全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(6)：535～538
Journa／o|Wuhan Botanical Research
粗山羊草(Aegilops tauschi)中Pinb基因的克隆和表达分析
吴 昊，何勇刚，陈 鹏，张欣鑫，黄健忠，陈明洁
(华中科技大学中英 HUST—RRes基因工程和基因组学联合实验室，武汉 430074)
摘 要：puroindoline口(Pina)和puroindoline b(Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因。根据已报道的小麦 Pinb
基因的保守序列，设计合成了一对特异性引物，对粗山羊草Aegaom tauschi(DD)的基因组 DNA进行 Pinb基因扩
增、克隆和序列分析，发现了一个新型P 等位基因。该基因长447 bp，编码 148个氨基酸残基，具有麦类作物
PinB蛋白所特有的wPrKwwK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。与软粒小麦CV．Capitole
的 一Dla相比较，该基因含有 14个氨基酸变异位点，其中包括一个紧邻色氨酸结构域的变异位点(Va166Phe)，
其核苷酸和氨基酸同源性分别为 93．3％和 90．5％。RT—PCR和 Western Blot证实了Pinb基 因在籽粒胚乳 中的表
达。Southern Blot分析结果表明，粗山羊草中P 基因为单拷贝。研究结果表明，粗山羊草中包含着与小麦差异较
大的籽粒硬度控制基因，对此基因的进一步研究将加深对小麦籽粒硬度形成分子机制的了解。
关键词：粗山羊草；P／nb基因；籽粒硬度；克隆
中图分类号： 8；s512 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2007)06—0535—04
Cloning and Expression of Pinb Gene in Aegilops tauschii
wu Hao，HE Yong—Gang，CHEN Peng，ZHANG Xin—Xin，HUANG Jian—Zhong，CHEN-Ming—Jie’
(China—UK HUST-RRes Genetic Engineering and Genomics Joint Laboratory，Huazhong Un／vers／ty ofScience＆Technology，Wuhan 430074，China)
Abstract：Puroindoline n(Pina)and puroindoline b(Pinb)are the major genes controling grain hard—
ness in wheat．According to the conserved regions of Pinb gene reported，one pair of specific primers was
designed and used to amplify one new Pinb allele from genomic DNA of young leaves of Aegilops tauschii
(DD)．Sequence analysis indicated that it was 447 bp in size，encoding 148 amino acid residues which
correspo nded to the structure of PinB protein． 山 the tryptophan motif of W KWW K and five disul—
phide bonds formed by ten cysteines，which were specifc to PinB in cereal crop．Compared with Pinb—Dl a
from Triticum aestivum CV．Capitole，this new Pinb alele in Ae．tauschii contained 14 am ino acid muta—
tions，among which there was one mutation adjacent to the tryptophan motif(Va166Phe)，sharing 93．3％
homologies in nucleotide sequence and 90．5％ homologies in am ino acid sequence．respectively．The ex—
pression of P in grain endosperm was verified by RT—PCR and Western Blot analysis．The results
showed that Ae．tauschii contained grain hardness—controling gene quite diferent from that of aestivum
an d further study on this gene would benefit our understanding of the mechanism undedying the form ation
