全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(1): 45−53 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD02B05), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-10)和黔农科院院专项
([2008]022号)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 金黎平, E-mail: jinliping@caas.cn, Tel: 010-82109543
第一作者联系方式: E-mail: gzlifei@hotmail.com, Tel: 0851-3761808
Received(收稿日期): 2013-07-01; Accepted(接受日期): 2013-09-16; Published online(网络出版日期): 2013-10-22.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131022.1558.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00045
三个耐冻性不同的马铃薯野生种中 FAD2基因的克隆及表达分析
李 飞 1,2 徐建飞 1 刘 杰 1 段绍光 1 卞春松 1 Jiwan P. PALTA3
金黎平 1,*
1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081; 2 贵州省马铃薯研究所, 贵州贵阳 550006; 3 Department of Horticulture, University of
Wisconsin, Madison 53706, WI, USA
摘 要: 以 3个耐冻性和冷驯化能力不同的马铃薯野生种 Solanum commersonii、S. acaule和 S. cardiophyllum为材料,
利用 RT-PCR 技术克隆出不饱和脂肪酸合成途径中的关键酶基因 ω-6 脱氢酶基因(FAD2), 分别命名为 Cmm-FAD2
(GenBank登录号为 KF214782)、Aca-FAD2 (KF214781)和 Cph-FAD2 (KF214783)。序列分析表明, 该基因在 3个马铃
薯野生种中核苷酸长度都为 1326 bp, 编码 441个氨基酸残基。3个野生种 FAD2基因核苷酸序列和蛋白序列比对结
果表明, 在 18个位点的差异核苷酸中有 8个位点的差异导致对应的氨基酸残基变化, 其中第 11和第 44氨基酸残基
处, 耐冻且有冷驯化能力的 S. commersonii和 S. acaule有相同的氨基酸, 而冷冻敏感 S. cardiophyllum的氨基酸却不
同。二级结构预测结果表明 S. commersonii和 S. acaule的 FAD2蛋白与 S.cardiophyllum FAD2蛋白的 α-螺旋、延伸
链和随机卷曲存在明显差异。蛋白多序列比对和进化树分析表明, 3个马铃薯野生种的 FAD2基因与番茄的亲缘关系
最近, 其次是与马齿笕。qPCR分析表明, 12 d冷驯化使 FAD2基因在 3个马铃薯野生种中都上调表达, S. commersonii
和 S. acaule的 FAD2基因表达水平均高于 S. cardiophyllum, 且差异显著。
关键词: 马铃薯野生种; 耐冻; 冷驯化; FAD2; 基因表达
Molecular Cloning and Expression Analysis of FAD2 Gene from Three Wild
Potato Species with Different Levels of Freezing Tolerance
LI Fei1,2, XU Jian-Fei1, LIU Jie1, DUAN Shao-Guang1, BIAN Chun-Song1, Jiwan P. PALTA3, and JIN
Li-Ping1,*
1 Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 Guizhou Institute of Potato, Guiyang
550006, China; 3 Department of Horticulture, University of Wisconsin, Madison 53706, WI, USA
Abstract: Using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), three full-length cDNAs of ω-6 desturases (FAD2)
were obtained from three wild potato species (Solanum commersonii, S. acaule, and S. cardiophyllum) with different levels of
freezing tolerance and cold acclimation capacity. These genes were designated Cmm-FAD2 (GenBank accession No. KF214782),
Aca-FAD2 (KF214781), and Cph-FAD2 (KF214783), respectively. They are all 1326 bp in length, coding 441 amino acids. The
alignment result indicated that eight of 18 different nucleotides result in the corresponding variation of coding proteins in the three
species. At the amino acid positions of No. 11 and No. 44, amino acid residues of S. commersonii and S. acaule are different from
that of S. cardiophyllum. The results of secondary structure prediction showed obvious differences in alpha-helix, extend chain,
and random crimp of S. commersonii and S. acaule as compared to those of S. cardiophyllum. According to the alignment result of
multiple protein sequences and the phylogenetic tree, the coding products of FAD2 genes from the three wild potato species are
highly homologous to those from tomato and purslane. The results of qPCR showed that FAD2 expression was up-regulated in the
three potato wild species after 12-day cold acclimation; however, the relative expression level of FAD2 in S. commersonii and S.
acaule were significantly higher than that in S. cardiophyllum.
Keywords: Wild potato species; Frost tolerance; Cold acclimation capacity; FAD2; Gene expression
46 作 物 学 报 第 40卷


