全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(6)：612—618
Journa／of Wuhan Botanical Research
图像反卷积复原技术在玉米 45S rDNA
转录图式研究中的运用
温若愚，唐燕城，马璐，李立家
(武汉大学生命科学学院 植物发育生物学教育部重点实验室，武汉 430072)
摘 要：由于成像焦平面外杂光的干扰，宽场荧光显微镜所得的图像往往较模糊，使其不适合用来观察植物细胞核
内的精细结构。该实验讨论了反卷积软件中对图像复原结果有较大影响的几个重要参数的设置。经过合适的图
像反卷积复原 ，由宽场荧光显微镜获取的玉米45S rRNA原位杂交信号图像得以清楚显示。对所得杂交图像的分
析表明：玉米45S rDNA转录往往先发生在核仁外围，且随着核仁转录活性的提高逐渐向核仁内部扩散，并最终与
5S rRNA一起，在核仁内部的空洞结构中形成成熟rRNA。研究结果显示，反卷积复原可有效提高宽场荧光显微镜
所得二维图像的分辨率，从而使宽场荧光显微镜在植物细胞核内精细结构研究中发挥更多的作用。
关键词：反卷积；45S rDNA转录；ImageJ软件
中图分类号 ：Q-334 文献标识码 ：A 文章编号：1000．470X(2007)06．0612．07
The Application of the Image Deconvolution Technique to the Study of
the M aize 45 S rDNA Transcription Pattern
WEN RUO—Yu，TANG Yan．Cheng，MA Lu，LI Li．Jia
(Key Laboratory ofMOEforPlantDevelopmentalBiology，Collegeof Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，China)
Abstract：Due to the effect of the out．of-focus fluorescence。images gained by a wide—field fluorescence
microscope were usually too hazy to be used in observing the fine structure of the plant nuclei．In this
study．we discussed several important parameters which heavily affect the results of image deconvolution．
After proper image deconvolution restoration．the images of the maize 45 S rRNA situ hybridization
signals were clearly displayed．The analysis of the hybridization imag es showed that the transcription of the
maize 45 S rDNA gene was initiated in the dense fibrillar component (DFC)。then transferred to the
nucleolus inner space as the nucleolus tran scription activity increased．and finaly combined with the
5S rRNA to form the mature rRNA in the nucleolus cavity．The results showed that the application of the
image deconvolution restoration technique could efectively improve the resolution of the two．dimensional
image gained by a wide．field fluorescence microscope．and thUS made the wide．field fluorescence
microscopes more useful in observing the fine structure of the plant nuclei．