of wheat kernel texture．
Key words：Aegilops tauschii；Pinb；Grain hardness；Cloning
籽粒硬度是指破坏小麦(Triticum aestivum)籽
粒所需力的大小。小麦籽粒硬度是小麦的重要目标
性状之一，它控制小麦磨粉品质和烘烤品质，是决
定小麦品质、最终用途和小麦国际贸易的重要指
标。研究发现籽粒硬度 由 Puroindoline蛋白(包括
PinA和 PinB)直接控制，Pin蛋白通过色氨酸结构
域，和淀粉表面结合，作用于籽粒质地结构，从而
影响籽粒硬度 J。在六倍体面包小麦中，该类蛋白
质的编码基 因Pina和 Pinb于染色体 5D短臂 Ha
(hardness)位点上紧密连锁 J，Pina和 Pinb中任何
一 种发生变异，都会导致籽粒硬度的变化。在小麦
中已发现多个Pina和Pinb基因突变体，这些突变，
特别是 Pinb基因色氨酸结构域的突变，导致籽粒
硬度的显著变化。研究结果表明，Pinb突变类型较
多，Pinb基因更易发生突变 ，是籽粒硬度的重要控
制因素 引。
收稿日期：2007—03—30，修回13期 ：2007—06—27。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30640043)；华中科技大学校科学研究基金(2006M033B)。
作者简介：吴吴(1982一)，男，硕士研究生，从事植物分子生物学研究 ；陈明洁(1968一)，女 ，副教授，博士，研究方向为植物分子生物学。
通讯作者(Email：cmj@hust．edu．ca)。
维普资讯 http://www.cqvip.com
536 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
籽粒硬度的研究已引起全球范围的广泛重视，
特别是栽培小麦的籽粒硬度研究进展较快。我国的
相关研究也已经展开H J。山羊草属是与小麦属遗
传关系最近的近缘物种，包含着重要的种质遗传资
源，其中所包含的许多抗病、优质及其它有用基因，
已经开始应用于小麦改 良【 。本研究以六倍体小
麦D基因组的供体——粗山羊草Aegilops tauschi
(DD)为材料，进行 Pinb基因的克隆、序列测定、胚
乳中基因表达分析，旨在发现新 Pinb等位基因，丰
富麦属植物遗传资源库，为阐明Pinb基因对籽粒硬
度的影响机制，加速小麦品质改良进程，提供新的思
路、方法和手段。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料与质粒
粗山羊草Aegilops tauschi(DD)由中国农科院
品质资源所提供。为确保实验结果的可靠性，用含
有小麦野生型 Pinb基因的质粒MPL13．1．16作阳性
对照，不含Pina和 Pinb基因的硬粒小麦(Triticum
durum，AABB)CV．Luna作阴性对照。质粒和硬粒小
麦由英国洛桑研究所提供。
1．1．2 主要试剂
CTAB、PVP购 自Sigma公司；Pfu DNA聚合酶、
EcoR I、EcoRV、dNTP、RNase、100 bp DNA marker购
自Promega公司；SuperScript 11逆转录试剂盒购 自
Invitrogen公司：Southem Blot和 Western相关试剂购
自Roche公司；基因序列测定由上海生工公司完成；
引物由Sigma公司合成。上游引物ForB：5’一ATGAA—
GACCTTATTCCTCCTAGC一3’，下游弓I物RevB：5’一
GATATCATCACCAGTAATAGCC一3’。
1．2 实验方法
1．2．1 基因组 DNA和未成熟胚乳 cDNA的制备
以 CTAB方法[8 从粗山羊草和硬粒小麦新鲜叶
片中提取基因组 DNA。
采用 CTAB．PVP．高盐的方法从粗山羊草和硬
粒小麦的未成熟胚乳提取总 RNA。RNA提取液含
2％ CTAB、2％ PVP、100 mmol／L rifs—HC1、25mmol／
L EDTA、2．0 moL／L NaC1、0．5 g／L亚精胺、2％巯
基乙醇。将 l g开花后3周的未成熟胚乳于液氮中
彻底磨碎，加入 RNA提取液彻底混匀，氯仿抽提后
上清用 10 mol／L LiC1沉淀过夜，提取总 RNA 。
DNA与RNA的浓度和纯度的测定用紫外分光光度
计与琼脂糖凝胶电泳法。
cDNA的制备采用 SuperScript 11逆转录试剂盒
(Invitrogen)，将 oligo(dT)引物、dNTP、总 RNA
(DNA—free)和RNase—free H20混合后，于65℃ 温育
5 min，冰浴 1 min，然后加入 5×First strand bufer、
DTI"和SupemcriptⅢ，混匀后于 50℃温育 1 h。逆
转录反应一结束立 即将样品加热至 70~C，保温
15 min使逆转录酶失活，置于冰上迅速冷却。所得
的 cDNA即可用于基因扩增。
1．2．2 基因克隆与序列测定
以基因组 DNA或者未成熟胚乳 cDNA为模板，
用特异性引物扩增 Pinb基因。PCR扩增采用 50p~L
反应体系，选用高保真Pfu DNA聚合酶，反应液首
