
凝胶成像系统拍照、存档，待分析。RAPD为典型的
显性分子标记，因此不能象等位酶或 SSR等共显性
标记那样可以直接判断基因型，当用显性标记分析
交配系统时，必须挑选合适的位点。本研究在选择
RAPD显性标记位点时遵从 Gaioto等介绍 的原
则⋯】，共选出20个位点进行统计，电泳图谱中的每
条 DNA谱带作为 1个单位，如果有带(包括弱带)
则计为“1”，没有带则计为“2”。RAPD标记位点名
称用引物名加扩增片段的分子量表示。以 200 bp
Marker作为标准分子量对照。
异交率的测定有多种方法，F 和 Bailey提出
的混合交配模型是最基本的异交率估测模型 引¨，
Ritland和Jain基于混合交配模型导出的多个独立
位 点异交率 估测模 型是 目前最 普遍 的估测程
序 ¨订J。本研 究也根 据此方 法，应用 MLTR程
序[t8]，采用500次靴带分析，测定 了母株和花粉库
基因频率、固定指数(，)、多位点异交率(t )、单位
点异交率(t )。
2 结果
本研究所选 5个引物共得到2O个显性标记，并
且将这些标记用于异交率的估计。显性(有电泳条
带)等位基因的频率及其标准差(SD)见表2。
表 2 显性标记位点名称、每一显性位点等位
基因频率及其标准差
Table 2 Dominant marker loci，estimates of the
dominant marker alele frequencies(D)，their
respective standard deviations(SD)
采用 MLTR软件对泽苔草居群多位点异交率
(t )和单位点异交率(t )进行测定，结果显示异交
在泽苔草居群中占主要地位 (t =1．008±0．070；
C G C 呲m 一
A G G G ∞ 从m∞ 眦m 鲫
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 2期 董贞荣等：泽苔草交配系统的 RAPD分析
￡，=1．028土0．030)(表 3)。
表 3 多位点异交率(f )、单位点异交率
(t，)以及固定指数(F)
Table 3 Estimates of muhilocus outerossing
rates(f )，single—locus outemssing rate(t )and
fixation index(F)with RAPD markers
3 讨论
RAPD显性标记很早以前就被用于有花植物的
异交率检测⋯’ J。本研究选择 RAPD显性标记对
泽苔草进行自然居群异交率的检测再次说明，RAPD
标记足以提供丰富的信息进行异交率的研究。显性
RAPD标记提供的有用信息虽然没有共显性标记
(如等位酶、SSR等)多，但只要筛选足够多且具有
多态性的引物，就能在子代样品中找到所要的一些
低等或中等程度等位基因频率的显性标记位点用于
交配系统研究 ¨。在实验过程中 RAPD标记具有
操作简单、快速，耗费低等优点，为研究交配系统带
来了方便。
本研究对泽苔草湖里居群的异交率进行了估
测，结果显示该居群异交率处于较高水平 (t =
1，008)，多位点异交率与单位点异交率差异不大
(t 一t，=一0．021)，固定指数估计值小于 0(F =
一 0．200)，说明在所分析的居群中有过剩的杂合子
并且很少有近交，泽苔草的交配系统以异交为主。
较高的异交率在其它的植物中也有发现，Pascarel—
la¨ 报道美洲植物(Ardisia escalonioides)的异交率
超过 1。陈小勇等 发现2个红凉伞(Ardisia crena—
ta var．bicolor)居群的多位点异交率都大于 1，并且
可能是受密度和生境片断化影响所致。
自交亲和的物种在种群密度低时，亲缘关系较
远的植株提供的花粉少，近交和自交的机会多，从而
使异交率降低。种群密度大时，邻近植物间的联系
加大，异交水平高 【2¨。陈小勇和宋永昌 1、汪小凡
和陈家宽【2】、He等 和Chen[ 等的研究中均发现
异交率与植物密度正相关。泽苔草在湖里居群的分
布相对集中在一个块状的区域，这种集中的分布很
可能使不同基因型植株之间的联系加大，从而使得
异交水平提高。本文只是根据泽苔草的分布状况推
测异交率可能受到了居群密度的影响，至于二者之
间的具体关系还有待进一步研究。
汪小凡和陈家宽 研究矮慈姑(Sagitaria PYg—
rlbaea Miq．)时发现，居群中访花昆虫的飞行以较近
距离(<0．5 m)者为多，这使得相同基因型的不同
克隆分株的交配更易实现，而这种交配是自交的一
种形式，因此造成矮慈姑异交率较低。野外观察发
现泽苔草居 群 中访 花昆虫 的飞行 以距离较远
(>2 m)者居多。昆虫远距离飞行很可能使得泽苔
草不同基株间的交配更加频繁和容易，因此提高了
居群的异交率。
水生植物中普遍存在着克隆生长 J，汪小凡和
陈家宽l9· 对泽泻科慈姑属的两种克隆植物小慈
姑(S．potamogetifolia Mer．)和矮慈姑进行了研究，
发现小慈姑的异交率明显高于矮慈姑，个别种群达
到 90％以上。他们认为小慈姑通过珠芽克隆生长
所导致的空间遗传异质性远不及具匍匐茎的矮慈
姑，所以异交率受克隆生长影响程度稍低。泽苔草
的克隆繁殖靠珠芽脱落形成新的植株，珠芽可以随
水流等作用扩散到远处，克隆生长的空间遗传异质
性程度可能不是太高，因此异交率受克隆生长影响
程度可能并不是太强。泽苔草湖里居群有较高的异
交水平，它可能是多种因素作用的结果，本文只是分
析了一些可能的情况，至于哪些因素具体影响着泽
苔草的交配系统，还需要大量的实验验证和进一步
深入的研究。
参考文献：
[1] 洪德元，葛颂，张大明，汪小全，程树志．植物濒危机制研究
的原理和方法[A]．见：许智宏主编．生物多样性研究进
展——首届全国生物多样性保护与持续利用研讨会论文集
【c]．北京：中国科学技术出版社。1995．125 —134．
[2] 汪小凡，陈家宽．长喙毛茛泽泻(泽泻科 )的交配系统研究
[J]．云南植物研究，1998，2o(3)：315—320．
[3] Hamrick J L．Plant population genetics and evolution[J]．Amer J
Bot。1982，69：l 685 一 l 693．
[4] GituruW R，WangQ F。WangY。GuoY H．Reproductive biolo-