Key words：Deconvolution；45S rDNA transcription；ImageJ software
rRNA基因(rDNA)转录生成的 rRNA是核糖体
结构中重要的组成物，为氨基酸合成多肽链时的直
接催化物。对 rRNA基因及其转录的研究具有重要
的生物学意义。rDNA转录物往往会在核仁中形成
特定图式，对 rDNA转录图式的研究有助于解释
rRNA前体在核仁内的剪切过程。由于核仁结构是
细胞核内非常微小的亚细胞器结构，rDNA转录图
式的研究对观察手段有较高要求。早期此类研究往
往需要借助于电子显微镜等大型超微结构观察仪
器。之后，随着激光扫描共聚焦显微镜的发展，用光
学显微镜来研究核仁结构及其内部组件也渐渐流行
起来。而最近，随着数字成像技术和计算机硬件软
件的迅猛发展，使用宽场荧光显微镜来进行此类研
究也成为了可能。
宽场荧光显微镜是当前细胞形态学研究中最为
普遍的观察仪器之一。相比较于激光扫描共聚焦显
微镜、电子显微镜等大型显微设备，宽场荧光显微镜
具有样品处理简单 ，操作简便以及成像快速等特点。
收稿EI期：2007—05．10，修回EI期：2007-07—30。
基金项目：长江学者和创新团队发展计划 ；国家自然科学创新研究群体科学基金资助项 目 (30521004)；国家 自然科学基金资助项 目
(30571031)；湖北省自然科学基金资助项 目(2005ABA097)。
作者简介：温若愚(1981一)，男，硕士研究生，从事植物分子细胞遗传学研究(E-mail：ruoyuwen@gmail．eom)。
} 通讯作者(Authorfor correspondence．E—mail：ljli@whu．edu．cn)。
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第6期 温若愚等：图像反卷积复原技术在玉米45S rDNA转录图式研究中的运用 613
不仅如此，宽场荧光显微镜一次成像的特点使其更
适合观察微弱荧光和活生物样品 J。宽场荧光显
微镜的一个明显缺点是其无法消除显微光学系统对
光波的衍射效应以及成像焦平面外杂光的干扰。因
此宽场荧光显微镜所得的图像往往比较模糊，不适
合直接用于显示亚细胞器的精细结构。图像反卷积
复原技术是一种把显微系统所得的模糊图像根据其
自身点扩散函数 (point spread function，PSF)通过
数学计算进行复原的方法，该方法能显著提高宽场
荧光显微镜所得图像的清晰度。
图像反卷积复原所采用的算法是图像反卷积复
原效果的关键。现有的图像反卷积算法主要分为去
模糊法、线性复原法和约束迭代法三类 ，3 。去模
糊法速度很快，但易引入结构性假像，不宜用于测量
和计算。线性复原法速度较快，复原效果较好，但会
放大噪声和出现振铃，而引人参数对噪声和振铃进
行控制时又会降低图像锐度，因而线性复原法往往
用来进行反卷积效果快速浏览或是用于观察活的生
物和进行实时连续观察。线性复原法的代表算法有
Wiener算法和Tikhonov算法 等。约束迭代法运
算复杂，速度较慢，但复原能力强，分辨率高，并且通
过对迭代次数也就是收敛度的调节可取得复原效果
和消耗时间之间的平衡 。约束迭代法的代表算
法有最大期望值算法 (expectation maximization，
EM)和盲反卷积算法(blind deconvolution)。籍于
计算机软件和硬件的快速发展，能满足不同的图像
处理需求。基于各种反卷积算法的多种图像软件已
被开发 出来 。由 Dougherty 编写 的 herative—
Deconvolve一3D插件提供了属于迭代算法的DAMAS
(deconvolution approach for the mapping of acoustic
sources)算法。同时Dougherty还编写了与该插件
配合使用的、用于计算镜头理论点扩散函数的 Dif-
fraction—PSF一3D插件。
目前。国内已有一些关于图像反卷积复原算法
的报道 ．8．9】。而关于宽场荧光显微镜所得图像的
反卷积复原技术在生物学研究中的实际运用则仅见
几例 。¨’n】。且这些运用都采用了基于三维图像的
反卷积复原。比较于二维图像，三维图像的获取和
处理都更为复杂。借助先进的反卷积算法和合理的
反卷积复原参数调节，本文报道了一种基于宽场荧
光显微镜所得二维图像的反卷积复原技术，并运用