先加热至 95℃并保温 5 min，然后开始循环反应 ：
95℃ 30 S，58oC 1 min，72~C 2 min，35个循环；72oC
继续延伸反应 10 min。PCR扩增反应同时设立对
照，阳性对照是以Pinb质粒MPL 13．1．16为模板，阴
性对照分别用硬粒小麦基因组 DNA和未成熟胚乳
cDNA为模板，反应液的配制和反应条件与研究材
料相同。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化、回收得
到纯化扩增产物。将扩增片段与pGEM—T easy载体
连接，转化感受态细胞、质粒抽提、质粒鉴定，获得的
阳性质粒进行序列测定。
1．2．3 Southern Blot分析
粗山羊草基因组DNA分别经EcoR I和EcoRV
(酶切位点均位于Pinb基因外)彻底酶解后 ，进行琼
脂糖凝胶电泳，经 Southern印迹转至尼龙膜上，再经
过预杂交、地高辛探针杂交、洗膜、化学荧光检测，进
行基因组 DNA中Pinb基因拷贝数的分析 10]。Pinb
质粒MPL 13．1．16经 EcoR I酶解后用作阳性对照。
地高辛探针以 舶 质粒MPL 13．1．16为模板、ForB
和RevB为引物，通过 PCR扩增的方法合成。
1．2．4 Western Blot分析
从成熟籽粒中提取的蛋白质经过 Tricine—SDS—
PAGE系统分离 ¨，转移至硝酸纤维素膜上，再经
过一抗(鼠抗PinB单克隆抗体)、二抗(碱性磷酸酶
偶联的羊抗鼠IgG)结合、NBT／BCIP底物显色等反
应，检测 Pinb基因的蛋白质表达。
2 实验结果
2．1 基因组DNA中Pinb基因序列测定
用引物ForB和RevB对粗山羊草的基因组DNA进
行PCR扩增，得到约450 bp的特异扩增片段(图1)，对
该片段进行凝胶分离、回收纯化后克隆、测序。
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 6期 吴 吴等 ：粗山羊草(Aegilops tauschii)中Pinb基因的克隆和表达分析 537
bp
500
400
300
1．100 bp DNA marker；2．P￡n6质粒阳性对照；3．粗山羊草基因
组 DNA；4。粗山羊草籽粒胚乳 eDNA；5．硬粒小麦基因组 DNA；
6．硬粒小麦籽粒胚乳 eDNA
Lane 1：100 bp DNA marker；Lane 2：PCR result of P／nb plasmid；
L e 3：PC R resultof gDNAof Aegilopstauschii：lane4：PCR result
of cDNA of Ae．tauachii；L e 5：PCR result of gDNA of durum
wheat：l~ule 6：PC R resultof cDNA of durum wheat
图 1 DNA和籽粒胚乳eDNA的 P／rib基因扩增
Fig．1 PCR amplifcation of gene from gDNA and
cDNA ofAegilops tauschi
Pinb—Dla
Ae．Tauschil
Pinb—Dla
Ae tauschii
与已经报道 的软粒小麦 cv．Capitole的 Pinb—
Dla进行序列比对(图 2)，发现从粗山羊草获得的
基因片段长为447 bp，编码 148个氨基酸残基，具有
PinB蛋白特有的WPTKWWK的色氨酸结构域和 lO
个半胱氨酸形成的5个二硫键结构。但是该基因序
列与Pinb—Dla序列存在较大差异，共含有 14个氨
基酸变异位点，其中包括一个紧邻色氨酸结构域的
变异位点(Va166Phe)，与 Pinb—Dla的核苷酸同源性
为93．3％，氨基酸同源性为 90．5％。
2．2 胚乳中Pinb基因表达分析
Puroindoline是一类种籽储藏蛋白，开花后 l5～
21 d未成熟胚乳是 Pin基因表达的高峰期，从中提
白色表明变异位点；横杠标示色氨酸结构域
Whitening denoted mutation；a bar indicated the tryptophan motif
图 2 粗山羊草新型 Pinb等位基因与 Pinb．Dla的编码成熟蛋白氨基酸序列比对
Fig．2 Alignment of the deduced amino acid sequences of new Pinb alele of Ae．tauschi and Pinb-Dla
取总 RNA，纯度检测合格后，用ForB和RevB~I物对，
以RNA为模板进行 PCR扩增，并无特异扩增片段
出现，表明 RNA中无 DNA污染(结果未显示)。取
RNA进行 RT—PCR扩增，扩增结果与基因组一致，
结果见图 1。对扩增片段进行纯化并克隆、测序，结
果表明Pinb基因在胚乳中表达，且表达的Pinb基
因序列与基因组 Pinb基因序列一致。
2．3 Southera Blot分析
粗山羊草基因组DNA，分别经EcoR I和EcoRV
彻底酶解之后，进行 Southem Blot分析。用 PCR扩
增地高辛探针，检测转移至尼龙膜上的基因组 DNA
中Pinb基因，结果(见图3)表明该材料中Pinb基因
l 2 3
—
1．EcoRV酶解基 因组 DNA；2． 0R l酶解基因组 DNA；
