全 文 ：第 2 卷 第 1 期
V o l
.
2 N o
.
1
草 地 学 报
A C T A A G R E S T IA S IN C A
1 9 9 4 年
1 9 9 4
超低温 (L N Z , 一 1% “C )贮存牧草种子初探
孙丽萍 宁 怖 包来晓 李临杭
(中国农业科学院草原研究所 , 呼和浩特 , 01 0 010 )
摘要 : 在牧草种子的贮存过程中 , 最重要且最难于解决的间题就是克服所贮存种子的生
理衰变 。 超低温技术(L N : , 于 一 1 96 ℃ 条件 )可以将种子内部新陈代谢降低到一个很低的水平 ,
使所有的生化过程处于“停顿 ”状态 , 这样便可以大大延长种子的贮存寿命 。 本实验将 9 种在常
规条件下难于保持活力的牧草种子放入液氮中贮存一年 , 解冻后测定贮存种子的发芽率 、发芽
指数 、 电导率 、呼吸强度及 A T P 含量情况 。 结果表明 , 禾本科 、豆科、黎科牧草种子属于液氮耐
受类型 , 特别是短命种子驼绒萦与木地肤对液氮贮存表现特别适应 。
关键词 : 超低温技术 ; 贮存寿命 ; 种子活力
1 前言
随着现代农业的发展 , 人们越来越多地依靠新品种来提高作物的产量和质量 。 因此 , 种
质资源的搜集和保存显得尤为重要 , 保存大量的种质资源便可以得到尽可能多的遗传变异
性状 。 在种子的贮存过程中 , 克服其生理衰变是一个非常重要且难于解决的课题 。 低温贮存
(0 ℃以下 )可显著增加种子的贮存寿命 , 然而随着贮存时间的延长 , 种子内部生理衰变和活
力丧失依然存在 , 这必然导致宝贵遗传材料的丢失 。 超低温技术(L N Z 一 1 96 ℃ )可通过将种
子新陈代谢减小到所有生化反应明显降低 、生物学衰变完全停止的水平 , 来提供一个安全保
存条件(P hi li p , 1 9 8 5 ) 。 不仅如此 , 经超低温贮存 、处理的种子还表现出复醒萌芽快 、植株健
壮 、抗病性强等特点 。我国对农作物种子超低温技术的研究工作始于 1 9 8 4 年 , 已取得一些进
展 , 对牧草种子的研究尚未见报导 。 有专家认为 , 应用超低温处理的种子 , 能够培养变异植
株 , 继而培育优良新品种 , 是遗传工程基础理论的一项重要突破 , 意义重大 。
2 材料与方法
实验材料 (表 l) 为禾本科 、豆科 、黎科 、菊科牧草中几种比较具有代表性的不耐藏种子 。
种名
S Pe e ie s
学名
N a m e
表 1 实验种子一览表
T a b le 1 S itu a tio n o f e x P e r im e n ta l se e d s
收种时间 含水量 (% )
T im e o f ha r v e s t C o n te n t o f w a t e r
种子来源
SO u rC e
新疆无芒雀麦
短芒披碱草
星星草
华北驼绒蔡
木地肤
沙篙
苦龚菜
羊柴
红豆草
B ro m u s in er 仇15
El y 阴“s br 改, ia r is ta t u s
P uc ein el la t翻u ifl o ra
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K oc hi a 户r ost ra ta
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e ePh a la
S o n eh u s o le r a c e u s
月‘己夕招 r u m m o n g o lia c u m
口” o br w hi: 厉c ia fo lia
9 0 年 8 月
8 9 年 9 月
8 5 年 8 月
9 0 年 1 0 月
9 0 年 1 0 月
9 0 年 1 0 月
9 0 年 1 0 月
9 0 年 1 0 月
8 9 年 8 月
8
。
6 3
7
.
8 3
7
.
9 2
6
.
2 4
6
。
0 4
7
.
3 3
5
。
7 5
7
.
4 6
6
.
