全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(4)：334～338
Journal of Wuhan Botanical Research
多炔化合物氧化胁迫下稗草细胞保护酶系的反应
万树青 ，杨淑娟 ，蒋志胜 ，尚稚珍 ，刘 准
(1．华南农业大学资源环境学院，教育部农药、化学生物学重点实验室，广州 510640}
2．南开大学元素有机化学国家重点实验室，天津 300071)
摘 要：用多炔类化合物 1一苯基一4一(3，4一亚甲二氧)一苯基丁二炔(简称化合物 5)处理稗草(Echinochloa crusgalli)
愈伤组织，经紫外光(320~400 nm)照射后，诱导细胞内形成氧化胁迫环境。利用生化酶学方法 ，测定几种保护酶
系在氧化环境下的活性变化 。发现经化合物 5和照光处理后，可诱导激活细胞内的谷胱甘肽一S一转移酶(GsT)、谷胱
甘 肽过氧化物酶(GSH—Px)和过氧化物酶(POD)的活性，而超氧化歧化酶(SOD)则表现为活性受抑制。以 0．1～
10 mg／L的浓度处理 ，所测GST、GSH—Px和 POD的照光诱导活性明显高于未经照光处理的活性 。其中以 10 mg／ L
的浓度处理 ，照光所提高 3种酶活性的百分率分别为 1O．47 oA、113．68 oA和 166．68 。以 1 mg／L和 10 mg／L的浓
度处理，照光对 S0D的抑制百分率分别为5O．25 和 76．46 。测定结果表明：在外源光敏物质引起细胞内的氧化
胁迫环境下 ，可激活细胞 内保护酶的活性 ，用于抵御氧化逆境对细胞的损伤。而 SOD则可能是化合物 5光活化抑
制稗草生长的生化作用靶标酶之一。
关键词：1一苯基一4一(3，4一亚甲二氧)一苯基丁二炔；稗草；保护酶系
中图分类号 ：Q946．5 文献标识码：A 文章编号 ：i000—470X(2004)04—0334—05
Response of Protective Enzyme in Callus of Barnyard Grass under
Oxidizing Stress Induced by Polyacetylene Compound
W AN Shu—Qing ，YANG Shu—Juan ，JIANG Zhi—Sheng。，SHANG Zhi—Zhen。，LIU Zhun。
．Key Lab．ol Pesticide，Chemistry—Biology ol Ministry ol Education，South China Agricultural University，
Guangzhou 510642，China}2．Institute 0l，Element—Organic Chemistry，Nankai University，Tianjin 300071，China)
Abstract：The callus of barnyard grass (Echinochloa crusgalli)was treated with compound 5
(1一phenyl一4一(3，4一methy1enedioxy)一phenyl—diacetylene)under UV—A irradiation for 3 h，which
forms an inner environment of oxidizing stress in the cells． Exploiting the method of bioche—
mistry，we assay the activity of severa1 protective enzymes in the oxidizing stress． The results
showed that compound 5 can stimulate the activity of glutathione—S—transferase(GST )，
glutathione peroxidase(GSH—Px)and peroxidase(PoD)and inhibited the activity of superoxide
dismutase (SoD)under UV—A．The activities of GST，GSH—Px，and POD under 1ight were
higher than those under non—light．The enhanced percentages of GST ，GSH—Px，and PoD at the
