全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(7): 10561063 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家科技支撑计划项目 (2014BAD11B04), 山东省农业重大应用技术创新项目 , 山东省自主创新成果转化重大专项
(2012ZHZXIA0418), 山东省自然科学基金项目(ZR2011CQ042), 山东省农业科学院科技创新重点项目(2014CXZ06-6), 国家现代农业
产业技术体系建设专项(CARS-14), 山东省良种产业化工程项目和国家国际科技合作专项(2015DFA31190)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 万书波, E-mail: wansb@saas.ac.cn; 李新国, E-mail: lixinguo@tom.com
第一作者联系方式: E-mail: yangsha0904@126.com, Tel: 0531-83179692
Received(收稿日期): 2014-11-06; Accepted(接受日期): 2015-05-04; Published online(网络出版日期): 2015-05-15.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150515.1542.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01056
利用酵母双杂交系统筛选花生 AhCaM相互作用蛋白
杨 莎 1 李 燕 1 郭 峰 1 张佳蕾 1 孟静静 1 李 萌 2 万书波 2,*
李新国 1,*
1山东省农业科学院生物技术研究中心 / 山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室, 山东济南 250100; 2山东省农业科学院, 山东
济南 250100
摘 要: CaM是目前已知的胞内 Ca2+受体蛋白中最重要的一种, 参与多种生理活动的调节。为深入研究 CaM蛋白的
作用机制 , 探索其在花生钙信号途径中的作用靶点 , 用花生 CaM 基因构建了既无自激活性又无毒性的
pGBKT7-AhCaM诱饵表达载体; 同时从花生叶片组织中提取总 RNA, 分离得到 mRNA, 利用 SMART技术合成并纯
化双链 cDNA 后建立花生叶片 cDNA 文库; 通过共转化法筛选与 CaM 相互作用的蛋白, 并对阳性克隆分析和鉴定,
筛选到 5 个与 AhCaM 互作的蛋白, 其中 NAD 激酶是已知能与钙调素互作的蛋白; 而泛素能与 AhCaM 互作, 说明
AhCaM 在花生发育及抗逆方面起作用。通过分析这些靶蛋白的已知功能, 为研究 AhCaM 的未知生物学功能提供了
重要信息。
关键词: 花生叶片 cDNA文库; AhCaM; 泛素; 酵母双杂交系统; 蛋白质相互作用
Screening of AhCaM-Interactive Proteins in Peanuts Using Yeast Two Hybrid
System
YANG Sha1, LI Yan1, GUO Feng1, ZHANG Jia-Lei1, MENG Jing-Jing1, LI Meng2, WAN Shu-Bo2,*, and LI
Xin-Guo1,*
1 Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences / Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improve-
ment, Ecology and Physiology, Ji’nan 250100, China; 2 Shandong Academy of Agricultural Sciences, Ji’nan 250100, China
Abstract: Calmodulin is the most important known receptor of intracellular Ca2+, which is involved in regulation of many
physiological activities. To further study the mechanism of CaM, we isolated and identified proteins that interact with AhCaM by
yeast two-hybrid system. The pGBKT7-AhCaM bait vector without toxicity or auto-activation was firstly constructed with the
peanut CaM gene. Then, the total RNA of peanut leaf was extracted and the mRNA was isolated, purified to be used as the tem-
plates to synthesize ds-cDNA by SMART technology. Ds-cDNA was amplified by long distance PCR. At last, the CaM interaction
proteins were screened through co-transformation with bait vector and cDNA prey library. In the peanut cDNA library, five pro-
teins interacting with AhCaM were identified. Among them, NAD kinase was a well-known protein to interact with CaM protein,
and ubiquitin could interact with AhCaM, playing a role in development and stress resistance. The significant functional correla-
tion between AhCaM and its interacting proteins peanut will help to elucidate the possible mechanisms of AhCaM in improving
the tolerance of transgenic plants.