低温冷害和冻害经常造成马铃薯(Solanum tu-
berosum L.)严重减产[1-2], 如 2008年 2月发生在中国
南方冬作马铃薯区的凝冻灾害直接导致 10 亿元的
经济损失[3]。低温会造成质膜不可逆的损伤, 最后导
致电解质渗漏和组织崩塌。在草本植物中质膜被认
为是低温胁迫的关键位点[4]。通过冷驯化能使很多
植物的耐冻性得到提高, 因此在冷冻温度胁迫适应
期间质膜必然发生变化, 研究者们详细分析了质膜
的油脂成分并提出了质膜油脂成分和冷驯化能力之
间的显著关联的证据[5-6]。
对于低温响应, 脂肪酸脱氢酶通过调节脂肪酸
不饱和度从而调节膜的流动性[7]。在植物脂肪酸脱
氢途径中, 可溶性质粒硬脂酰基载体蛋白脱氢酶催
化硬脂酸(18:0)的第 9 和第 10 个碳原子间第一个双
键的形成产生单不饱和油酸(18:1), 随后, 油酸成为
甘油糖脂的一部分进入质粒体或内质网膜[8]。膜结
合的 ω-6 脱氢酶(FAD2)在油酸的碳 12 和 13 之间插
入一个双键从而形成双不饱和亚油酸(18:2)[9]。ω-3
脱氢酶进一步催化在碳 15 和 16 之间引进第 3 个双
键形成三元不饱和 α-亚麻酸(18:3)[10]。
目前, 已报道了草本植物多不饱和脂肪酸水平
和寒冷敏感性之间的密切关系[11]。拟南芥fad2突变
体的内质网中缺乏18:1脂酸酸脱氢酶活性, 使叶绿
体膜中的多不饱和脂肪酸的量显著减少 [12], 在6℃
条件下, 42 d后生长受到抑制, 最后导致植株枯萎并
死亡。最近的研究发现冷胁迫期间冷驯化能力使多
不饱和脂肪酸积累, 野生马铃薯S. commersonii叶片
的膜甘油糖脂中的亚油酸累积 , 然而马铃薯普通
栽培种S. tuberosum在寒冷胁迫期间并没有这种特
性 [13]。植物中的油酸脱氢酶(FAD2)是负责催化油酸
(OA)变成亚油酸(LA), 通过调节油酸脱氢酶基因即
可调节OA和LA的比例[14]。研究者们从棉花[15]、橄
榄[9]、向日葵[16]、大豆[17]、马齿苋[8]和旱金莲[18]等
不同物种中分离出大量的FAD2基因。目前从马铃薯
中分离的抗寒相关基因有 SM2358、MasCIC和
A13[19]。Joachim等[20]从马铃薯块茎中分离的寒冷诱
导基因有CI7、CI13、CI19和CI21。Tadcusz等[21]从
抗寒的野生马铃薯S. sogarandinum中分离了Ssci1、
Ssci12、Ssci17和Ssci20等基因, 在寒冷处理期间, 这
些基因在S. sogarandinum中都比在寒冷敏感的栽培
种S. tuberosum中转录水平高。
经鉴定, 有35个不同的马铃薯野生种对霜冻有
不同程度的耐受性 [22], 其中 S. commersonii和 S.
acaule耐冻且具较强冷驯化能力 , 而S. cardiophyl-
lum对冷冻敏感且不具冷驯化能力 [23]。关于马铃薯
