全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(5)：479～483
oilrRal o|Wuhan Botanical Research
马来眼子菜化感作用对斜生栅藻同工酶的影响
吴晓辉 ，张兵之 ，邓平 ，张胜花 ，吴振斌h
(1．中国科学院水生生物研究所 淡水生态与生物技术国家重点实验室，武汉 430072；2．北京市水利科学研究所，北京 100o44)
摘 要 ：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，研究了马来眼子菜 (Potamogeton malaianus)和斜生栅藻 (Scenedesrms
obliquus)共培养系统中斜生栅藻的过氧化物酶(POD)、超歧化物氧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、细胞色素氧化
酶(COD)等同工酶的变化，探讨了沉水植物化感作用对藻类部分酶类的影响。与正常生长状态的对照组相比，马
来眼子菜作用下的样品组斜生栅藻POD酶带总数保持稳定，但酶谱组成发生变化；样品组斜生栅藻 SOD酶带数量
减少而 CAT酶带数量增加。综合结果表明，样品组藻体在化感作用下通过改变酶活性、调整同工酶组成等来抵御
化感作用带来的活性氧(ROS)伤害。马来眼子菜作用下的样品组藻体 COD同工酶的酶谱变化明显，说明化感作
用在一定程度上影响了斜生栅藻的生物氧化过程。
关键词：化感作用；马来眼子菜；斜生栅藻；抗氧化酶；COD；同工酶
中图分类号：Q17；X17 文献标识码：A 文章编号：1000．470X(2007)05．0479．05
Influences of Allelopathy from Potamogeton malaianus on
Isozymes of Scenedesmus obliquus
WU Xiao-Hui ，ZHANG Bin-Zhi ，DENG Ping ，ZHANG Sheng-Hua ，WU Zhen-Bin ’
(1．Key Laboratory ofFreshwater Ecology and B~ologicat Technology，Institute ofHydrobiology，The Chinese Academic of&／ences，
Wuhan 430072，China；2．BeijngHydraulicResearchInstiute，Beijing 100044，China)
Abstract：The algal isozymes of POD，CAT，SOD and COD in the control and Potamogeton malaianus-
exposure treatment were investigated using PAGE method to study the influences of alelopathy from P．
malaianus)on Scenedesmus obliquus．Comparing with the control，the algal isozymo~ams of POD in the
treatment systems changed while the number of bands remained stable．Th e algal isozyme band numbers of
SOD decreased but the band numbers of CAT increased significan tly．These results indicated that S．
obliquus resist the reactive oxygen species(ROS)hurt from allelopathy stress by adjusting the
isozymograms an d activities of an tioxidant enzyme．Th e study also presented the infl uences on COD