8 0
中国农科院草原所实验场
中国农科院草原所实验场
黑龙江省肇东县
内蒙古巴盟
内蒙古巴盟
内蒙古伊盟
内蒙古巴盟
内蒙古锡盟
中国农科院草原所实验场
第 1 期 孙丽萍等 : 超低温 (L N Z一 196 ℃ )贮存牧草种子初探
寿命都很短 , 在常温条件下只有一年或几年 (宁怖等 , 1 9 2 ) , 对这些牧草种子进行超低温贮
存技术的研究 , 有其应用价值 。
实验种子为收种后 自然干燥 , 水分含量在 5 . 75 ~ 8 . 63 %之间 。 实验采用快速冷冻 、解冻
法 , 即将密闭于塑料冷冻小管中的种子直接放入到液氮罐中 。 贮存期间定期注入液氮 , 保证
试验材料始终置于液相 (一 1 69 ℃ )之中 。 解冻时 , 取出冷冻管 , 放入 38 ℃水浴 , 待小管与水温
平衡 , 取出置于室温备用 。 种子贮存时间为一年 。 解冻后进行种子发芽试验 、 电导试验 、呼吸
强度及 A T P 含量的测定试验 。
3 结果与讨论 表 2 冷冻贮存前后 G % 、Gi 的变化
3
.
1 冷 冻 贮 存 后 发 芽率
(G % )
、发 芽指数 (Gi )的 变
化 从发 芽试验结果可见 ,
除沙篙 、苦美菜以外 , 其它牧
草种子对液氮贮存非常适应
(见表 2 ) 。 华北驼绒黎和木
地肤种子 , 在常温下贮存半
年便失去 活力 , 而在液氮中
贮存一年 , G % 、 Gi 都有增
加 , Gi 增 加显著 , 表明其活
力增强 。 羊柴种子解冻后进
行发芽试验 , 霉烂情况 明显
减少 , G % 、 Gi 显著提高 , 表
明经液氮处理改善了羊柴种
子的发芽条件 。 红豆草种子
T a ble V a r ia t io n
a n d a fte r
发芽率
G e r m in a t io n
o f g e r m in a t io n e a p a e ity b e fo r e
rh e e r yo p r e se rv a tio n
种 名
SPe e ie s
(G % )
Pe r c e n ta g e
发芽指数 (Gi )
G e r m in a t io n in d e x
冷冻前
Be fo r e
冷冻后
A ft e r
对胆
C K
冷冻前
】玉之fo r e
冷冻后
A ft e r
对罗
C K
1758303165892.5
070
叮口
0
ljo
b月1dQ卜
.⋯0八600山,djn乙O叶JQ匕0nj,J0月了dQ月丹了j0.bo口,J.⋯R一,曰njQJ夕10吕八丹O月了内bo以O‘,136790897 671245L新扭无芒雀麦短芒披碱草星星草
华北驼绒蔡
木地肤
沙篙
苦卖菜
羊柴
红豆草
8
.
0 0
65
.
4 2
7
.
3 0
5 3
。
33
2 4
。
4 7
2 2
。
6 1
2 0
.
6 9
6 3
.
1 0
8 5
.
9 0
1 2
.
5 4
1 2
.
5 4
0
.
1 8
2 1
。
9 8
:⋯:
1 6
.
4 3
9 1
.
0 0 1 6
。
9 4
2 9
.
7 6
2 3
.
1 2
1 6
.
1 9
4 9
.
6 7
5 6
.
5 3
4
.
5 6
9
.
0 8
0
.
4 2
6
.
3 0
注 :对照组为常温密封条件下贮存一年的种子
N o t e
:
T h e r e s u lt in CK g r o u P 15 fr o m th e s e e d s to r e d fo r o n e
y e a r u n d e r n o r m a l t e m Pe r a tu r e a n d e lo s e d e o n d it io n s
在水浴中解冻时 , 冷冻小管盖被管内气流冲开 , 其中有 5 粒种子已发芽 , 芽长 1 一 1 . 5 m m ,
原因不能解释 。发芽过程中 , 多数红豆草种子在两片子叶中间裂开 , 硬实种子 已解除 , 发芽情
况不好 。 羊柴种子在室温下解冻时 , 小盖也有崩开 ,发芽率不受影响 。
3
.