FAD2基因的研究还未见报道。本研究利用这3个耐
冻性差异较大的马铃薯野生种, 了解其FAD2基因序
列或表达的基因型差异, 旨在为马铃薯的耐冻性分
子改良提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
从 Inter Regional Potato Introduction Station
(NRSP-6), Sturgeon Bay, WI, USA引进马铃薯野生
种, S. commersonii (PI 473412)、S. acaule (PI 472678)
和 S. cardiophyllum (PI 341233)。2012年 3月将其种
植于气候箱中 , 每份材料种植 9 株。箱内温度为
22±1 , ℃ 光照强度 400 μmol m–2 s–1, 14 h/10 h光暗培
养, 相对湿度为 70%±5%。
1.2 冷驯化及耐冻性鉴定
在植株生长 5 周后, 为了实现冷驯化, 将气候
箱温度设为白天 4 , ℃ 晚上 2 , ℃ 14 h /10 h光暗培养,
光照强度为 100 μmol m–2 s–1, 冷驯化时间为 12 d。
采用电解质渗漏法鉴定耐冻性[3]。取成熟叶片
用蒸馏水冲洗干净, 放入带盖试管(25 mm × 150 mm)
底部, 每管放一片, 叶柄朝上, 叶面朝外。将试管放入
水浴锅中(水浴锅中的媒介为 1 1∶ 的乙二醇和蒸馏
水混合物)。水浴锅的初始温度设为 0 , ℃ 保持 30 min
降到 –0.5℃再保持 30 min, 降温速度为 0.5 ℃
30 min–1。温度从–0.5℃降到–1.0℃并保持 30 min后
在每管中加入一小块冰, 再保持 30 min后将温度降
为–1.5 , ℃ 保持 1 h, 降温到–2℃并保持 30 min后再
降到–2.5 , 30 min℃ 后将温度从–2.5℃降到–3.0 , ℃
保持 30 min后取样。依次类推, 降温直到目标温度,
并分别取样。并在到达每个温度点后即刻将试管取
出并插入冰中, 于 4℃的冰柜中解冻过夜。次日将解
冻后的叶片用锋利的刀片切成 5 mm 的小条装入玻
璃试管并加 25 mL蒸馏水。用真空泵以 0.1 MP的真
空度抽气 6 min, 在振荡器上以 220转 min–1的速度
振动 1 h, 静置后测电导率 R1。将试管盖上盖子放入
高压灭菌锅中 121℃灭菌 15 min, 冷却至室温测电
导率 R2。电解质渗出率(%)= R1/R2 × 100%。将每个
温度对应的 3次电解质渗出率的平均值带入 Logistic
方程进行非线性拟合, 方程拐点即为材料的半致死
温度(LT50), 用以表示材料的耐冻性。在冷驯化 0 d
和 12 d 进行耐冻性鉴定, 冷驯化能力是驯化后的
第 1期 李 飞等: 三个耐冻性不同的马铃薯野生种中 FAD2基因的克隆及表达分析 47