该技术研究了玉米 45S rDNA在核仁中的表达图
式。该技术的报道为植物核仁乃至亚细胞器精细结
构研究提供了一种新的，简便有效的研究手段。
1 材料和方法
1．1 植物材料
玉米(Zea mays L。)杂交种‘农大 108’，购于市
场。
1．2 玉米细胞核制备
玉米细胞核悬浮液制备参考赵丽娟等 的方
法，取4％多聚甲醛固定2 h后的健康幼嫩叶片 (黄
化苗，3—4 d)80 mg，加冰冷细胞核提取缓冲液
(10 mmol MgSO4 Bufer 975 L，DTr 1 mg，10％
Trition 25 L)，用锋利的手术刀在放置于冰上的培
养皿中于 3 min内将叶片切碎至尽量细小 的匀浆
状。将此匀浆混合液在 33 tun孔径的尼龙膜上过
滤到 1 mL离心管中，1478 r／min离心 10 min。沉淀
重悬，此时得到的分散均一的重悬液即是浓度适中
的细胞核提取液，置于冰上直接用于荧光原位杂交
或是置于 4~C保存。除进行 45S rDNA杂交对照所
用溶剂为去离子水外，本步骤以及以下所有步骤溶
液配制时所用溶剂均为0．1％ DEPC水。
1．3 荧光原位杂交和检测
碱裂解法提取的45S rDNA质粒 DNA 用地
高辛一11一dUTP以切刻平移法标记得到大小为 100～
600 bp的DNA探针。45S rRNA的荧光原位杂交和
检测参考Li等 和Higheu等 的方法。取细胞
核悬浮液40 L均匀涂布于多聚赖氨酸处理后的载
玻片上。室温凉干备用。作 45S rRNA杂交时，取
40 L杂交液(50％的去离子甲酰胺，10％的硫酸葡
聚糖，2×SSC，50～100 ng／ L ssDNA)置于 PCR仪
中85％变性5 min，取出后迅速置于冰上冷却5 min。
冷却后的杂交液迅速吸出滴到冰冻过的细胞核涂片
上．22 nln×22 nln盖玻片，于保湿皿中37~C杂交
12～48 h。作45S rDNA杂交时，所用细胞核悬浮液
在涂片前先加 RNase A于 37~C放置 2～3 h去除
RNA。并且探针置于载玻片上与细胞核涂片于85℃
保湿皿中共变性，其余步骤和试剂与45S rRNA杂
交相同。而作 45S rRNA阴性对照杂交时，所用细
胞核悬浮液同样用 RNase A于 37~C放置 2～3 h去
除RNA，其余步骤和试剂与45S rRNA杂交相同。
所有杂交 的检测步骤都相 同：2×SSC在室温及
37~C各洗 10 min，l×PBS室温洗 1次，加入抗地高
辛——FI1rc(fluorescin lsothiocyanate)抗体，37~C下
温育40 min，再用 1×PBS室温洗 3次，每次 5 min。
1．4 显微系统和图像获取
杂交后的细胞核制片用 5 txL／mL DAPI(4’-l5一
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第 6期 温若愚等：图像反卷积复原技术在玉米 45S rDNA转录图式研究中的运用 615
A～F．由不同数值孔径值计算得到的点扩散函数的图像反卷积复原结果：迭代收敛度均设为0；所用激发光波长值均为480 nm；所
用数值孔径值分别设为：A．1．20，B．1．25，C．1．30，D．1．35，E．1．40，F．1．45。G．玉米 45S rRNA杂交信号原始图像。H～L_由不
同激发光波长值计算得到的点扩散函数的图像反卷积复原结果：迭代收敛度均设为0；所用数值孔径值均为 1．35；所用激发光波长
值分别设为：H．330 nm，L 380 nm，J．430 nm， 480 nm，L．6OO nm。M～R．以不同迭代收敛度得到的图像反卷积复原结果：所用数
值孔径值均为 1．35；所用激发光波长值均为480 nm；迭代收敛度分别设为：M．50％，N．10％，0．1％ ，P．0．1％，Q．o．Ol％，R．0
A—F．The image deconvolution results of diferent PSF that calculated from various Numeficfl Aperture (NA)vflues：fll tl1e iterative conver-
gence vflu~ were setto0 and allthe excitation wavelength values were setto480 nm：the NA vflues were setto：A．1．20．B．1．25．C．1．30。