isozymo~ams，which showed in a sense the allelopathic hurts on biological oxidation of algae．
Key words：Alelopathy；Potamogeton malaianus；Scenedesmus obliquus；Antioxidan t enzymes；COD；
Iso~me
许多逆境能影响植物体内活性氧代谢系统的平
衡，干旱、冻害、强光、重金属和污染等环境胁迫均能
导致植物体内活性氧中间物的过量产生，包括 O ，
H：0：，·OH等，植物体内活性氧平衡就会破坏、造成
各种氧自由基的积累而引起毒害，即增加活性氧如
超氧阴离子自由基 (Oi)、过氧化氢 (H：0：)、氢氧
自由基 (·OH)、单线态氧 ( 0：)的产量，破坏或降
低抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶
(CAT)、过氧化 物酶 (POD)、谷 胱甘肽 还原酶
(GR)等的组成、活性或含量 ．2 J。由于几种抗氧化
酶在植物受不同胁迫时会相应升高，且其分布的细
胞器和作用的活性氧种类有所差异，植物抗氧化酶
体系活性变化特征常作为指标来指示植物对不同类
型环境胁迫的响应。
化感作用是指植物通过向外界环境释放化合
物，对其它植物 (包括微生物)产生促进或抑 制
作用 J。大量研究报道证明，大型水生植物对藻类
存在化感抑制作用，水生植物化感物质的提取研究
已多有报道-4 J。但水生植物化感抑藻作用的机
理研究相对较少 ，唐萍 对水花生 (Alernanthera
收稿日期：2007-03—26。修回13期 ：20o7—05—17。
基金项目：国家杰出青年科学基金(39925O0r7)资助；国家“十五”重大科技专项(2oo2从 6olO21)资助；973计划项 目(2002CB412300)资
助；湖北省科技攻关重大项目(2006AA305A03)资助。
作者简介：吴晓辉(1971一)，女 ，理学博士，主要从事恢复生态学研究。
通讯作者(E—mail：wuzb@ihb．ac．cn)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
philoreroides)、菱(Trapa bispinosa)、金鱼藻(Cerato．
phylum demersum)、浮萍 (Lemna minor)的研究表
明，水生植物作用可促进藻细胞叶绿素降解、抑制
SOD活性。唐萍‘。 研究 了风眼莲(Eichhornia eras．
sipes)根系分泌物对栅藻结构和代谢的影响，发现在
分泌物的作用下栅藻超氧物歧化酶(SOD)活性和比
活性有激应性升高，但随处理天数的延长又呈急剧
下降趋势；而其过氧化物酶(POD)的活性则持续上
升。Li 从芦苇(Phragmites communis)中提取的化
感物质能 明显抑制铜绿微囊藻和蛋 白核小球藻
SOD、POD的活性。然而，关于化感胁迫对藻类抗氧
化酶同工酶影响的研究尚未见报道。
本研究利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，研究
沉水植物和藻类共培养系统中藻类的某些酶类，如
过氧化物酶、超歧化物氧化酶、过氧化氢酶、细胞色
素氧化酶等同工酶的变化，根据酶的生物化学变化，
通过染色方法显示出酶的不同区带，探讨沉水植物
化感作用对藻类的作用机理。
1 材料与方法
1．1 实验材料
马来眼子菜 (Potamogeton malaianus)于实验前
1个月采自湖北省洪湖，在室外有底泥(取自武汉东
湖)的水缸中扩大培养，实验前3 d转入室内适应培
养。斜生栅藻 (Scenedesmus obliquus)购自中国科
学院水生生物研究所藻种库，在光照培养箱内以水
生4号培养液培养，光暗周期 12 h：12 h，温度25~C。
1．2 化感作用共培养系统的设计
为排除营养、光照、微生物等因素的干扰，充分
保证马来眼子菜的化感作用，本实验设计以下共培