LT50减去驯化前的 LT50。所有样品的鉴定进行 3 次
重复。
1.3 RNA提取和 cDNA第一条链合成
在冷驯化0 d和12 d时提取RNA, 采用Invitrogen
公司TRIzol试剂, 参照说明书。采用Invitrogen公司
的SuperScript III第一条链试剂盒合成cDNA。
1.4 引物设计及合成
根据茄科基因组网络 (http://solgenomics.net/
organism/Solanum_tuberosum/genome)中的 FAD2 基
因序列(PGSC0003DMG400011135)设计引物 , 软件
为 Primer Premier 5。正向引物 F1 序列为 5′-AT
GGCTTGCAGTGTTGCAGACTCTG-3′, 反向引物
R1326 序列为 5′-TCAAGCGTAGTCTGGCATTAC
TTTTTTAAG-3′, 委托上海生工北京分公司合成
引物。
1.5 RT-PCR检测
用设计的引物(F1和 R1326)以 cDNA模板进行
扩增。20 μL的 PCR反应混合物包括 11.2 μL的双
蒸水, 5×PCR buffer 4 μL, 5 mmol L–1 dNTPs 0.8 μL,
5 μmol L–1正反向引物各 0.8 μL, GO Taq DNA 酶
0.4 μL, 30 ng μL–1 cDNA模板 2 μL。PCR反应条件
为 94 3 min℃ ; 94 30 s, 60 1 min, 72 2 min, ℃ ℃ ℃ 共
35个循环; 最后 72℃延伸 7 min。PCR反应产物经
1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后回收, 通过热激法(42 ,℃
45 s)将纯化产物与 pGEM-T克隆载体连接并转化到
大肠杆菌(DH5α)感受态细胞中。对重组子进行蓝白
斑筛选, 挑白斑在 37℃摇菌, PCR 检测后获得阳性
克隆并送到中国农业科学院重大工程楼测序。
1.6 序列比对及结构预测
采用 Bioxm 2.6进行 FAD2基因的开放读码框和
编码的氨基酸序列推断。利用 NCBI上 Blast程序进
行序列比对。用 Clustal 1.8.1和 Mega5.05软件构建
系统进化树。用 DNAMAN(5.0)进行多序列比对。蛋
白的理化特性用 P r o t p a r a m 软件 ( h t t p : / / w e b .
expasy.org/protparam/)推测。采用 Pfam27.0 (http://
pfam.sanger.ac.uk/)分析蛋白结构域。通过 Predictpro-
tein (http://www.predictprotein.org/)预测蛋白的二级
结构。
1.7 qPCR分析
用冷驯化 0 d 和 12 d 的植株叶片提取总 RNA,
并反转录为第一链 cDNA (Invitrogen试剂盒)。采用
ABI StepOne Real-time PCR System。反应体系为
20.0 μL, 含有 10.0 μL 2×TransStar Green qPCR Su-
per Mix, Passive Reference Dye 0.4 μL, 2.0 μL cDNA,
10 μmol L–1正反向引物(F1171和 R1299)各 0.4 μL,
6.8 μL ddH2O。运行程序为 95℃预变性 30 s, 95℃变
性 15 s, 60℃退火 15 s, 72℃延伸 10 s, 40次循环。所
有试验样品均重复 3次。qPCR引物序列和内参基因的
引物序列见表 1。选用内参基因 β-tubulin2 [24]。根据
FAD2 基因测序的编码区序列设计引物 F1171 和
R1299 用于 qPCR。采用 ΔΔCT法计算 FAD2 基因的
表达量。