D．1．35。E．1．40，F．1．45．G．The original image of the maize 45S rRNA hybridization 8igna1．H —L．Th e image dcconvolution ~esults of
diferent PSFtl1at cflculatedfrom valiOUs excitationwavelength values：altheiterative convergence vflues were setto0 and alltheNA vflues
were setto 1．35；the excitation wavelength vflues were set to：H．330 nm。I_380 nm。J．430 nm．K．480 nm．L．6OO nm．M—R．The image
deconvolution results gained with diferent iterative convergence values：fll the NA values we set to 1．35：and all the excitation wavelength
valuesweresetto480 nnl；theiterative convergence vfluesweresetto：M．5o％，N．10％，O．1％，P．0．1％，Q．0．Ol％，R．0
图2 不同参数设置下的图像反卷积复原结果
Fig．2 Image deconvolution results under diferent parameter setings
验都选择480 Ilm作为激发光波长值。图2：M～R
显示了以不同迭代收敛度得到的图像反卷积复原结
果。可以看出反卷积复原后的图像随着迭代收敛度
的减小也就是迭代次数的增加而逐渐清晰，但收敛
度为0．1％的复原图像(图2：P)与收敛度为0．O1％
的复原图像(图 2：Q)区别已经很小，而收敛度为
0．O1％的复原图像(图2：Q)与收敛度为0的复原图
像(图2：R)则几乎没有区别。据此，后续实验都设
置迭代收敛度为0．O1％。
2．3 玉米45S rDNA转录图式与核仁面积大小相关
图3：K～T显示了反卷积复原后的玉米苗期幼
嫩叶片细胞核不同大小和种类核仁的45S rRNA杂
交信号图像。而图3：A～J则是对应的宽场荧光显
微镜所得的原始图像。图3：K、L显示的小核仁细
胞核杂交信号均在核仁外围形成一个未封闭的圆
环，且环上的信号强度分布不均匀。图3：M～O显
示的中等大小核仁细胞核杂交信号则均在核仁外围
形成一个封闭的圆环，且环上的信号强度比较均匀。
它们的信号环上都会出现一个亮点，且环内的核仁
空间出现两个与环相连的靠近信号环(图3：M，O)
或已伸出信号环(图3：N)的点状信号。这些点状
信号与Beven等 引¨在豌豆核仁内空洞结构中观察
到的 U3和 U14 snoRNA杂交信号类似。图3：P～R
显示的大核仁细胞核杂交信号图除在核仁外围具有
均匀封闭的信号环外，还在环内核仁空间具有与信
号环相连的笼状结构。该结构与 Highet等 ¨所得
的豌豆 5S rRNA杂交信号类似。而从图3：S、T可
以看出，双核仁细胞核中的每一个小核仁面积都比
较小。它们的45S rRNA杂交信号图像或者与小核
仁细胞核(图3：s，图3：T左边小核仁)上的图像相
似，或者与中等大小核仁细胞核(图3：T右边小核
仁)上的图像相似。且图3：T上显示的两个小核仁
信号中间有细微连接。
3 讨论
通常RNA荧光原位杂交都是用灵敏度更高、结
合力更好的单链 RNA作为杂交探针 ¨。但单链
RNA探针比较于 DNA探针更难以制备和保存。
rRNA在细胞核中大量转录，丰度很高，对探针的灵
敏度要求并不高。所以本实验尝试用更易用的45S
rDNA探针来进行 45S rRNA的荧光原位杂交。杂
交程序基本按照本实验室已有的玉米 DNA荧光原
位杂交方法 ¨，参考 Highet等 纠¨的方法，通过对
细胞核制片的RNase处理及变性处理的控制，同一
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616 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
A—J．玉米 45S rRNA杂交信号原始图像。K—T．与A—J对应的反卷积复原信号图像：K，L．小核仁细胞核杂交信号图；M一0．中等