Keywords: cDNA library of peanut leaf; AhCaM; Ubiquitin; Yeast two hybrid system; Protein interaction
花生是以种子为经济指标的喜钙作物, 在缺钙
条件下常出现胚败育而导致减产[1]。Ca2+信号通路是
植物中已确认的主要信号转导途径, 以Ca2+和CaM
为核心的钙信使系统在植物对外界信号的感受、传
第 7期 杨 莎等: 利用酵母双杂交系统筛选花生 AhCaM相互作用蛋白 1057
递和响应过程中起作用[2-3]。然而钙调素本身并没有
任何酶活性, 只有活化后进一步与其靶蛋白中的短
肽序列结合, 才能诱发其结构变化, 从而调控植物
细胞分裂、伸长、生长、发育和抗逆等 [4], 因此
Ca2+-CaM信号转导的差异性主要依赖于它的靶蛋白,
分离出更多的靶蛋白将有助于探明Ca2+/CaM调控通
路的分子机制, 了解CaM的多种作用途径, 为提高
花生产量提供理论依据。CaM广泛地分布于几乎所
有已知的真核生物中 , 是由148个氨基酸组成的单
链可溶性球蛋白 , 分子量约16 700, 具较好的热稳
定性、酸性和保守性[5]。CaM具有EF和CD两种手型
结构, 在空间构型上有很大的灵活性和化学上的稳
定性, 当细胞内钙离子浓度升高时, 钙离子会结合
到钙调素结合蛋白的EF手型结构域上破坏钙调素结
合蛋白的氢键网络, 释放钙调素结合结构域, 结合
了钙离子的钙调素再结合到钙调素结合蛋白上, 从
而将信号传导下去[6-7]。
研究表明, 钙离子参与包括干旱、盐胁迫、冷
和热刺激在内的非生物胁迫应答, 不同的非生物胁
迫信号能改变细胞内钙离子水平, 这是植物应答非
生物胁迫的早期报道[8]。遗传学研究显示钙调素相
关的信号途径在胁迫应答中发挥调节作用, 非生物
刺激诱导的钙调素或钙调素类似蛋白在很多植物中
已被鉴定出来, 并且作为诱饵蛋白通过蛋白之间的
相互作用分离得到下游的靶蛋白, 钙调素或钙调素
类似蛋白及其下游结合蛋白在植物适应非生物胁迫
中具有重要作用。Ca2+/CaM可以通过磷酸酶(PP7)调
节热刺激转录因子(HSF1)的活性, 从而增强热激蛋
白的表达, 提高耐热性[9]; 在钙离子介导的对盐胁迫
的应答中, 钙调素也是重要的感知分子[10], CaM结合
到At-MYB2上 , 从而提高MYB2的DNA结合活性和
转录活性, 提高盐耐受能力[11]。对于冷适应的调节,
则是通过钙/钙调素受体激酶(CRLK1)实现的[12]。后
来研究发现, 无论在植物体外还是体内CRLK1都能
与有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶家族成员MEKK1
相互作用[13]。在crlk1突变株中, 寒冷触发的MAP激酶
活性被抑制, 并且冷诱导的涉及MAP激酶活性信号
的表达水平也发生改变。迄今为止, 关于花生中CaM
的功能及其相互作用蛋白的研究尚未见报道。
我们从花生叶片中分离得到钙调素基因, 前期
研究发现, 花生中CaM可以调控叶黄素循环介导的
热耗散过程, 从而提高高温强光胁迫下花生叶片光
合机构的稳定性及其抗逆性[14]。为了进一步找出响
应逆境胁迫的钙调素下游靶蛋白, 本试验利用酵母
双杂交技术, 筛选和初步研究与花生CaM相互作用
的蛋白, 为解决更多的钙介导的相关基因调控问题,
深入了解钙和钙/钙调素调节的基因网络打好基础,
将有助于开发新的花生品种, 加强对环境胁迫的耐
受性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用生产上广泛种植的花生(Arachis hypogaea
L.)品种花育 22。克隆载体 pMD18-T购自 TaKaRa公
司 , 诱饵表达载体 pGBKT7、pGADT7、酵母菌株
AH109、Y187 购自 Clontech 公司。酵母双杂交试剂
盒 BD Matchmaker Library Construction ＆ Screening
