全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(5)：373～379
Journal of Wuhan Botanical Research
拟南芥 AtDAD1超量表达植株对 H2o2抗性的研究
贾志蓉，李 丹，吕应堂
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室，武汉 430072)
摘 要：构建拟南芥 AtDAD1超量表达载体，以农杆菌介导的方法转化拟南芥哥伦比亚生态型，比较 AtDAD1超
量表达植株和野生型植株表现型的差异 ，以及两者对 H 0 抗性的不同。实验显示，AtDAD1转基因拟南芥生长较
野生型拟南芥更为强壮 ，对高浓度 H 0 有较强的耐受力。测定两者糖含量 ，发现 AtDAD1转基因拟南芥叶片糖的
含量明显高于野生型拟南芥叶片。以上结果表明，AtDAD1基因可能参与植物生长发育，并可能在拟南芥抵抗凋亡
的过程中发挥重要的作用。
关键词 ：拟南芥；AtDAD1；H2O2；细胞凋亡
中图分类号：Q942．5 文献标识码：A 文章编号：1000—47OX(2OO4)O5—0373—07
The Role of Arabidopsis AtDAD1 in the Tolerance to
Hydrogen Peroxide Stress
JIA Zhi—Rong，Li Dan，Li-『Ying—Tang。
(Key Lab．of MOE for Plant Development Biology．Wuhan University，Wuhan 430072，China)
Abstract：In this research，the differences between wild—type Arabidopsis thaliana and the At—
DAD 1 overexpression type in their tolerance to high dosages of HzOz were compared．The diversi—
tv 0n their phenotype from the germination to ripeness was also observed．T、he results demon—
strated that the overexpression of AtDAD 1 conferred the transgenic plant more resistant to HzOz
stress．It is alsO be found that the sugar content in leaves of transgenic plant is much higher than
that in wild—type Arabidopsis leaves．Since many lines of evidence have proved that HzOz is a factor
leading to programmed cell death (PCD)and sugar iS important for leaf senescence and cell
death。it was inferred that AtDAD 1 maybe have some effect on Arabidopsis resistance to PCD．
Key words：Arabidopsis thaliana；AtDAD1；Hydrogen peroxide；Programmed cell death (PCD)
细胞程序性 死亡 (programmed cel death，
PCD)是多细胞有机体发生的一种积极的细胞死亡
过程，是生物体对机体内部或外部刺激所作出的一
种应答反应[1_3]。细胞程序性死亡(PCD)与细胞坏死
有很大的区别：PCD是一种积极的、由基因控制的
生理性细胞死亡过程；而细胞坏死则是由于有害因
子的极度刺激引起，非基因参与调控的细胞被动死
亡过程[2，Il。
有关动物 PCD的研究广泛而深入，对其机理、
与 PCD相关的基因，及包含其中的信号通路也已经
基本被证实。植物 PCD的研究较之落后许多，但近
年来也有了很大的发展。PCD贯穿于植物发育的整