核仁细胞核杂交信号图；P～R．大核仁细胞核杂交信号图；s，T．双核仁细胞核杂交信号图标
A—J．0ri西nalimages ofthemaize45S rRNA hybridization signa1．K—T．The coresponding deconvolved signalimages ofA—J：K，L．Signal
images of the nuclei with sma1]size nueleolus；M —O．Sign~ images of the nuclei with middle size nueleolus；P—R．Signal images of the
nuclei with large size nudeolus；S，T．Signal images of the nuclei with double nucleoli
图3 不同大小和不同种类玉米核仁的45S rRNA杂交信号图像
Fig 3 45S rRNA hyb~idization signal images of Inaize nucleolus with diferent sizes and types
杂交条件得以分别完成细胞核的 DNA杂交和 RNA
杂交。图1结果显示 ，用45S rDNA探针进行的玉米
45S rRNA与45S rDNA杂交互不干扰。并且图 1、
图2、图3中显示的45S rRNA荧光原位杂交信号均
清晰明亮。这些结果都说明，45S rDNA探针可有效
运用于荧光原位杂交检测玉米45S rRNA。
显微镜镜头的理论点扩散函数通常由介质折射
率、镜头数值孔径、激发光波长以及图像像素距离等
决定。其中，介质折射率以及图像像素距离等参数
都已有确定的数值，而镜头数值孔径值以及激发光
的波长都是计算宽场荧光显微镜镜头理论点扩散函
数需要调节的参数。因为尽管显微镜所用镜头通常
都会有一个该镜头在理想使用条件下的数值孔径标
称值，但实际实验条件下镜头的数值孔径往往会与
标称值产生误差。而对于激发光波长，由于宽场荧
光显微镜所用光源通常都是发出连续波长激发光的
高压真空汞灯，所以激发光波长参数的调节和检验
也是必须的。由图2所示的图像反卷积复原结果得
出的理想镜头数值孔径值和激发光的波长分别为
1．35 nm和480 Ilm，这与实验所用镜头的数值孔径
值和所用标记荧光蛋白的激发光峰值波长几乎一
致。实际上根据镜头标称参数计算得到的二维点扩
散函数往往是准确的 J，但由于恰当的点扩散函数
是图像正确反卷积复原的基础，对理论点扩散函数
的可调参数的验证仍然是必要的。当然，如果实验
条件允许，用微小荧光球在显微系统上直接得到的
镜头实际点扩散函数图像仍然是最佳选择。除镜头
数值孔径值以及激发光的波长外，迭代收敛度同样
对图像反卷积复原效果有很大影响。但其与上述两
个参数的一个很大区别是，在得到准确点扩散函数
的前提下，迭代收敛度的调节并不会引人新的图像
畸变。因此，通过对迭代次数的调节可以正确有效
地掌握图像复原效果和消耗时间之间的平衡。由图
2：M—R显示的结果可以看出，当迭代收敛度达到
0．1％时，图像已得到较好复原。而当迭代收敛度达
到0．01％时，图像复原度几乎已达到极限。在本次
实验中，设迭代收敛度为 0．01％时，迭代次数往往
接近3O次；而设迭代收敛度为0(极限值)时，迭代
次数往往接近 8O次。在三维图像的反卷积过程中，
一 次迭代可能会耗时长达数十分钟 ¨。因此在实
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第6期 温若愚等：图像反卷积复原技术在玉米45S rDNA转录图式研究中的运用 617
际操作中，选择合适的迭代收敛度往往可以大幅度
提高工作效率。
玉米45S rDNA重复序列一个重复单位的全长
约为9 kb。从 5’端到 3’端，该9 kb重复单位的组
成部分依次为：非转录区间隔序列(nontranscribed
spacer，NTS)、5’端外部转录区间隔序列(5’external
transcribed spacer，5’ETS，也常称为 ETS)、18S序
列、内部转录区问隔序列 l(internal transcribed
spacer 1，ITS1)、5．8S序列、内部转录区间隔序列2
(internal transcribed spacer 2，ITS2)、28S序列和 3’
端外 部转 录 区间隔序列 (3’external transcribed