表 1 FAD2基因的 qPCR引物和内参基因引物序列
Table 1 qPCR primers sequence of FAD2 and primers
sequence of reference gene
引物
Primer
引物序列
Primer sequences (5′–3′)
应用长度
Amplication
length (bp)
β-tubulin2-S GATGTTGTGCCAAAGGATGT
β-tubulin2-R AACTTGTGGTCAATGCGAGA 221
F1171 AACGAGGCTTCATGGAATTGGCGT
R1299 AGGAATGTGATTGGCTGGGCTTCT
128

2 结果与分析
2.1 耐冻性鉴定
3个马铃薯野生种在冷驯化 0 d的耐冻性差异极
显著, S. acaule 的 LT50 最低, 为–5.3 , ℃ S. cardio-
phyllum的 LT50最高为–1.8 (℃ 表 2)。冷驯化 12 d后,
S.commersonii 和 S.acaule 的 LT50 分别为–10.1℃

表 2 3个野生马铃薯的 LT50和冷驯化能力
Table 2 LT50 temperature and cold acclimation capability of three wild potato species
冷驯化 Cold treatment (LT50, ℃) 种名
Species 0 d 12 d
冷驯化能力
Cold acclimation capacity (℃)
S. commersonii –3.4±0.20 bB –10.1±0.31 aA 6.8±0.50 aA
S. acaule –5.3±0.08 aA –8.9±0.90 bA 3.5±1.15 bB
S. cardiophyllum –1.8±0.07 cC –2.3±0.42 cB 0.5±0.36 cC
平均值后的数据为标准误差, 数值后大小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上差异显著。
Data are mean plus standard error. The values followed by different letters are significantly different at P≤0.01 (capital letters) and
P≤0.05 (small letters).
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和–8.9 , ℃ 均与 S. cardiophyllum的 LT50具极显著差
异, 同时 S. commersonii和 S. acaule的冷驯化能力与
S. cardiophyllum的也具极显著差异。
2.2 FAD2基因的序列分析
通过引物 F1和 R1326扩增, 从 3个野生马铃薯
材料中分别都得到 1326 bp的片段(图 1)。序列测定
表明, 野生马铃薯 S. commersonii (图 3)、S. acaule
和 S. cardiophyllum的 FAD2基因编码区的核苷酸序
列长度均为 1326 bp, 编码 441个氨基酸, 分别命名
为 Cmm-FAD2 (GenBank 登录号为 KF214782)、
Aca-FAD2 (KF214781)和 Cph-FAD2 (KF214783)。
通过比对3个野生种 FAD2基因的核苷酸序列和
蛋白序列(图2), 发现共有18处核苷酸存在差异, 其
中在第33、第54、第134、第171、第210、第241、
第252和第267位核苷酸的不同导致该基因对应的氨
基酸残基改变, 其余10个核苷酸由于简并密码子的
原因并未引起相应氨基酸残基的变化。3个野生种的
FAD2基因编码的蛋白序列高度相似 , 同源性为
99.55%。在该基因蛋白序列的第11和第44氨基酸
残基处(图 3), 耐冻且有驯化能力的 S. commersonii
和 S. acaule 有相同的氨基酸, 而冷冻敏感 S. car-
diophyllum 的氨基酸却不同。S. commersonii 和 S.
cardiophyllu 在第 18、第 57、第 70、第 80、第 84
和第 89处的氨基酸残基与 S. acaule不相同。

图 1 野生马铃薯 FAD2基因扩增电泳图
Fig. 1 RT-PCR analysis of FAD2 genes from three Solanum
species
M: marker II (Tiagen Inc.); Lane 1 to 3 indicate PCR products of S.
commersonii, S. acaule, and S. cardiophyllum, respectively.

表 3 3个不同耐冻性野生马铃薯的 FAD2蛋白理化特性预测
Table 3 Physical and chemical properties prediction of FAD2 proteins from three wild potato species with different
levels of freezing tolerance
理化特性
Physicochemical property
S. cardiophyllum S. acaule S. commersonii
氨基酸残基数 Number of amino acids 441 441 441
分子量 Molecular weight (Da) 50855.1 50776.0 50810.9
分子式 Formula C2355H3568N612O610S20 C2354H3555N607O611S20 C2352H3552N608O614S20
理论等电点 Theoretical pI 9.02 8.87 8.79
半衰期 Estimated half-life (h) 30 30 30
不稳定指数 Instability index 46.42 45.03 45.55
稳定性 Stability 不稳定 Unstable 不稳定 Unstable 不稳定 Unstable
脂肪系数 Aliphatic index 88.91 88.25 88.03
正电荷氨基酸残基总数
Total number of positive charge residues
49 47 47
负电荷氨基酸残基总数
Total number of negative charge residues
39 39 40
总平均疏水性
Grand average of hydropathicity
–0.116 –0.104 –0.109
α螺旋 α-helix (%) 40.36 39.68 39.00
延伸链 Extend chain (%) 12.47 12.02 12.24
随机卷曲 Random coil (%) 44.67 45.12 45.12
β折叠 β-sheet (%) 2.49 3.17 3.63

第 1期 李 飞等: 三个耐冻性不同的马铃薯野生种中 FAD2基因的克隆及表达分析 49



图 2 3个野生马铃薯的 FAD2核苷酸序列比对
Fig. 2 Alignment of nucleotide sequences of FAD2 gene in three potato wild species