个过程[2]，如胚柄的退化、糊粉层的消失、导管的形
成、叶片的成形，以及植物体的性别决定、叶片的衰
老等等。大量研究结果表明，选择性的细胞死亡是植
物体在生长过程中所必需的。
收稿日期：2004—03—18，修回日期：2004-04-14。
基金项目；国家 863项目(2002AA224171)资助。
作者简介 ：贾志蓉 (198O一)，女，在读硕士生，现从事植物分子生物学研究。
通讯作者(Email：yingtlu@whu．edu．on)。
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374 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
目前，已经在植物体中获得了一些 PCD相关基
因，有关它们功能的探讨近年来成为植物 PCD研究
的热点。这些基因包括：bcl一2家族、DAD1同源基
因、P53、c—myc、Acd、Mlo、NPRj、厶 j、Lisj、 、
tin、Pto、Ts2等等。其中，D Dj(defender against
apoptotic death1)是一个高度保守的凋亡抑制基
因，最早发现于仓鼠中[4]，在其他的脊椎动物如人
类、老鼠等，以及无脊椎动物，如非洲爪蟾、线虫中都
已发现 DAD1的同源基因[4 ]。目前已经在拟南芥、
水稻、玉米、豌豆、大麦、苹果 、柑桔、马铃薯、番茄等
植物中分离到 DAD1的同源基因[引，但对其功能的
研究还未深入探讨。拟南芥中 DADj的同源基因
AtDAD】 (Arabidopsis thaliana defender against
apoptotic death1)具有 345个核苷酸的开放阅读框，
编码 115个氨基酸。在氨基酸水平，它与脊椎动物有
49％相同(63 类 似)，与线虫相 比较，则有 48％相
同(68 类似)L1]。
植物体在对抗其体内、外环境压力的时候，会在
体 内产生并积累活性氧中间物(reactive oxygen in—
termediate，ROI)[ ，ROI包括 o3、H202、OHm"嘲等
等。越来越多的证据表明，H o 可以触发各种细胞
变化，但对植物体产生的影响程度具有剂量效应。低
剂量的 H O 可以提高植物体对各种胁迫压力的抗
性，而较高剂量的H 0 则成为 PCD的触发因素之
~ Ddo]
。 目前，植物体对 H o 应答中所涉及到的细
胞组分还不完全清楚。
同时，糖在叶片衰老、细胞死亡中有较大作用，
但对它参与衰老的机制却说法不一。早在 1997年，
Thimann等人就提出糖饥饿 (sugar starvation)引
起植物叶片衰老的假设[1¨，在花瓣衰老的过程中也
有类似的报道[1 。但也有人提出相反的假设，糖的
增加引起叶片的衰老。因而，尽管糖水平的变化与衰
老的关系详细机制还不清楚 ，但其作为一种信号分
子在植物体多种组织衰老过程中发挥作用[1引。
笔者为探讨拟南芥 AtDAD1的功能，构建 了
AtDADj超量表达载体 ，并采用农杆菌介导的转化
方法转入拟南芥野生型。比较拟南芥AtDAD1超量
表达植株与野生型植株的表现型差异，发现转基因
植株发育略早于野生型植株，在幼苗期强壮于野生
型。H O 抑制种子萌发实验显示，AtDAD1超表达
拟南芥萌发早于野生型拟南芥，萌发率大于野生型
拟南芥。高剂量H o 处理叶片后，结果显示转基因
植株叶片细胞活力高于同期处理的野生型植株叶
片。糖含量测定发现，AtDAD1转基因拟南芥叶片
糖含量高于野生型拟南芥。以上结果说明，AtDAD1
可能参与拟南芥生长发育过程 ，AtDAD1转基因拟
南芥对诱发PCD因素之一的H o 有较强的抗性 ，反
映出该基因在拟南芥细胞凋亡中可能起抑制作用。
l 材料与方法
1．1 植物材料
拟 南 芥 哥 伦 比 亚 型 (Arabidopsis thaliana
Columbia)栽培于温室。培养条件为 22℃，光周期为
14 h光照／10 h黑暗。
1．2 载体的构建
AtDADj基因由法国 Perpignan大学 Patrick
Galois教授馈赠，酶切后克隆到 pBI121上，构建得
到用于植物转化的过量表达转基因载体(载体构建
图未在文中显示)。
1．3 转基因植株的检测
将重组的 pBI121载体转化农杆菌 GV3101，进