Kits、Aureobasidin A (AbA)、酵母培养和转化试剂购
自 Clontech 公司。酵母质粒提取试剂盒(TIANprep
Yeast Plasmid DNA Kit)和总 RNA提取试剂盒(Plant
RNAprep Plant Kit)购自北京天根生化公司, DNA重
组所用各种酶、DNAmarker、胶回收纯化试剂盒、LB
培养基胰蛋白胨和酵母提取物购自 TaKaRa 公司, 引
物合成和测序由上海生物工程公司完成。
1.2 诱饵蛋白表达载体构建
用基因特异引物5′-CATATGATGGCGGATCCG
CTCACC-3′ 和 5′-CTGCAGCTAGGCCATCATGACC
TTG-3′通过高保真聚合酶 Primer star PCR扩增
AhCaM基因CDS区 (420 bp), 连到pMD18-T克隆载
体 , 同时在其两端引入Nde I和Pst I酶切位点 , 将
PCR产物回收, 并与pGBKT7载体同时进行双酶切,
酶切产物回收后采用T4 DNA连接酶连接过夜 , 并
转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, PCR鉴定得到阳性
转化子, 经酶切和测序验证。
1.3 诱饵蛋白毒性及自激活检测
将构建的 pGBKT7-AhCaM 质粒和 pGBKT7 空
载体分别转化 Y2HGold 酵母感受态细胞 , 涂布于
SD/–Trp、SD/–His/–Trp、SD/–Trp/–Ade固体培养基
上, 观察 pGBKT7-AhCaM和 pGBKT7空载体菌落生
长状况。进一步用蓝白斑筛选试验, 确定诱饵蛋白
是否具有自激活。挑取 SD/–Trp/X-α-gal平板上的单
菌落(直径大于 2 mm)接种于 SD/–Trp/Kan液体培养
基, 30℃振荡培养(250转 min–1), 24 h内 OD600能否
超过 0.8, 以检测诱饵蛋白是否含有毒性。
1.4 花生 cDNA文库的构建
将生长 21 d 的花生幼苗进行高温(40℃)强光
1058 作 物 学 报 第 41卷
(1200 μmol m–2 s–1 PFD)处理 6 h, 采用 RNAprep
pure Plant Kit 试剂盒(TIANGEN, Beijing)提取处理
后的花生叶片总 RNA, 采用 SMART MMLV Re-
verse Transcriptase (Clontech, BD), 以 CDS III
Primer 和 SMART III Oligo 反转录合成 cDNA 第 1
链, 并通过 Advantage 2 Polymerase LD-PCR扩增合
成 dsDNA, 最后通过 CHROMA SPINTM TE-400柱
纯化回收大于 500 bp dsDNA, 转入 Y187酵母菌株,
构建花生叶片 cDNA文库。
1.5 酵母的共转化筛选
采用醋酸锂的方法制备酵母感受态细胞 , 在
10 mL 的灭菌离心管中加入 20 μL dscDNA, 6 μL
pGADT7-Rec, 5 μL pGBKT7-AhCaM, 20 μL变性处
理的 Herring Tests Carrier DNA, 600 μL酵母感受态
细胞以及 2.5 mL 新鲜配制的 PEG/LiAc 溶液, 混匀
后, 30℃温育 45 min, 加入 160 μL DMSO, 42℃水浴
热休克 20 min, 离心弃上清液, 重悬沉淀于 3 mL
YPD Liquid Medium中, 30℃摇培 90 min, 离心, 弃
上清液, 重悬沉淀于 800 μL 0.9% NaCl 中, 取 150
μL 共转化产物涂布于四缺培养基 SD/–Ade/–His/–
Leu/–Trp, 筛选花育 22中与 AhCaM互作的蛋白, 30
℃培养直至菌落长出。同时将共转化产物涂布于培
养基 SD/–Leu, SD/–Leu/–Trp计算转化效率。挑取四
缺培养基 SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 上的得到的大于