gY and prospects for conservation 0f Ⅲ ll扣妇 (Alis．
mataceae)一a threatened monocot in China[J]．Wuhan Univ J
Nat Sci，2003。8：l17 — 124．
(5】 王青锋，陈家宽．泽苔草的花器官发生[J]．植物分类学报。
1997，35(4)：289—292．
[6] 汪小凡．中国泽泻科四属的花部综合特征及对传粉方式的适
应性[J]．武汉大学学报 (理学版)，2001，47(4)：485 —
492．
[7] 王青锋，张志耘，胨家宽．泽泻科的花粉形态研究[J]．植物
维普资讯 http://www.cqvip.com
l70 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
[8]
[9]
[1O]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
分类学报，1997，35(3)：225—235．
汪小凡，陈家宽．野慈姑 自群体异交率的定量估测[J]．遗
传，2000，22(5)：316—318．
汪小凡，陈家宽．矮慈姑的传粉机制与交配系统[J]．云南植
物研究，1999，21(2)：225—231．
Fritsch P．Bieseberg L H．High outerossing rates maintain male
and hermaphrodite individuals in populations of the flowering
Plant Datisca glomerata【J]．Nature，1992，359：633—636．
GmoRo F A，Bramucci M，Oratmpaglia D． Estimation of out—
crossing ratein a breedingpopulation ofEucalyptus urophyllawith
dominant KAPDand AFLPma ers[J]．TheorAppl Gene，1997，
95：842 — 849．
Ge X J．Sun M．Reproductive biology and genetic diversity of a
cryptoviviparous mangrove Aegiceras corniculatum (Myrsinaeeae)
using allozyme and inter-simple sequence~peat(ISSR)Analysis
[J]．Mol Ecol，1999。8：2 061—2 069．
Maguire T L，Peakall R．Saenger P．Comparative analysis of ge-
netic divers in the mangrove species Av／cenn／a mar／na (For-
8k．)Vierh(A
[17]
【18]
[19]
[20]
[21]
[22]
[23]
)detected by AFLPs and SSRs[J]． [24]
77l∞rAppl Genet。2OO2。104：388—398．
陈进明，王青锋．宽叶泽苔草居群内遗传多样性研究[J]．生
物多样性，2005，13(5)：398—4O6．
myfe J L，Baily N T．Plant breeding sudies in legum inous forage
crops 1．Natural crossbreeding in winter beans[J]．J sc ，
1951，41：371 — 378．
Ritand K，Jain S．A model for the estimation of outerossinE rate
[25]
[26]
and gene frequencies using an independent loci[J]．Heredity，
1981．47：35 —52．
Bifland K．A series of FORTRAN computer programsfor estima-
ring plant mating systems[J]．Hered／ty，1990，81：235—237．
Ritland K．Extensions ofmodelsfortheestimation ofmating sys-
tems using independent loci[J]．Hered／ty，2002，鹤：221—228．
Pascarela J B．The mating system of the tropical undemtory shrub
Ard／s／a esca／on／o／des(Mrsinaeeae)【J]．AmerJ Bot。1997。84：
456—46O．
陈小勇，厉宁，沈浪．浙江天童国家森林公园红凉伞交配系
统研究[J]．植物生态学报，2001，25(2)：161—165．
葛菁萍，林鹏．红树植物木榄(Brugu／era gymnorhha)种群的
交配系统[J]．植物生态学报，2001，25(1)：5O一56．
陈小勇，宋永昌．黄山钓桥青冈种群的交配系统与近交衰退
[J]．生态学报，1997，17(5)：462—468．
He T H，Rao G Y，You R L。Ge S．Mating system of oph／o-
pogon xy／orrh／zus(Liliaeeae)，an endangered species in South-
west China[J]．1aterJ P2 sd，1998，159：440—445．
Chen X Y．Efects ofplan t density and age on the mating system
ofKandelia candel(L．)Druce(Rhizopho~ )，a viviparous
mangrove species[J]．Hydrob／dog／a，2000，432：189—193．
Haynes R R．Reproduction biology of selected aquatic plant[J]．
Ann Missouri Bot Garden，1988，75：805—810．
汪小凡，陈家宽．小慈姑的开花状态、传粉机制与交配系统
[J]．植物生态学报，2001。25(2)：155—160．
维普资讯 http://www.cqvip.com