3 个野生种的 FAD2 基因都有一个保守结构域,
属于脂肪酸脱氢酶结构域(图 3), 该结构域从第 191
个氨基酸残基开始至第 397 个氨基酸残基结束。在
这 3个野生种 FAD2基因的蛋白序列中, 都有 4个跨
膜结构域 TM-1、TM-2、TM-3 和 TM-4, 同时三者
都具有高度保守的 H-boxI、H-boxII 和 H-boxIII 组
氨酸结构域(图 3), 这些组氨酸结构域可能参与氧化
还原反应中金属离子的络合反应。在跨膜结构域和
组氨酸结构域中, 3个野生种的 FAD2蛋白的氨基酸
残基并无差异, 但其分子式和分子量各不相同(表 3),
等电点在 8.79~9.02。半衰期时间都为 30 h, 稳定指
数为 45.03~46.42, 都是不稳定蛋白。三者 FAD2 蛋
白的正电荷数都小于负电荷数。总平均疏水性为
–0.116~ –0.104, 表明该蛋白都是亲水性的。通过二
级结构预测, 3个种的 FAD2蛋白序列中, 冷冻敏感
的 S. cardiophyllum 的 α-螺旋、延伸链和随机卷曲
的比例都大于耐冻且具有冷驯化能力的 S. commer-
sonii和 S. acaule, 而 β折叠的比例却小于后两者。
50 作 物 学 报 第 40卷



图 3 3个野生马铃薯的 FAD2蛋白序列比对
Fig. 3 Alignment of predicted amino acid sequences of FAD2 gene in three species
TM: 跨膜结构域; H-box: 组氨酸基序。TM: transmembrane domains; H-box: histidine box motifs.

2.3 进化关系分析
利用 Clustal 1.8.1软件对 36个物种间 FAD2基
因的氨基酸序列比较显示 , 番茄 FAD2 蛋白序列
(XP_004242585.1)与克隆得到的 S. commersonii、S.
cardiophyllum和 S. acaule的 FAD2蛋白序列同源性
最高, 分别为 96.6%、96.8%和 97.5%。利用 MEGA
5.05软件, 选择邻位相连法(NJ), 设定重复抽样次数
为 1000, 对 36 个物种的 FAD2 蛋白序列构建 NJ 系
统进化树(图 4)表明, 克隆的 3 个马铃薯野生种的
FAD2 基因和番茄(XP_004242585.1)的亲缘关系最近,
马铃薯野生种的 FAD2 基因进化较为独立, 除番茄
外与之相近的物种有马齿苋(ACB14275.1)。
2.4 基因表达分析
通过 qPCR对 3个野生种的 FAD2基因定量分析
表明, 12 d的冷驯化处理使得 FAD2基因在 3个野生
种中都上调表达, 但 S. commersonii和 S. acaule的
FAD2 基因表达水平分别是冷驯化前的 1.87 倍和
1.74倍, 均高于 S. cardiophyllum的FAD2基因的 0.94
倍(图 5)。方差分析结果表明, S. cardiophyllum分别
与 S. commersonii和 S. acaule之间 FAD2基因的上调
表达水平差异显著, 而 S. commersonii 和 S. acaule
之间 FAD2基因表达水平差异不显著。说明 FAD2基
因在耐冻和冷冻敏感的马铃薯野生种间表达水平差
异显著。
3 讨论
本研究表明 , 3个耐冻性不同的马铃薯野生种
的 FAD2基因与番茄的 FAD2基因亲缘关系最近, 其
次是马齿苋 , 且未比对到马铃薯 FAD2基因信息 ,
表明上述基因是首次在马铃薯中被克隆。对于很多
作物而言通过寒冷进行 FAD 基因表达的转录调控
已经是众所周知, 但关于番茄的 FAD2基因未见报
道。Teixeira 等[8]研究认为马齿苋在寒冷(5 )℃ 和叶
片受伤条件下 FAD2-2基因的相对表达量都增加 ,
在寒冷胁迫条件下观察到该基因没有发生累计效
应 , 但在寒冷胁迫和受伤2种处理条件下 , 该基因
的相对表达量也呈增加趋势 ; 马齿苋的 FAD2-2基
因可能一方面负责种子中储藏脂肪的脱氢作用, 另
一方面涉及在根、叶和茎中膜脂肪的脱氢作用。
Anastasia等[25]认为棉花的 FAD2-3和 FAD2-4基因的
表达都受低温调控 , FAD2-4的表达显著高于
FAD2-3。橄榄果实的 FAD2-1和 FAD2-2 [26-27]、白芸
豆叶片的 FAD2 [28]在转录水平均受低温调控。这些
研究结果都说明 FAD2基因在膜对寒冷胁迫的适应
过程中有直接作用。
Yang等[29]从佛手柑中克隆了 FAD2基因, 与 28℃
的对照相比, 在 6℃条件下 2 个基因型中 FAD2 基因
表达差异显著, 耐寒的 Aihu比寒冷敏感的 Qingpi的
FAD2 基因表达增加更早且更多, Aihu 植株叶片中的
亚麻酸含量显著增加, 表明 FAD2 基因的表达和基因
型间的耐寒性呈正相关。与之相似的是, 本研究中的
2个耐冻且能冷驯化的野生马铃薯与冷冻敏感的野生
马铃薯之间 FAD2基因的上调表达差异显著。可能是
FAD2 基因上调表达增加不饱和脂肪酸的含量从而提
高膜脂质的流动性, 最终使得耐冻性得到提高。在耐
冻性鉴定结果中已证实, 通过 12 d的冷驯化, S. com-
mersonii和 S. acaule的 LT50分别提高了 6.8℃和 3.5 , ℃
而冷冻敏感的 S. cardiophyllum仅仅提高了 0.5℃。
第 1期 李 飞等: 三个耐冻性不同的马铃薯野生种中 FAD2基因的克隆及表达分析 51