concentration of 10 mg／L under light were 10．47 ，113．68 and 166．68 ，but SoD was
inhibited at 1 mg／L and 10 mg／L，the inhibiting percentage was 50．25 and 76．46 ，respec—
tively．The relationship between compound 5 oxidization and anti—oxidization was discussed in the
paper·
Key words：1-phenyl-4-(3，4-methy1enedioxy)一phenyl—diacetylene；Echinochloa crusgalli；Protec—
tive enzyme
收稿 日期：2003—10—12，修回日期：2004—04—09。
基金项目：广东省 自然科学基金资助项目(990703，010319)}南开大学元素有机化学所国家重点实验室资助课题(2002)。
作者简介：万树青(1953一)，男，博士 ，副教授，研究方向为农药生物学(E—mail：wanshuqing1953@yahoo．com．cn)。
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第 4期 万树青等 ：多炔化合物氧化胁迫下稗草细胞保护酶系的反应 335
多炔类化合物(Polyacetylene)是一类重要的植
物次生代谢产物，从菊科植物鬼针草 (Bidens
fzD z)中分离出的 7一苯基 2，4，6一庚三炔(Phenyl—
heptatriyne PHT)为一种光敏化合物。研究表 明：
PHT对昆虫具有拒食、忌避和抑制生长发育作用，
特别对多种传病蚊蝇具有光活化毒杀作用[1]。徐汉
虹等[2 从菊科植物猪毛蒿(Artemisia scoparia)中分
离 出具 有光 活化杀 虫作 用 的化合 物一茵 陈二炔
(Capilene)，并以茵陈二炔为结构母体，人工合成系
列多炔类化合物。通过生物活性筛选，发现化合物 5
(1一苯基一4一(3，4一亚甲二氧)一苯基丁二炔)比天然的
茵陈二炔化合物对蚊、红蜘蛛具有更高光活化毒杀
活性[3]。经光活化除草生测发现，化合物 5对稗草、
莎草等植物具光活化抑制生长作用[43。对其作用机
理研究发现，当化合物 5溶液中加入一定量的抗氧
化剂谷胱甘肽时，可降低它对蚊幼虫的毒杀效果[3]。
电镜下观察，在有光的条件下，化合物 5可造成细胞
膜、细胞核膜的严重损伤[4]。运用 自旋电子共振技
术，测得化合物 5处理的稗草愈伤组织，照光后可诱
导细胞内产氧 自由基总量增加[4]，表明化合物 5在
有紫外光的作用下，可诱导细胞内活性氧的增加，造
成细胞内的氧化胁迫环境，严重时可引起细胞氧化
坏死。
本研究以化合物 5处理稗草愈伤组织结合紫外
光照光，使细胞内出现氧化环境。利用生化酶学方
法 ，检测对几种保护酶系的影响，比较它们在抗氧化
中的作用，阐明外源光敏物质引起的氧化胁迫与机
体抗氧化作用之间的平衡机制 ，以期为利用光敏化
合物防治杂草提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 稗草(Echinochloa crusgali)愈伤组织的培养
取稗草幼苗，消毒处理，切成 0．5～1 cm 长片
段，置 MS培养基内，附加 2，4-D 2～4 mg／L。在生
化培养箱内培养，温度(25±1)℃，诱导产生愈伤组
织，并继代培养约 15代，取指数生长期的愈伤组织
作为实验材料。
1．2 试剂
化合物 5，由南开大学元素有机化学研究所刘
准 教授 合 成。元 素分析 ( )(计 算 值)：C 8290
(8290)；H 4．01(4．09)。 HMR(CDC13)艿(ppm)：
6．80～ 7．6O(8H，mC6H‘×2)；5．98(2H．s．CH2)。
MS m／z( )：246(100，M+)，187(27．2)，11O(3．6)。
IR (KBr)cm_。：2199．5，3045， 1596．6，1497．8，
804．3。纯品为白色粒状结晶，熔点 105℃，纯度>
95 。
1．3 材料处理
药剂处理：向稗草愈伤组织分别置入含有0．1、
1、10 mg／L的化合物 5悬浮培养液，(25士1)℃黑暗
处理 10 h，处理后的愈伤组织分为两部分，一部分
移置近紫外光下(15 w／cm。)光照 3 h(照光组)，另
一 部分继续在暗条件下(未经照光组)，经药剂处理
的照光组与未经照光组以及未加药剂的照光与未经
照光处理 ，每种处理 3个重复。