2 电导试验分析 从表 3 结果可见 , 经超低温贮存后 , 供试材料电导率都有增加 。 羊柴 、
红豆草种子浸种 18 小时电导率成倍增加 。 其它材料随浸种时间的延长 , 平行样品电导率同
步增加 。 绝对电导率有增有减 , 各品种变化不一 。
电导率的增加表明 , 种子渗出液增多 、种内膜系统受损 , 活力下降 。 从发芽指数结果可
见 , 除沙篙 、苦美菜种子 , 其它种子活力仅仅稍有下降或有增加 。 由此可见 , 在超低温冷冻过
程中 , 种子细胞受到冷害 , 膜结构紊乱 、透性增加 、电导率增加 (胡荣海等 , 1 98 1 ) 。 同时 , 由于
环境胁迫所引起的种子内部脂膜结构的改变或损伤是可以修复的 。在这种情况下 , 电导率则
不能真实反应种子活力情况 , 而干燥 、低温等外界环境条件都会引起种子内部脂膜结构的变
化 (傅家瑞 , 1 9 8 5 ) 。 从而使电导率发生改变 。 严格地分析 , 在不同保存条件下贮存的种子 , 用
电导率能否真实反映其活力 , 有待于进一步研究 。
3
.
3 冷冻贮存前后种子呼吸强度与 A T P 含量的变化情况 经超低温贮存以后 , 多数供试
材料呼吸强度增加 , 或变化不大 。可见 , 牧草种子细胞内线粒体不受超低温及冷冻 、解冻过程
3 8 草 地 学 报 1 9 9 4 年
中温度改变的影响 。 而多数供试材料 A T P 含量降低 , 即种子吸胀萌动时 , A T P 合成受冷冻
影响 。 而华北驼绒黎 、木地肤种子冷冻贮存后 , A T P 含量有所增加 , 与发芽试验结果吻合 (见
表 4 ) 。
表 3 冷冻前后电导试验结果
T a b le 3 R e s u lts o f e le e tr o
一e o n d u e t iv ity t e s t be fo re a n d a ft e r t he e r yo p re s e r v a tio n
冷冻前 Be fo re 冷冻后 A ft er
种名
SPe eie s
粒数
N u m b e r
o f s e e d
浸种时间
(小时)
So ak in g
t lm e (ho u
r
)
电导率(厘米 /欧/粒)
C o n d u e t i
v
ity
(e m /见/ n u m be r )
相对电导(% ) 绝对电导
R ela t iv e A bs o lu t e
e o n d u e t iv ity e ond u e tivi t y
电导率(厘米/欧/粒 )
Co nd
u e t iv ity
( c m / 皇/ n u m be r )
相对电导(% ) 绝对电导
R ela ti
v e Abs o lu t e
e o n d u e tivity eo n d u e t i
v
it y
新获无
芒雀麦
短芒
披碱草
星星草
5 0 72
.
8
125
.
0
:; ::一 1器531.2408251621184巧501 00 48 84 71 60 042 . 2华北驼
绒 蔡
木地肤
50 193
.
0
8 2
.
0 7
8 7 2 0
3 0
.
4 1
3 9
.
10
2 26
1 10
.
0
23412
口口门卜U日“哎」n门了lnl廿
.⋯由b卜n乙」巴n‘QJ坟心U2187436n甘n八UC甘1‘.沙 篙
7 1
.
98
8 5
.
71
8 8
.
80
9 8
.
40
64
.
86
84
.
82
24
.
72
3 1
.
66
12
.
3 0
16
.
3 7
62
.
9 6
63
.
4 9
6 8
.
9
7 9
.
2
14 8
.
0
16 0
.
0
3 4
.
6
3 6
.
8
6 8
.
7
8 8
.
4
28
.
6
40
.
4
1 22
.
0
1 54
.
0
夕,J月心乃4以匕自勺,几只亡J0件奋⋯,一八石目口J111匕JbUO吕互l月n0匕J,目O‘苦窦菜羊 柴
红豆草
4 7
.