养系统进行实验，并在实验开始时和结束时分别测
定培养系统的TN、TP浓度。
将 20 am×20 am×30 am的玻璃方缸 170~C干
热灭菌，盖上灭菌的玻璃板，缸底部放人灭菌的白色
砾石，加入 8 L 1／4改良 Hoagland溶液。将充氧泵
的泵头和橡胶管灭菌后，放人玻璃缸中，充氧泵出口
的气体经过 0．45 p,m的细菌过滤器后充人培养
液中。
将转入室内培养的马来眼子菜洗净，挑选生长
状态良好的植株用蒸馏水和无菌水反复冲洗后，无
菌滤纸吸干水分，称取(15±5)g移人上述8 L玻璃
缸中，固定在底部砾石中。适应培养2—3 d使植株
生长稳定。
将处于对数生长期的斜生栅藻转接到 1／4改良
Hoagland溶液中扩大培养，生长至对数生长期后转
接到已种好马来眼子菜的玻璃缸中和未种植马来眼
子菜的玻璃缸中，分别设为样品组和对照组。对照
组中放人灭菌的塑料植物，以模拟样品组的遮光情
况。藻液起始浓度为 10 ind·L～，实验设一个平
行。
共培养系统于室内培养，室温(25±5)℃，光暗
比12 h：12 h，日光灯侧面光照，光强为4500 lx。
1．3 藻类粗酶液的提取
共培养至第 7 d时，将共培养系统中的藻液经
0．45 lxm混合纤维酯滤膜过滤。所得藻泥经真空泵
抽干水分。在上述藻泥中各加入 50 mmol／L PBS
(pH=7．8)，混匀后4℃离心 (10000 r／min)去除上
清液；再各加人 rifs一甘氨酸 (pH=8．3)，混匀后冰
浴中用 88一II型超声波细胞破碎仪破碎处理。破
碎后的藻液中加入石英砂，在冰浴中进行研磨，至藻
液充分破碎，4℃离心 (10000 r／min)20 min，所得
上清液即为藻类的粗酶液。
1．4 藻类PoD、SoD、CAT、C0D同工酶的测定
采用不连续、垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳的
方法进行藻类同工酶的测定-8 J。POD采用改良联
苯胺染色，COD采用二甲基对苯二胺染色法，CAT
采用铁染色法，SOD采用NBT光还原法 引。
2 结果与讨论
2．1 光照、微生物、营养等化感作用干扰 因素的
排除
本实验采用侧面加光，至实验结束时在玻璃方
缸侧面测定的光照强度为4500 lx(>3000 ix)，即本
实验的光照强度不会造成光照抑制。
已有研究表明，水生态系统中微生物对化感作
用的影响并不象土壤微生物那样明显，风眼莲无菌
苗实验以及对去根和留根的马来眼子菜的抑藻效果
的研究结果均表明：水生植物的根际微生物在化感
抑藻效应中不起作用-1 ]。为尽可能排除微生物
作用对实验中化感物质和化感作用的影响，本实验
采用了一定的灭菌措施，藻类为无菌纯培养，马来眼
子菜经无菌蒸馏水反复洗净，实验装置干热灭菌，通
人的空气经细菌过滤器过滤，通过这些措施力争降
低微生物对实验的影响。然而，绝对的无菌条件很
难达到，如实验中植物称重、移植、取样等过程都有
可能使实验系统重新受到微生物的影响，但在此实
验条件下的微生物影响基本降到较低水平。
在化感研究中，常采用高浓度方法来排除营养
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第 5期 吴晓辉等 ：马来眼子菜化感作用对斜生栅藻同工酶的影响 48l
不足对藻类生长的影响。Nakai通过从第 3 d起外
源添加 NaNO。和 K2HPO4以满足培养液中营养盐
的浓度，营养盐测定结果为 >6．4 mg／L(以 N含量
计)和 >0．22 mg／L(以 P含量计)，此浓度可认为基
本排除了化感研究中营养盐的抑制_1 。Ksmer通
过缩短实验周期至3 d来满足营养盐需求，同期测定
的对照组 PO4一P为 1．1～1．7 mg／L，NO 一N为7．0～
7．5 mg／L；处理组 PO 一P为0．6～1．7 mg／L，NO3-N
为2．3～7．5 mg／L 14]。本实验中TN、TP的浓度均
超过上述浓度要求，在实验开始的时候和实验结束
的第 7 d分别测定了对照组和样品组水体中营养盐