3．P n6质粒对照
1．gDNA digested by EcoRV；2．gDNA digested by EcoR I；
3．Positive control ofPinb plasmid
图 3 粗山羊草P／rib基因 Southern Blot分析
Fig．3 Sou出el3tl Blot an alysis of P／nb gene
in Ae．tauschii
为单拷贝。
2．4 Western Blot分析
PinB蛋白分子量为 l5 kD。采用鼠抗 PinB单
克隆抗体可以检测 Pinb基因的表达。Western Blot
分析时，以软粒小麦 Riband和四倍体硬粒小麦分别
作为阳性对照和阴性对照，分析结果见图4。结果
显示，粗山羊草中 PinB蛋 白的表达量与软粒小麦
Riband接近，四倍体硬粒小麦中未检测到 PinB蛋
白。图中3O kD显色带可能是 PinA蛋白和 PinB蛋
白形成的 Ffiabilin二聚体。
1 2 3
kD
●- —-30
1：四倍体硬粒小麦；2：软粒小麦 Riband}3：粗山羊草
1：Tetraploid durum wheat；2：Soft wheat Riband；3：Ae．tauschii
图 4 Western Blot分析胚乳中P／nb基因的表达情况
Fig．4 Western Blot analysis of P expression
in endosperm
3 讨论
作为籽粒中的脂类结合蛋 白，Pin蛋白不但影
响小麦的籽粒硬度，而且能改变面粉的水吸收率，从
而影响面包的流变特性和面包质地，此外，Pin蛋白
还具有抗病菌和啤酒泡沫稳定的功效 ，圩]。因此
．
维普资讯 http://www.cqvip.com
538 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
籽粒硬度主效基因的研究对于小麦籽粒硬度的基因
工程改良、小麦食品加工业的发展以及抗病性的研
究都具有重要意义。
近些年来，以近缘野生物种为研究材料，开发新
的种质资源，已经成为 目前植物分子育种的一个重
要研究方向。作为小麦的近缘野生物种，山羊草属
包括 C、D、M、S、u等基因组，是一个丰富的品质改
良基因资源库，已经从山羊草属中分离得到新的高
分子量麦谷蛋白亚基基因 引。作为六倍体小麦 D
基因组的供体，粗山羊草在小麦品质改良方面的重
要意义已经引起了研究者们的极大兴趣，有关籽粒
硬度的研究也取得一定进展 。
本研究以粗山羊草为研究对象，通过 PCR扩
增，得到一个新型 Pinb等位基因。该基 因序列与
Pinb-Dla差异较大，也不同于 Massa等从粗山羊草
中获得的Pinb等位基因Pinb—Dlh¨ 。与 P 一Dla
相 比，Pinb—Dlh包含 两个变异 位点 Arg57Gly和
Cys58Trp，本 研 究 获得 的 Pinb等位 基 因 则 为
Glu56Gly和Arg57Trp。为保证序列测定的准确性，
实验中采用了高保真的 Pfu DNA聚合酶，以避免
PCR扩增时核苷酸的错误掺人。
RT—PCR和 Western Blot的分析结果均证实了
p 基因在籽粒胚乳中的表达，而且表达量较高。
为确保 RT—PCR结果的准确性，籽粒胚乳中提取的
RNA必须经过琼脂糖凝胶电泳检测、紫外分析和直
接 PCR扩增，确证无 DNA污染后方可用于 RT—PCR
反应。研究结果显示粗 山羊草 中胚乳 中表达的
P 基因序列与基因组 P 基因序列一致。由于
在小麦的近缘物种中发现了籽粒硬度基因多拷贝现
象，故采用两种限制性内切酶水解粗山羊草基因组
DNA，Southern Blot分析结果显示基因组中 Pinb基
因为单拷贝，与序列测定结果相吻合。
Moris等认为，小麦中Pina和 Pinb基因的突变
均导致籽粒变硬 J。扫描电镜分析的粗山羊草籽
粒硬度为软粒(结果未显示)，但是其Pinb等位基因
中含有14个氨基酸变异位点，特别是在色氨酸结构
域附近出现变异位点，却并未导致籽粒变硬，这个结
果是对小麦籽粒硬度控制理论的有效补充和完善。
其作用机制尚不明了，推测这些变异并未降低 PinB
蛋白与脂类的结合力，因此有必要将其克隆至表达
载体上，鉴定其活性与功能，相关工作正在进行。
粗山羊草含有一个新型Pinb等位基因，包括 l4
个氨基酸变异位点，与小麦 Pinb基因存在较大差
异，证实了山羊草确实是一个丰富的遗传资源库。
目前相关的研究尚不多，因此有必要展开进一步研
究，如构建高效植物表达载体，转化小麦进行功能互
补实验，鉴定其功能，为充分利用宝贵的野生遗传资
源，通过基因工程技术改良我国小麦籽粒硬度奠定
基础。
参考文献：
[1] Joly c J，Rahman S，Kort V，Higgins T J V．Characterization of
the wheat Mr．15000 grain 8oftness protein and analysis ofthe re—
lationship between its accumulation in the whole seed and ain
softness[J]．TheorAppl Genet，1993，86：589—597．
[2] Law C N，Young C F，Brown J w S，Snape J W，Worland J w．