一 步用农杆菌介导的转化法 (floral dip method)转
入拟南芥哥伦比亚型。利用载体本身的卡那霉素抗
性筛选初步得到转基因植株，得到稳定表达的 T3
代 纯合体后，用 PCR方法 (载体两端的引物)和
Northern杂交进一步鉴定获得的转基因植株，并以
其作为以下实验的材料。杂交方法按照本实验室以
前的方法 ¨ 进行，探针 AtDAD1通过随机引物延伸
的方式a。 P标记，杂交在严谨条件下完成。
1．4 表现型比较
将T3代转基因拟南芥与野生型拟南芥种在同
一 个铺有 1／2 MS培养基[1 ]的平板上，待种子萌发
后，移栽到蛭石中，比较二者生长差异。
1．5 H：0：抑制萌发效应比较
AtDAD1转基因拟南芥的种子与野生型拟南
芥的种子分别置于 eppendorf管中，以 7O％的乙醇
消毒 30 S，无菌水洗 1次，5 的 NaC10溶液振荡浸
泡 5 min，无菌水再洗 5次，吸干水。分别加入 1 mL
含 25、5O、75、1o0、125、150 mmol／L H2O2的 1／2
MS液体培养基，并以不加 H o 的培养基作为对
照。将铺有灭菌滤纸的灭菌培养皿分成两个区域 ，在
这两个区内分别涂上相同浓度 H o 处理 的 f—
DAD1转基因拟南芥种子和野生型拟南芥种子。4。C
春化 3 d后，置于光照培养箱(25℃±2℃，光周期为
14 h光g~,／10 h黑暗)生长。3 d后比较两者在萌发时
间和萌发率上的差异。
1．6 H：O：处理后叶片细胞生活力比较
取铺有 1／2 MS固体培养基的平板上生长 8 d
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第 5期 贾志蓉等：拟南芥AtDADI超量表达埴株对H 0。抗性的研究 375
刚长出两片真叶的野生型拟南芥 及 AtDADI转
基田拟南芥的幼苗，浸泡于1O0 mmol／L的H z0 中，
24 h后，荧 光 素二醋 酸酯 (fluorescein diacetate，
FDA)染色，检冽两者的叶片细胞活力。于Olympus
IXT0倒置显微镜(Japan)下观察组织及细胞染色结
果。图片采集于cool CCD(diagnostic Instruments，
Inc．U．S．A)下进行。
1．7 可溶性总糖的测定
选取蛭石上生长 3周的转基因拟南芥与野生型
拟南芥幼苗各 8株 将其叶片采摘后干燥+于 uO c
烘箱内鼓风固定 15 m[n．然后调强至 70 C过夜 干
叶片磨碎后．称取 50 mg样品倒八 10 mL离心管，
加入 4 mL 80 的酒精，置于 8oc水浴中不断搅拌
40 rain，离心，收集上清液，将其残渣加 8 c) 的酒精
重复提取2次．合并上清液。在上清液中加入 10 mg
活眭炭，80 C脱色30 rain，定容至 lO mL．过滤后，取
一 定量的酒精提取液，浓缩至0．05～0．1 mL，加入
■ ⋯
A
3 mL蒽酮试剂(150 mg蒽酮溶于 100 mL稀硫酸
(76 mL浓硫酸加 30 mL水)j，90"C保温 1 5 rain，在
620 nm处用分光光度计测定OD值，取 20～50 mg
的葡萄糖同法测定，做成标准曲线进行计算
2 实验结果
2．1 转基因植株的鉴定
经含有 AtDAD1基因的农杆菌转化及筛选后
得到的拟南芥植株，由PCR(载体两端的引物)鉴定
其插入、结果如图 1：A所示，L0为野生型对照，
L1～5为转基因株系。其中．L1、L3、L4、L5均能扩增
出 600 bp左右的 AtDAD1带，说明 AtDADt已插
入拟南芥基因组。Northern鉴定结果如图 l：B所
示，AtDADI转基因拟南芥L】～4均能杂交出强待
异性的带，而野生型拟南芥对照LO则信号相对彳臣
弱。表明AtDADI确实为超量表达。选取表达量较
高的4号作为以下转基固拟南芥比较性实验的材料
0 l 2 3 4
B
· AtDADl
rR A
A．PCR鉴定AtDAD1的插入 I 0．野生型拟南芥对照；L1～5．AtDAD1转基因拟南芥；扩增曲的 AtDAD1带如箭
头所指。B．Northern杂交鉴定获得的转基因植株为超量表达 L0．野生型拟南芥对照；L1～4．经 PCR鉴定有插入
的AtDAD1转基因拟南芥IAcDADJ杂交带如箭头所指