的浓度，结果见表 1。表中所示 TN、TP的浓度都较
高，因此可以排除 N、P等营养盐的抑制干扰。
表 1 共培养系统中营养盐浓度的变化
Table 1 Changes of nutrient concentrations
in the coexistence systems
营养盐
Nu ent salt
对照组 Control 样品组Treatment
起始浓度
In沁al
concentration
第7天浓度
Concentration
_n the 7th day
起始浓度
Inifial
concentration
第7天浓度
Concentration
_n the 7th day
注：括号内为标准差。
Note：Data in brackets weIe standard elTor．
本实验采用的 Hoagland培养液中没有添加碳
源，实验系统通过充气泵充入除菌的空气，利用空气
中的 CO：补充系统碳源。
2．2 斜生栅藻 PoD同工酶
马来眼子菜化感抑制作用下的样品组斜生栅藻
的POD酶谱和无化感作用的对照组 POD酶谱基本
可分为3个区，即近阴极的慢速区，中间区和近阳极
的快速区，两组的中间区有扩散的酶着色区。
两组间的酶谱表现出明显的变化，其变化包括
三大类，一类为引起对照组的 POD酶谱中原有酶带
的消失，另一类为新酶带的产生，第三类变化为酶带
着色深浅的变化，即酶活性强度的变化。对照组斜
生栅藻在正常生长状态下 POD酶谱共有 4条酶带，
其中POD1着色深而窄，POIM着色深而宽，POD5着
色浅而宽，POD2着色浅而窄(图1：A)。样品组中
POD2消失，但在快速区增加 了一条着色浅而窄的
POD3。POD5酶带着色减淡且带宽变窄，此外，样品
组酶带中的POD1、POD4着色减淡。
芦苇化感物质对小球藻 POD的影响研究表
明 ¨，低浓度的化感物质促使藻类POD活性升高，
高浓度的化感物质则使其活性降低 ¨。KC1、NaC1
等盐胁迫对柱胞鱼腥藻Anabaena cylindrical同工酶
的影响表现为原有酶带的消失和新酶带的产生，同
时POD谱还出现酶带颜色深浅的变化 。
本实验中样品组斜生栅藻 POD酶带总数稳定，
说明POD对化感作用的胁迫有一定的抵御作用。
但藻体 POD酶带的着色均减淡 ，同工酶谱的这一变
化说明在马来眼子菜化感作用的胁迫下其涪l生略有
下降；虽有新增酶带的补充，但不能抵消原有酶带消
失的影响。
POD3
POD4
POD5
l 2 2 1 1 2 2 1
CoD3
C0D4
A B C D
C0D1
1．Treatment；2．Control；A．POD；B．SOD；C．CAT；D．COD
图 1 化感作用下斜生栅藻同工酶的电泳酶谱
Fig．1 Isozymes in treatment and control
ofScened~smus obliquus
2．3 斜生栅藻 SoD同工酶
马来眼子菜化感抑制作用下的样品组斜生栅藻
的 SOD酶谱和无化感作用的对照组的 SOD酶谱表
现出了明显差异(图1：B)。对照组在中间区出现两
条酶带 SOD1和 SOD2，带较宽且颜色明亮；样品组
在中间区仅出现一条酶SOD1，该酶带宽度仅为对照
组同一酶带宽度的一半，着色也较浅。
植物体在受到轻度的环境胁迫时，SOD的活性
会有所升高，以增强植物对活性氧的清除能力；而当
受到重度的逆境胁迫时，SOD的活性又会大幅度地
降低，造成活性氧的积累和细胞的伤害 。蓝绿藻
和绿藻的SOD活性随着藻类耐氧能力的提高而上
升_】 。菖蒲对铜绿微囊藻的化感作用研究表明，在
化感抑制作用5 d后藻类SOD值明显升高 ¨。蛋
白核小球藻随芦苇化感物质的浓度增加呈现先升高
后降低的趋势，化感物质达到一定浓度时藻类 SOD
值降至零口 。凤眼莲根系分泌物使栅藻 SOD活性
和比活性产生激应性升高，但随处理天数的延长又
呈急剧下降趋势 ]。水花生、菱、金鱼藻、浮萍及其
种植水抑制 SOD活性方面与凤眼莲对栅藻的影晌
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武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