1．4 几种保护酶系的活力测定
1．4．1 谷胱甘肽一s一转移酶(GST)的活力测定
酶源制备：24 h后，称取各种处理的愈伤组织
0．2 g，加适量的50 mmol／L pH 7．0的磷酸缓冲液
冰浴匀浆，在 4"C下，以 10 000 r／min离心 15 rain，
取上清液为酶源。
GST的活力测定主要参考 Habig的方法[ 。蛋
白质含量测定参照 Bradford的方法[6]。酶比活力表
示为：在 340 nm波长下，每毫克蛋白每分钟光密度
变化值，AOD·mg pro·min～。
1．4．2 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)活力测定
GSH—Px活力测定主要参考张嘉麟和荣征星等
的方法[7 ]。酶活力表示为在 412 nm时，每毫克蛋
白、每分钟转化 GSH的量( mo1)，即 t~molGSH ·
mg pro·min～。计算公式为：
GSH—Px活力单位数 一
GsH]非酶管一[GSH]样品管一rGsH]试剂空白管
3X 4 。
1．4．3 过氧化物酶(PoD)活性测定
取各种处理 的愈伤组织 0．2 g，加入 预冷的
0．05 mol／L磷酸缓冲液 1．5 mL冰浴匀浆，匀浆液
在低温下(4℃)12 000 r／min离心 15 min，取上清
液为酶源。
POD活性测定主要参考袁庆华等的方法 ，以
愈创木酚为底物，取 2 L酶液，加入 100 L缓冲液
和 2．8 mL 的 18 mmol／L愈 创 木 酚液 ，再 加入
100 L 3 HzOz溶液，摇匀反应，温度为 25℃。待
光密度值(OD值)增速恒定时记录 470 nm处光密
度值，以每毫克蛋白质每分钟吸光度增值表示酶活
性 。
1．4．4 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
取各种处理的愈伤组织置入 50 mmol磷酸缓
冲液中，内含 1 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)匀桨，
13 000 r／min 4"C离心 10 min，取上清液为酶源。
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336 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
SOD活性测定主要参考张宪政和沈文飚的方
法[io,1]。测定 SOD对硝基四唑蓝(NBT)的还原抑
制作用。
酶比活力一△0D／oDo·50 oA mg protein·min。
OD。：对照管在 560 nm处吸光度值。
AOD：空白对照在 560 nm处吸光度值与加入
酶液反应液在 560 nm处吸光度值的差。
根据不同处理所测酶比活力，计算酶活抑制率。
公式如下：
蕞活抑制率( )=
殴 器 X Io。 对照照光(未经照光)的比活力 ⋯
当所求值为负值时，表明可以诱导激活酶活性。
2 结果与分析
2．1 化合物5对稗草愈伤组织GSH活力的诱导激
活作用
以 0．1、1、10 mg／L浓度的化合物 5处理愈伤
组织，测得照光与未经照光愈伤组织的酶活力变化
情况(见表 1)，在测试的浓度范围内，照光与未经照
光的酶活力都可诱导提高。但照光处理明显高于未
经照光处理。在照光下加入 10 mg／L浓度的化合物
5处理的愈伤组织，与未加入化合物 5的对照相比
可 提 高 GST 活 性 10．47 ，而 未 经 照 光 则 为
6．42 。
表 I 化合物5对稗草愈伤组织GST活性的影响
Table 1 The activity of GST in calus of E．crusgalli is
influenced by compound 5
注；同列数据之间相同字母表示相互差异不显著(Duncan新复
差检验 P<0．05)(下表同)。
Note：Significantly different from the same row with different
letters by Duncan’s multiple range test at P<0．05．The
same as in tables below．
2．2 化合物 5对稗草愈伤组织GSH—Px活力的诱
导激活作用
GSH—Px活力测 定结 果表 明，以 1 mg／L和
10 mg／L浓度的化合物 5处理，照光后能大幅度提
高GSH—Px活力，与照光空白对照比较，酶活性分
别提高为 79．53 和 1l3．68 ，说明化合物有促进