A．PCR ampLif[catton．L0，wild—typeArabidopsis；Ll 5、AtDADItraasgen[e Arabidopsis．The AtDAD1wa5 8rrowed
out B Northern blot identification． L0t wild—type Arabidopsis L1—4 t AtDAD1 transgeni~Arabidopses．The At—
n^Dj was自rrowed OUt
图 1 AtDADI转基因拟南芥的检测
Fig．1 The identifcation of AtDADI tranagenic plant by genome PCR and Northern blot
2．2 转基因植株与野生型植株表型的比较
将 AtDADt超量表达T3代纯台体拟南芥和野
生型拟南芥在含有 1／2 MS培养基的平板上筛选，萌
发后，移栽到蛭石中 由图2：A～D可以看出，在幼苗
期+超量表达 AtDAD1的植株叶片较野生型植株叶
片更长更宽，叶片稍厚，成熟后开花稍早于野生型拟
南芥。结果表明，超量表达AtDADI的拟南芥生长发
育略快于野生型拟南芥，AtDADj在植物悼生长过程
中起一定作用，它的超量表达使拟南芥生长更强壮。
2．3 转基因植株与野生型植株种子萌发率的比较
分别采用含有 浓 度为 25、50、75、100、125、
150 mmol／L H 0 的 1／Z MS液体培养基进行滤纸
上的萌发实验，同时以不加 H O 的 1／2 MS液体培
养基作为对照实验，统计结果见表 1。结果显示：当
培养基中不含 H O 时，AtDADj转基因拟南芥和
野生型拟南芥萌发时间和萌发率接近一致；当培养
基中 H zO 浓度为 50 mmol／L时，野生型拟南芥萌
发时间明显晚于 AtDAD1超量表达的转基因拟南
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第 5期 臂毒钵 荨：拟南芥 ．Itt9 I 』衄 茬进髓悻封 Tl：(1 抗性的研究
表 1 不同浓度 I1：lI：对两者萌发率的影响
rahk l t，c rmil1al⋯ ⋯1 Il¨‘ cr d1II⋯ nl d{’sa
of¨．O lrealm nl
．． ．
2 4 高浓度 H O 对转基因植株与野生型植株幼
苗的伤害
造取 8 d刚 长 出两 片真 叶 的幼 苗，诬 泡 于
1 ]⋯II l几 的 H ()：巾，24}1儿j．进行 FDA 染色。
染包结果如图 3所示，经过 H ()处理c对照)的野生
型幼苗 叶计和转基围幼 叶 片有叫亮的黄绿色荧
光．两者无u月显差异；经过 H 0 处理的野生型幼苗
叶¨和转基四幼苗叶片相比较，野生型幼苗叶片黄
绿色荧光强蹇低于转基田幼苗叶片 结 表J月，经过
高浓度的 H () 处理后，．ItDAD，超量表过植株／1、
茁的叶片细胞活力高于野叶三型。
A～H l¨u⋯ IL／L H )处理 r阿井【L1 川赴 1^山 牲 A B、E．F为野生型拟 甫井叶片 C、f)．G、H 为
． ItDAD暗}基旧拟 并叶片‘A B．(’、D为 H ()处 Ⅱ十片后 FDA 色脯 咔．E、F、G I 为 H 【) 处理叶片后
FDA粜也照片；敝^倍数 ：A (’，E．G均为 l3．2x；B，D、F．H均为 66×
A t{Thc eompariso．0I leaf c n viaI)1I ty under l00 mmol，I H O：Lreatment．A，B．E．F．1he leavcs
wild—type Arabtdop,li*-(’·D·【，·H·the I⋯ 9 of AtDADI t r J1 genic Arabid, “t A _n J J_D 山 FDA xtai*dng
lrabidopltf k⋯ 5 afle r【rc日ted with H ()For 24 h；E t0 H．thc FDA staining Aralid,lp~ts ieaves an r
treated wilh II)O mmol／1 1I，(J，f．r 24 h Magnificadon·A·C·E．G 1 3 2×{B·D·I ，H 6fix
囝 3 100 mmol IIlOI址理下两者叶 片细胞活力比鞍
Fig 3 Th ~oHlpa~【s0n of l Ⅱf c l_viaNl⋯ Ill r 1 rm mmol／I．}I=【)：I r a{I】1c⋯