基本相似 。已有研究均表明，化感作用对藻类
SOD值的作用表现为先增后降的趋势，即表现出一
定的抗性后逐渐失去活性。
本研究结果表明：在马来眼子菜7 d的化感作
用下，藻体对化感物质的耐受已超出了 SOD酶的防
御极限，斜生栅藻 SOD的活性表现为下降。比较
SOD和 POD在化感胁迫下同工酶变化的异同，发现
POD对化感胁迫的耐受高于SOD，SOD对化感作用
更为敏感，这一结论与凤眼莲根系分泌物抑藻机理
研究的结果相同 。
2．4 斜生栅藻 CAT同工酶
样品组和对照组斜生栅藻的 CAT酶谱在慢速
区基本相同，两组均有酶带 CAT1和 CAT2，且两酶
带的带宽一致，但 CAT2的着色淡于 CATI。两者主
要变化出现在快速区，样品组在快速区出现新增酶
带CAT3，该带带宽与CATI相似，着色深浅与CAT2
相似(图 l：C)。
菖蒲5 d的化感抑制使得铜绿微囊藻的CAT活
性明显升高l ，芦苇抑藻物质的作用使蛋白核小球
藻的CAT活性表现为先升高后下降 ¨。本实验的
测定结果表明与上述研究结果相同，马来眼子菜作
用下的样品组斜生栅藻 CAT活性明显高于正常生
长状态下的对照组。其原因可能因为斜生栅藻的
SOD活性降低，使得藻体内活性氧 O 不能转化为
H O：，CAT催化反应底物浓度的降低直接刺激了样
品组CAT活性，使其有所增加。
由SOD、CAT、POD组成的抗氧化酶系协同防御
活性氧伤害，在逆境胁迫下首先诱导 SOD活性升
高，产生的H O 由CAT加以清除；POD作为植物代
谢的末端 氧 化酶，其 活性 变化 落后 于 SOD和
CAT[加]
。 综合分析本研究中样品组藻体抗氧化酶
的变化发现，SOD的活性已受到损害，CAT活性有
所增强，POD活性损害尚不明显，总之，受试栅藻通
过自身抗氧化酶系统的调节对化感作用产生的活性
氧伤害呈现出一定的抗性。
2．5 斜生栅藻 COD同工酶
为探讨马来眼子菜的化感作用对斜生栅藻生物
氧化作用的影响，进行了斜生栅藻细胞色素氧化酶
同工酶谱的测定(图 1：D)。两组间的酶谱表现出
明显的变化，其变化包括三大类 ，一类为引起对照组
的COD酶谱中原有酶带的消失，另一类为新酶带的
产生，第三类变化为酶带着色深浅的变化，即酶活性
强度的变化。
样品组和对照组斜生栅藻的 COD酶谱基本可
分为二个区，即近阴极的慢速区和近阳极的快速区。
对照组斜生栅藻在正常生长状态下 COD酶谱共有
3条酶带 COD2、COD3、COD4，其中 COD2着色深而
宽，COD3和 COD4着色略浅，带宽与 COD2相似。
样品组中 COD4消失，慢速区的 COD2变得着色极
淡，只有 COD3酶带保持变化不明显，但慢速区中新
增一条着色较淡的 COD1。
马来眼子菜作用下的样品组栅藻 COD活性水
平明显低于对照组，主要表现为酶带消失和着色减
淡，该同工酶谱的检测结果说明化感作用干扰了斜
生栅藻的生物氧化过程。
3 结论
对抗氧化酶体系和细胞色素氧化酶同工酶测定
结果表明，沉水植物的化感作用对藻类的同工酶有
一 定影响。
与正常生长状态的对照组相比，马来眼子菜作
用下的样品组斜生栅藻 POD酶带总数保持稳定，但
酶谱组成发生变化；藻体对化感作用的耐受已超出
了SOD酶的防御极限，样品组斜生栅藻 SOD着色
减弱、酶带数量减少，说明其活性明显下降；样品组
斜生栅藻 CAT酶带数量增加，表现出活性增加的趋
势。综合分析样品组斜生栅藻抗氧化酶系的结果表
明，样品组藻体通过改变酶活性、调整同工酶组成等
协同作用来抵御化感作用带来的活性氧伤害。
马来眼子菜作用下的样品组藻体 COD活性水
平明显低于对照组，主要表现为酶带消失和着色减
淡，说明化感作用在一定程度上影响了斜生栅藻的
生物氧化过程。
参考文献：
[1] 曹特，倪乐意．金鱼藻抗氧化酶对水体无机氮升高的响应
[J]．水生生物学报，2004，28(3)：299—303．
[2] 曹淑华 ，查向东．超氧化物歧化酶研究综述 [J]．安徽农业科
学，2003，31(4)：599—601．