GSH—Px的作用(见表 2)。
表 2 化合物5对稗草愈伤组织GSH—Px活性的影响
Table 2 The activity of GSH—Px in callus of
E．crusgalli is influenced by compound 5
浓度(mg／L) 处理
Concentration Treatrnent
比活力(pmolGSH·mg一 酶活抑制
pro·min一1) 率(％)
(X士SE) Inhibition
Specific activity of enzyme
2．3化合物 5对稗草愈伤组织 POD活力的诱导激
活作用
测定结果表明，在有照光的条件下，化合物 5能
显著地激活 POD的活性。以 0．1、1和 10 mg／L浓
度下处理，所测酶活提高程度虽不存在线性关系，但
在 10 mg／L浓度时，可提高活性为 166．68 oA(见表
3)。表明化合物 5在有光的条件下，除可显著激活
GSH—Px外，还能同时激活 POD的活性。化合物 5
引起稗草细胞内的氧化环境，可被这 2种酶部分清
除。
表 3 化合物 5对稗草愈伤组织 POD活性的影响
Table 3 The activity of POD in calus of E．crusgalli is
influenced by compound 5
2．4 化合物5对稗草愈伤组织SOD活力的抑制作
用
测定结果表明，化合物 5对 SOD的影响主要表
现为抑制作用，随着处理浓度的增高，抑制率呈上升
的趋势。以 0．1、1和 10 mg／L浓度处理，光照后抑
制率分别为26．81 、50．25 9，5和76．46 。而未经照
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第4期 万树青等：多炔化合物氧化胁迫下稗草细胞保护酶系的反应
光处理 的酶 活性 变化与照光处理趋 势相同，在
0．1 mg／L时，抑制率低于照光组，而在1 mg／L和
10 mg／L时，照光与未经照光处理的抑制率无显著
差异(见表 4)。
表 4 化合物 5对稗草愈伤组织 SOD活性的影响
Table 4 The activity of SOD in callus of E．crusgali is
influenced by compound 5
3 讨论
3．1 化合物 5的光活化作用与保护酶系活性的关
系
氧在植物呼吸作用中发挥重要作用，同时，氧可
在机体内代谢或接受激发态光敏化合物分子能量，
使氧转变为更加活泼的活性氧(AOS)，包括超氧阴
离子 O )、单线态氧( O。)、氢过氧自由基(HO。)和
过氧化氢(H。O )。少量的AOS在植物体内能提高
抗病能力和促进生长发育[1引，但过量的 AOS能对
植物造成氧化胁迫，严重时，使细胞产生不可逆的氧
化损伤，导致膜流动性降低和渗透性增强，蛋白质、
酶的功能丧失及 DNA的突变，最终细胞坏死，个体
死亡。当细胞处于氧化胁迫的环境下，可启动各种防
御体系，如激活解毒酶系降解光敏毒素；种类繁多的
抗氧化剂可吸收、转移各类激发态分子能量、猝灭激
发态分子；其中细胞 内的保护酶系在减轻多余 的
AOS造成的氧化损伤中发挥重要作用[1 。
通过系列实验表明，化合物5为光敏化合物，在
有光(近紫外光或太阳光)下 ，能大幅度提高毒杀蚊
幼虫的毒力[3 和增强抑制稗草生长的作用[4]。电镜
下观察，经化合物 5处理的稗草细胞，照光后可造成
细胞结构损伤，其中细胞膜是其主要靶标之一[4]。自
旋电子共振检测，化合物5处理的稗草愈伤组织，照
光后可提高组织细胞内氧 自由基总量的增加[4]。本
研究结果表明，化合物 5在一定的浓度范围内，结合
照光处理，可显著地提高稗草愈伤组织细胞内的
GST、GSH—Px和 POD的活性，表明化合物 5在有
光的作用下，能使细胞内造成氧化胁迫的环境，因
而，植物本能地启动生化防御体系，以减轻氧化压
力。但测得化合物 5对 SOD却具有明显抑制活性的
作用，由于 SOD被抑制，细胞内可积累超氧阴离子。
因此，可以推断化合物 5造成细胞膜的光损伤和光
活化毒杀蚊虫和抑制植物生长是与细胞内积累过量
超氧阴离子有关。抑制 SOD的活性，积累超氧阴离
子并氧化生物分子是化合物 5具有光活化毒杀作用
的主要生化机制。这个实验结果与最近报道的化合
物 5光活毒杀菜粉蝶(Pieris rapae)幼虫的生化机
理是相符的L1引。
3．2 化合物 5作为光活化农药的开发前景
多炔类化合物是植物实现化学防御的重要次生
代谢产物。通过人工合成，从系列化合物中筛选出具
有优良光敏除草活性的化合物 5，该化合物将有可