2 5 转基因拟南芥叶片与野生型拟南芥叶片可溶
性总糖含量的比较
选取『。剧龄的植株．酒车=Ii拇取可溶睦0特．删得
每株精含量瞄，再取 岜们的平均值．比较转挂 随株
与野生 艟林叶片,rl溶 性 牿，结果如裘2所示．前者
约 翥的1 I倍 已仃研究点l j枯 叶片衰哲和细
咆死亡的过程1l 有重要的佯用和意义． 而卒吏验
表明．AtDAD1丝 的罐址表达可能与植林牿等量增
加相关．进而在拟南芥抵抗训亡的 』 中发挥怍埘。
3 讨论
细咆删亡是技 在各种生物俸体 的一种积极
表 2 总糖含量的比较
Table 2 The⋯ p＆r ‘⋯ f su r l】⋯ ⋯ wild tyl~
Ar,t&dopsis nd AtDAD 7 tr{I⋯ ⋯ ic lrabtdopsi~
情 件编号
平
精 最(!rig／rag r厦)
r ∞m I f ’ ar
0 0 O O 0 0 O 0 0
n 0 0 0 0 0 O 0 D
姑 吣 ∞ ∞ 雌
0 O 0 0 0 0 0 O
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378 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
主动的细胞死亡过程E。 ]。动物 PCD机理研究较为
透彻，而对于植物 PCD的基因调控还知之甚少。研
究表明，PCD贯穿于植物体整个发育过程，并在植
物体抵抗外界刺激 中发挥重要作用，因而对植物
PCD的研究已经成为生物学领域研究的热点之一。
在超敏反应(hypersensitive response，HR)中，必须
破坏被病原体感染的宿主细胞 ，从而改变病原体的
生存条件环境，才能使植物获得整体的生存，而这种
以牺牲少数细胞为代价的行为就是通过 PCD来实
现的E 引。
DAD1基因最早是在仓鼠中得到的，随后，在其
他生物体中也陆续发现其同源基因。在植物中不同
物种 DAD1同源基因表达模式也不尽相同，柑橘
DAD1同源基因和拟南芥中DAD1同源基因是随
着花和叶片的衰老表达量逐步减少的E" 引，而苹果
DAD1同源基因是随着花和叶片的衰老表达量逐步
增加的[1]。Northern杂交表明，AtDAD1在拟南芥
根、茎、叶、花、角果[17,19]等所有组织中均有表达，没
有组织特异性。在 35 S启动子下，将 AtDAD1与
GFP构成融合质粒(p35S：DAD1一EGFP)，转化洋葱
表皮细胞进行 AtDAD1的亚细胞定位，发现 Af—
DADj定位在内质网(endoplasmic reticulum，ER)
膜上[1 。文献报道，H。O。可以诱导 PCD，且在由一
些其他胁迫 引发 的 PCD 中，也检测到 生物 体中
H O 含量的提高。如 ，莴苣叶子的导管细胞中和衰
老的豌豆叶子中均发现有 O。一和 H。O。等活性氧中
间体(ROI)的积累。Demura和 Fukuda在百日菊的
叶肉细胞被诱导分化成导管时，发现在 NADPH氧
化还原酶作用下产生了大量的O。一和 H。O。，从而诱
导了 PCD发生。在 HR反应中，由于氧化跃升(ox—
idative burst)，同样造成了O。一和 H2O2的积累。缺
氧条件却抑制了HR反应中的细胞死亡。由此表明
活性氧很可能是植物PCD的通用诱发因子。本研究
显示 ，超量表达 AtDAD1的拟南芥比野生型拟南芥
更为强壮，对 H。O。的抗性也明显高于野生型，因而
推测 AtDAD1在拟南芥抵抗凋亡的过程中可能起
重要作用。另外，哺乳动物 DAD1编码蛋白质寡聚
糖转移酶复合体的一个亚基，此转移酶定位在 ER
膜上的 N链接的糖基化的一个关键酶[ha0,n]，也有
研究表明糖在叶片衰老，细胞死亡过程中起重要作
用Ll引，因此我们比较了转基因拟南芥与野生型拟南
芥叶片中的可溶性总糖含量，发现转基因植株叶片
含糖量高于野生型植株叶片。这一结果显示拟南芥
AtDAD1可能具有增强植株抵抗凋亡的能力，而且
还可能通过某种影响糖含量的方式在拟南芥叶片衰
老的过程中发挥重要作用。进一步的研究将对了解
AtDAD1在拟南芥正常发育过程中及对抗环境压
力中的重要作用有重要意义。
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