[3] Rice E I．AUdop~hy[M]．2nd ed．London：Academic Pres．
1984．
[4] Elisabeth M G．Alelopathy of aquatic qutotrophs[J]．Critical Re-
P／ant Sc／ences，2003，22(3—4)：313—339．
[5] 唐萍，吴国荣，陆长梅，顾龚平．太湖水域几种高等水生植物的
克藻效应[J]．农村生态环境，2001，17(3)：42—47．
[6] 唐萍，吴国荣，陆长梅，周长芳，魏锦诚．风眼莲根系分泌物对
栅藻结构及代谢的影响 [J]．环境科学学报，2000，21(3)：
355—359．
[7] Li F M，Hu H Y．Isolation and characterization ofa novel antialgal
alldoehemiealfrom Phragmites cornmunls[J]．AppEnvironMicro-
biof．2005。71(11)：6545—6553．
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 5期 吴晓辉等：马来眼子菜化感作用对斜生栅藻同工酶的影响 483
[8]
[9]
[1O]
[11]
[12]
[13]
[14]
何忠效，张树政．电泳[M]．第2版．北京 ：科学出版社，1999．
罗广华 ，王爱国，付爱根．植物 SOD的凝胶电泳及活性显示
[J]．植物生理学通讯，1983，6：44—47．
董泗建，刘昌玲．一种鉴定过氧化氢酶活性的铁染色法[J]．
生物化学与生物物理进展，1996，23(1)：86—88．
陈坚，顾林娣，章宗涉 ，陈卫华．马来眼子菜抑制藻类增长及
其抑制系数计算 [J]．上海师范大学学报(自然科学版)，
1994，23(1)：69—73．
孙文浩，俞子文，邰根福，余叔文．风眼莲无菌苗培养及其克
藻效应[J]．植物生理学报，1990，16(3)：301—305．
Satoshi N，Hoaomi M，Okada M，Murakami A．Control of algal
growth by macrophytes and maemphyte-extraeted bioactive eom-
pounds[J]．Wa＆f Tech，1996，34(7—8)：227-235．
K~lmer S，Andrcas N．Allclopathic growth inhibition of selected
phytoplankton species by submerged macmphytes[J]．J Phycol，
2002，38：862—871．
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
[2O]
李锋民，胡洪营，门玉洁，洪喻，郭美婷．化感物质对小球藻抗
氧化体系酶活性的影响[J]．环境科学，2006，27(10)：2091—
2o9l4．
易平，郭厚良，周云珍．不同无机盐对柱胞鱼腥藻同工酶的影
响[J]．武汉植物学研究，1999，17(4)：379—381．
吴国荣，陆长梅，陶明煊，周长芳，顾龚平，魏锦城．百草枯和
H：0：预处理提高盐泽螺旋藻对铅的耐受性 [J]．湖泊科学，
2000，12(3)：240—246．
Asada K，Yoshikawa K，Takahashi M，Maeda Y，Enmanji K J．Su-
peroxide dismutasefrom a blue-green alga，Plectonema boryanum
[J]．JBiol Chem，1975，250：2801—2807．
张维昊，周连凤，吴小刚，宋立荣．菖蒲对铜墙铁壁绿微囊藻
的化感作用[J]．中国环境科学，2006，26(3)：355—358．
彭金良，严国安，沈国兴，常利英，王昀，杨方星．d-萘酚胁迫
对普通小球藻生长及抗氧化酶活性的影响[J]．武汉大学学
报(理学版)，2001，47(4)：49—452．
维普资讯 http://www.cqvip.com