spacer，3’ETS)。玉米 rRNA基因转录出的rRNA前
体需要进一步剪切和加工才能形成成熟的 rRNA。
45S rRNA前体剪切的第一步是 5’ETS序列的剪
切，之后的切除 ITS1序列，得到 18S rRNA，最后切
除ITS2序列，得到5．8S和28S rRNA。剪切各步得
到的 rRNA最后同5S rRNA一起参与到核糖体的装
配中。45S rDNA转录物各组分在核仁中的精细定
位对于研究 rRNA的剪切加工过程有着重要意义。
已有植物45S rRNA前体在核仁内剪切过程研究的
详细总结可以参考 Shaw等 和 Raska等[2 的论
述。其中，Shaw等 纠¨的研究表明。豌豆 45S rRNA
原位杂交信号大多呈现为定位于核仁外围的环状结
构或是由环状结构向核仁内伸出形成的笼状结构。
Beven等 ¨结合荧光原位杂交技术与电镜技术对同
一 核仁进行的研究验证了这一结果，并且表明，豌豆
45S rRNA与豌豆核仁的致密纤维组分的定位几乎
重合。同时 Beven等 副¨对 snoRNA与 45S rDNA序
列中含有的外部转录间隔序列 (external transcribe
spacer，ETS)的共定位研究结果还显示，豌豆 U3和
U14 snoRNA分子都大量存在于环状致密纤维组分
内。并且在核仁内部的空洞中也有一些点状信号存
在。ETS序列是45S rRNA前体剪切过程中第一个
剪切 出的组件 ，所 以 ETS序 列 所 在位 置 即是
45S rRNA前体早期剪切发生的地方。该结果表明，
豌豆 U3和 U14 snoRNA分子主要参与了位于核仁
外围的45S rRNA前体早期的剪切过程，并且核仁
内部的空洞中点状信号的存在显示其部分参与了
45S rRNA前体在核仁内部的进一步加工。本实验
所用探针为地高辛．1 1一dUTP标记的45s rDNA质粒
DNA。由于该质粒DNA包含了玉米45S rDNA的全
长序列，因此标记该质粒得到的荧光探针可以同时
显示整段45S rRNA前体序列以及剪切加工过程中
先后得到的各个45S rRNA前体组件。根据 Highet
等Ⅲ 的研究结果，同一组织(Pisum sativum根尖)不
同细胞核内45S rRNA基因的表达活性各不相同。
核仁大小与细胞核中45S rRNA基因的表达活性直
接相关，核仁越大其转录活性越高。因此，图3：K、L
所示的小核仁转录活性较低，其 45S rRNA杂交信
号都呈现为核仁外围的未封闭的圆环。据此我们认
为，玉米 45S rRNA的转录起始于核仁外周的致密
纤维中心，在玉米核仁转录活性较低时，大量转录产
物富集于核仁外围的致密纤维中心。等待 U3和 U14
snoRNA分子的剪切加工。同样，图3：M～O的中等
大小核仁45S rRNA杂交信号显示，当核仁转录活
性提高时，原来富集于外围的 45S rRNA前体开始
在 U3和 U14 snoRNA分子的辅助下进行剪切和加
工，其产物也逐渐向核仁内部转移。图3：M～O中
信号环周围及核仁内部，与 Beven等【】引所得 U3和
U14 snoRNA杂交信号类似的点状信号的存在支持
了这一推论。而图3：P～R中大核仁上所显示的与
Highet等 ¨所得 5S rRNA杂交信号类似的笼状信
号表 明，随 着 核 仁 转 录 活 性 的进 一 步 提 高，
45S rRNA前体最终在 snoRNA的参与下，同5S rRNA
一 起在核仁内部的空洞结构中形成成熟的rRNA产
物。植物细胞核内一般只会存在一个核仁结构，但
偶尔也会出现具有双核仁甚至多核仁的细胞核。同
一 细胞核内的多个核仁有时还会融合在一起形成单
个核仁。植物细胞核内核仁数目的变化产生的原因
及机制尚无详细报道。图3：S中两个分开的双核仁
显示出与图 3：K～T类似的45S rRNA杂交信号图
像，而图3：T中相接的双核仁中的一个则显示出与
图3：M～O类似的45S rRNA杂交信号图像。这些
结果暗示。玉米细胞核内多个核仁的融合可能同时
伴随有核仁转录活性的提高。
对玉米 45S rDNA转录图式的深入研究还需要
更多rDNA探针和snoRNA探针对45S rDNA各组分
在核仁中定位的显示。但本实验所得结果已可有力
证明，反卷积复原可有效提高宽场荧光显微镜所得
二维图像的分辨率。反卷积复原后的图像已可用于
初步研究植物 45S rDNA在核仁中转录图式。
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