图 4 不同物种间 FAD2氨基酸序列 NJ树分析
Fig. 4 Neighbor-joining tree of FAD2 amino acid sequences in different species

关于 FAD2基因的功能, Shi等[30]研究认为, 转
OsFAD2基因的水稻植株抗寒性比野生型植株的抗
寒性有所提高, 在10℃条件下, 野生型植株不久就
萎蔫且生长停滞, 但转基因株系仅叶尖有轻微的卷
曲症状。周洲[31]将毛白杨 PtFAD2转入银腺杨中, 转
基因株系 F2-100、F2-35与野生型植株相比, 亚油酸
(C18:2)含量提高5.7%和7.1%; 亚麻酸(C18:3)含量提
高3.2%和2.1%。在–4℃处理3 h 后, F2-100和 F2-35
的扦插苗的存率分别为60.0%±5.7%和56.6%±3.3%,
而野生型存活率仅为37.6%±3.3%。酵母中表达绿
藻 fad2基因 , 低温条件下转录物浓度上调 , 提高
了酵母的抗冷能力 , 它可能参与低温适应并与其
耐冻性有关 [32]。外源表达向日葵的 FAD2基因增加
了酵母脂质的不饱和指数和膜脂流动性, 其耐盐性
和耐冻性得到提高[33]。综上所述, 这些研究结果都
充分证明 FAD2基因在不饱和脂肪酸合成途径中
52 作 物 学 报 第 40卷



图 5 冷驯化后 3个马铃薯野生种的 FAD2基因表达量
Fig. 5 Expression quantity of FAD2 genes from three wild
potato species after cold acclimation
误差线代表的是标准误差。Error bars represent standard error.

的关键作用, 对于提高植物的耐冻性有重要意义。
关于马铃薯 FAD2 基因的功能, 我们还需要做进一
步的研究。本研究对马铃薯的耐冻育种以及阐述野
生马铃薯耐冻的分子机制都有重要的意义。
4 结论
从 3 个耐冻性差异较大的马铃薯野生种 S.
commersonii、S. cardiophyllum和 S. acaule中克隆出
FAD2基因, 该基因在耐冻和冷冻敏感的马铃薯野生
种中存在氨基酸残基差异。耐冻且有冷驯化能力的
S. commersonii和 S. acaule的 FAD2蛋白与冷冻敏感
的 S. cardiophyllum FAD2蛋白的 α-螺旋、延伸链和
随机卷曲存在明显差异。FAD2基因在耐冻的野生种
S. commersonii 和 S. acaule 中的上调表达显著高于
冷冻敏感的 S. cardiophyllum, 可能是 FAD2 基因上
调表达增加了不饱和脂肪酸的含量从而提高膜脂质
的流动性, 最终使 S. commersonii和 S. acaule耐冻性
得到进一步的提高。
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