7
6 1
.
1
2 7
.
8
3 7
.
0
11 9
.
0
12 0
.
0
7 3
.
0
9 4
.
7
6 1 9
.
0
6 2 4
.
0
2 4 0 0
2 5 8
.
0
9 8
.
3
67 9
。
0
2 8 0 0
.
0
2 8 1
.
0
11 8 0
。
0
3 2 4 0
.
0
2 2 7 0
.
0
0内b,自8八己一bo口,曰JQO.⋯0几b,‘1只乙乃六1J
表 4 冷冻前后种子呼吸强度 、A T P 含t
T a b le 4 T h e r e s p ir a t io n a n d e o n t e n t o f A T P o f t he s e e d b e fo r e a n d a f t e r t he e r y o p r e s e r v a t i o n
种 名
SPe e ie s
粒数
N u m b e r
o f s e e d
浸种时间
(小时 )
So
a k in g
t im e ( ho u r )
呼吸耗 O : t 年. m o l/ m in . 粒 )
C o n s u m P tio n o f o x yg e n
(拜. mo l/ m i
n
.
n u m b e r )
A T P 含量 ( 10 一 llm o l/粒 )
C o n t e n t o f A T P
( 10 一 1lmo l/
n u m b e r )
冷冻前
】交fo r
冷冻后
A ft e r
冷冻前
13e fo r e
冷冻后
A fte r
新疆无芒雀麦 5 0 . 0 2 5 . 0 4 . 66 4 . 3 8 7 10 . 0 1 4 5 . 0
短芒披碱草 5 0 . 2 5 . 3 . 7 2 9 . 8 9 5 2 8 . 0 3 4 0 · 0
星星草 1 0 0 . 0 2 5 . 0 0 . 7 1 1 . 9 1 5 5 . 0 3 9 . 0
华北驼级葵 5 0 . 0 2 . 0 5 . 8 7 7 . 2 1 9 6 0 . 0 1 0 60 . 0
木地肤 1 0 0 . 0 4 . 0 2 . 2 2 2 . 0 5 6 4 0 . 0 7 90 . 0
沙 篙 1 0 0 . 0 1 2 . 0 1 . 1 8 5 . 0 9 8 7 0 . 0 7 10 . 0
苦龚菜 5 0 . 0 1 6 . 0 1 . 4 8 1 . 7 0 8 7 0 . 0 92 5 . 0
羊 柴 2 0 . 0 1 2 . 0 一 1 7 . 3 9 4 . 5 8 6 . 5
红豆草 2 0 . 0 1 2 . 0 7 5 . 8 3 9 . 4 5 2 5 . 0 2 4 0 . 0
从生理学角度分析 , 当种子处于一 1 96 ℃的液氮中时 ,其新陈代谢基本上处于停顿状态 ,
衰变过程完全停止 (P hil h p , 1 98 5 ) 。 但在超低温冷冻过程中几个重要因素和环节是不容忽视
的 。首先 , 种子水分含量是一关键因素 , 在冷冻和解冻过程中 , 水分含量过高或过低都会引起
第 1 期 孙丽萍等 : 超低温 (L N Z一 196 ℃ )贮存牧草种子初探 · 3 9 .