The study of grain protein control in wheat using whole chromo-
some substitution lines[A]．In：Seed Protein Improvement by Nu—
clear Techniques[c]．Vienna，Austria：International Atomic En—
ergy Agency，1978．483—502．
[3] Morris C F．Puroindolines：the molecular genetic basis of wheat
n hardness[J]．Plant Mol Bio，2002，鹌 ：633—647．
[4] 夏兰芹 ，何中虎，陈新民，张庆祝，周阳．小麦硬度主效基 因
P／ha和 P ，l6的克隆与序列分析[J]．作物学报 ，2003，29(1)：
25—3O．
[5] Pan Z，Song W，Meng F，Xu L，Liu B，Zhu J．Characterization of
genes encoding wheat grain hardness from Chinese eultivar
GaoCheng 8901[J]．Cereal Chem，2004，81：287—289．
[6] Chen F，He Z，Chen D，Zhang C，Zhang Y，Xia X．Influence of
puroindoline alleles on milling performance and qu alities of Chi—
nose noodles，steamed bread and pan bread in spring wheats[J]．
Journa／ofCereal Science，2Oo7，45(1)：59—66．
[7] 董玉琛 ，郑殿升．中国小麦遗传资源[M]．北京：中国农业出
版社，2000．149—168．
[8] Stacey J，Isaac P．Methods in Molecular Biology-Protocols fur
Nucleic Acid Analysis by Non—radioactive Probes[M]．Totowa，
NJ：Humana Pres，1994．
[9] Chang S，Puryear J，Cairney J．A simple and eficient method fur
isolating RNA from pine s[J]．Plant Molecular Biology Re-
porter，1993，11(2)：l13一l16．
[1O] Sambrook J，Fritsch E F，Manniatis T．Molecular cloning：a labo-
ratory manual[M]．2nd ed．New York：Cold Spring Harbor Labo-
ratory PrL~B，1989．474—490．
[11] Shcwry P R，Tatham A S，Fido R J．Separation ofplant proteins by
electrophoresis[A]．In：Jones H ed．Methods in Molecular Biology
[c]．Totowa：Humana PleBs，1995．399—422．
[12] Dubreil L．Interaction of puroindolines with wheat flour polar
lipids determining their foaming properties[J]．J agri Food
Chem，1997，45：108一l16．
[13] Dubreil L，Gaborit F．Spatial and temporal distribution of the ms、
jor isoforms of puroindolines(puroindoline a and puroindoline b)
and non—specifc lipid tn~rlfcr protein(ns—LTPe)of TKt~um an·
tivum seed8．Relationships with their in vitro an tifungal prope rties
[J]．Plant Sci，1998，138：121—135．
[14] “u Z，Yan Z，waIl Y，uu K，Zheng Y，Wang D．Analysis of
HMW glutenin subunits and their coding sequences in two diploid
Aegi~ps species[J]．TheorAppl Genct，2003，106：1368—1378．
[15] Massa A N，Morris C F，Gil B S．Sequence divcrai~ofpuroindo-
line—a，puroindoline—b an d the grain softness protein genes in Ae-
gilops tauschi COB[J]．Crop Sci，2004，44：1808—1816．
维普资讯 http://www.cqvip.com