能成为开发新型光活化农药的先导化合物。常规的
光动力除草剂，如二苯醚类除草剂(三氟羧草醚)和
非二苯醚类除草剂(恶草酮)，它们的作用靶标为原
卟啉原氧化酶。该酶受到抑制后，原卟啉原从叶绿体
中渗出，在细胞质内氧化为原卟啉，当遇光后，可诱
导细胞产生单线态氧，造成细胞氧化损伤，以达到除
草的目的。由于此类除草剂影响卟啉代谢，也将可能
干扰人畜的血红素的合成代谢，遇光后也将会造成
光动力损伤，特别对于卟啉代谢遗传缺陷型病人，杂
质斑卟啉代谢病产生更强毒性效应[1引。因此，就光
动力除草剂而言，化合物 5的作用靶标不同于常规
的光动力除草剂，相对而言，它具有高效、低毒、环境
安全的特点，化合物 5作为新型光动力除草剂将是
有待开发的化合物之一。
参考文献：
[1] Arnason T，Swain T，Wat C K a1．Mosquito lar—
vieidal activity of polyacetylenes from species in the
Asteraeeae[J]．Biochem Syst Ecol，1981，9(1)：63—
68．
[2] 徐汉虹，赵善欢，周俊，丁靖垲，喻学俭．猪毛蒿精油
杀虫有效成分的研究[J]．昆虫学报．1994，37(4)：
411— 416．
[3] 万树青，徐汉虹，赵善欢，尚稚珍，刘准．光活化多炔
类 化合物对蚊幼虫的毒力l-j]．昆虫学报，2000，43
(3)：264— 270．
[4] 杨淑娟．植物源光活化毒素 的除草作用 机理 研 究
ED]．广州；华南农业大学，2003．
[5] Hibig W H． Assays for differentiation of glu—
维普资讯 http://www.cqvip.com
338 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
[6]
[7]
[8]
[9]
ElO]
tathiones—S—transferase[A]．1n：wiUiam B J eds．
Methods in Enzymology[M]．New York：New York [113
Academic Press，1981．77：398— 405．
Bradford M M．A rapid and sensitive method for the
quantitation of migrogram quantitation of protein uti-
．
[12]
lizing the principle of protein—dye binding[J]．Analy—
sis Biochemistry，1976，72：248— 254．
张嘉麟，方允中．血液中谷胱甘肽过氧化物酶活力微
量测 定[J]．中华医学检验杂志，1985，8(4)：199—
201．
荣征星 ，刘慧中，鲍景奇．小鼠全血中谷胱甘肽过氧化 [133
物酶活力的微量测定[J]．生物化学与生物物理进展，
1994，21(4)：362—366． [14]
袁庆华，桂枝，张文淑．苜蓿抗感褐斑病品种内超氧化
物歧化酶、过氧化物酶、多酚氧化酶活性的比较[J]． [15]
草业学报，2002，11(2)：100—104．
张宪政．作物生理研究法[M]．北京：农业出版社 ，
1992． 208— 209．
沈文飚．氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶的
适宜条件[J]．南京农业大学 ，1996，19(2)：101—
102．
Dayan D E．Duke S O．Phytotoxicity of protopor～
phyrinogen oxidase inhibitors： Phenomenology，
Mode of action and mechanisms of resistance[A]．
In：Roe R M eds．Herbicide activity：Toxicology，
Biochemistry and Molecular Biology[M]．Washing—
ton DC：IOS Press，1997．11— 37．
孙存普，张建中，段绍瑾．自由基生物学导论[M]．合
肥：中国科学技术大学出版社，1999．66．
秦小琼，贾士荣．植物抗氧化逆境的基因工程[J]．农
业生物技术学报，1997，5(1)：14—21．
蒋志胜，尚稚珍，万树青，徐汉虹，赵善欢．两种光敏
化合物对菜粉蝶幼虫超氧歧化酶的光敏效应[J]．农
药学学报，2000，3(1)：36—41．
维普资讯 http://www.cqvip.com