种子致死或部分失活 。 因此 , 在超低温贮存牧草种子之前 , 必须将其水分含量控制在适宜的
范 围之 内 。 一般豆 科牧草种子在 5 . 6一 8 . 0 %之 间 , 禾本科在 7 . 2 ~ 9 . 3 %之 间较为适宜
(Phi li p
,
1 98 5 )
。 其次 , 冷冻 、解冻速度及其操作技术在超低温冷冻实验中也是一个非常重
要的因素 。 本实验采用了快速冷冻 、解冻法 , 这样可以避免种子内部环境不断变化而使种子
失活 。 而国外有采用慢速冷冻 、解冻法实验 , 也不乏成功的例子 。 最后 , 潜在的物理损伤对牧
草种子液氮贮存的成败也是一个关键因素 。种子放入和取出液氮的时候 , 其周围温度发生了
急剧的变化 , 形成巨大的物理压力 , 可引起种子基质的膨胀和收缩 (傅家瑞 , 1 98 5 ) 。 分析羊
柴 、红豆草种子由于这种压力变化而在子叶中间裂开 , 其它种子能够承受这种压力便可安然
存活 。
4 小结
从实验中可以得出 , 多数供试材料对液氮贮存较为适应 。
发芽试验反映出 , 菊科牧草沙篙 、苦窦菜种子发芽率 、发芽指数下降显著 , 属于不耐受超
低温贮存类型 。 禾本科 、豆科 、黎科牧草中供试材料均属液氮耐受类型 。 尤其是华北驼绒黎 、
木地肤种子贮存效果极佳 。
进一步研究结果 , 经超低温贮存后 , 牧草种子电导率都有增加 , 种子内膜系统受冷冻影
响而发生改变 , 通透性增加 , 多数种子呼吸强度增加而 A T P 含量降低 , 即种子呼吸强度不
受冷冻机制影响 , 而 A T P 合成受到明显干扰 , 机理需进行深入研究 。
参 考 文 献
宁 怖等 , 1 9 9 2 , 牧草种子特性研究 Iv :牧草种子生活力的研究 , 内蒙古草业 , 1 : 49
胡荣海等 , 1 981 , 用质膜透性鉴定玉米苗期抗寒性 , 植物生理学通讯 , 6 : 35 一 37
傅家瑞 , 1 9 8 5 , 种子生理 , 科学出版社 , P 3 3 ~ 3 72
Ph illip C
.
S t a n d w o o d 1 9 8 5
,
C r yo p r e s e r v a t io n o f s e e d g e rm p la sm fo r g e n e tie eo n se r v a tio n
, c r yo p r e s e r
-
v a tio n o f p la n t e e ll a n d o r g a n s
.
P 19 9一 2 2 7
G R Y O P R E SE R V A T IO N O F FO R A G E S E E D G E R M PL A SM
S u n L ip in g N in g B u B a o L a ix ia o L i L in h a n g
(G r a s s la n d R e se a r e h In st itu te
,
Ch in e s e A e a d e m y o f A g r ic u ltu r a lSc i
e n e e s , H u h h o t 0 1 0 0 1 0 )
A bs tra e t
:
O v e r e o m in g p h ys ilo g ie a l d e te r io r a tio n o f a s to r e d se e d s a m p le 15 o n e o f th e m o s t im p o r t a n t
a n d d iffie u lt t a s k s in th e p r e s e r v a t io n p r o e e s s
.
C ry o p r e s e r v a t io n te e h n iq u e (L N :
, a t 一 1 9 6
‘
C )p r o v id e s a p o
-
te n tia l p r e se r v a tio n b y r e d u e in g m e t a bo lis m t o a lo w le v e l a t th a t a ll b io e h e m iea l p r o e e s s a r e sig n ifiea n t ly
re d u ee d a n d b io lo g ie a l d e e te rio r a tio n v ir tu a lly s to p p e d
.
T h u s
, t he s e e d s to r a g e life w a s g r e a t ly e x te n d ed
·
N in e k in d fo r a g e s e e d s a m p le s w e r e s to r e d in L N : fo r o n e y e a r
.
T he n v ia b ility
, e o n d u c t iv ity
, r e s p ir a tio n a n d
th e e o n te n t o f A T P o f the s e e d w e re m e a s u r e d to d e t e r m in e its v ig o r
.
G r a s s fa m ily
,
le g u m e fa m ily a n d
g o o se fo o t fa m ily w e r e th e ty p e o f L N Z
一t o le r a n t
.
E s p e e ia lly
,
C e r a to id e t a r b o r esc en s (L o s in s k ) Ts i
e n e t C
.
C
. 拟d a n d K o ch ia r Pstra ta (L . )S c h ra d , w e r e s ig n ifie a n t s u it a b le fo r e ry o p r e s e r v a tio n ·
K e y wo
r d s : C ry o p r e s e r v a tio n te e h n iq u e ; S to r a g e life ; S e ed v ig o r