2 mm 的克隆 , 采用郭佳岩等 [15]的方法进行快速
LacZ基因验证, 8 h内呈现蓝色的初步认定为阳性克
隆。挑取阳性克隆少量菌体, 以 LD Amplifier 为引
物 5′ LD Amplimer: 5′-CTATTCGATGATGAAGATAC
CCCACCAAACCC-3′; 3′ LD Amplimer: 5′-GTGAA
CTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′, 进行
菌落 PCR分析以排除重复克隆。将已确定的插入外
源片段的阳性克隆送至上海生工生物技术服务公司
测序, 在 GenBank上比对、分析测序结果。
1.6 AhCaM与 AhUbiquitin的互作验证
将 pGBKT7-AhUbiquitin质粒和 pGADT7-AhCaM
质粒共转化酵母菌 Y2HGold, 涂布于缺失培养基
(SD/–Trp/–Leu)上培养, 待菌落长出后接种于 SD/–
Trp/–Leu/–His/–Ade/X-α-gal 培养基, 观察菌落生长
情况。
2 结果与分析
2.1 诱饵载体的构建及序列测定
以花生叶片 cDNA为模板, 并用 TaKaRa公司的
高保真酶扩增目的基因AhCaM, 扩增得到CaM长度
为 447 bp, 编码 149个氨基酸。经 Nde I和 Pst I酶
切后与 pGBKT7 连接, 形成在 ADH1 启动子驱动下
表达的 GAL4 BD-AhCaM融合蛋白(图 1)。经双酶切
鉴定、PCR (图 2)和测序分析表明, AhCaM在重组质
粒上读码框正确, 序列与文献报道完全一致。AD-
prey是在 pGADT7上构建的花生 cDNA文库(图 1)。
图 1 BD-bait和 AD-prey载体示意图
Fig. 1 Schematic diagram of BD-bait and AD-prey
图 2 BD载体构建及酶切鉴定
Fig. 2 Restriction enzyme digestion analysis of the clones
pGBKT7-AhCaM
M: trans 2K Plus II DNA marker; 1: AhCaM基因全长扩增;
2: pGBKT7-AhCaM双酶切。
M: trans 2K Plus II DNA marker; 1: isolation of full length cDNA
of CfCBF3; 2: pGBKT7-AhCaM digested by Nde I and Pst I.
2.2 诱饵蛋白载体自激活和毒性检测
含有诱饵蛋白 pGBKT7-AhCaM 的转化菌在
SD/–Trp培养基上菌落呈白色, 生长良好, 菌落直径
>2 mm (图 3), 蓝白斑筛选试验中未变色。在 SD/–
His–Trp, SD/–Ade/–Trp 培养基上未见菌落生长, 且
空白对照组也未见菌落生长 , 说明诱饵蛋白
pGBKT7-AhCaM 不能自激活。接种于 SD/–Trp/Kan
克隆子在 30℃振荡培养 24 h后, OD600>0.8, 说明诱
饵蛋白无毒性, 可以直接用于酵母双杂交文库筛选。
2.3 花生叶片 cDNA文库建立
提取花生幼苗叶片总 RNA, 电泳检测 RNA 的
完整性。显示, 28S rRNA和 18S rRNA条带清晰, 说
明所提取花生的总 RNA 完整性好(图 4-A), 没有发
生降解, 符合建库要求。利用 PolyATtract mRNA
第 7期 杨 莎等: 利用酵母双杂交系统筛选花生 AhCaM相互作用蛋白 1059
Isolation System III从总RNA中分离mRNA (图 4-B),
并以此 mRNA 为模板 , 用 CDS III Primer 引
图 3 pGBKT7-AhCaM自激活检测
Fig. 3 Auto-activation test of pGBKT7-AhCaM
物反转录合成 cDNA (图 4-C), 得到的基因较完整,
序列都是正向的 , 比以往制备文库的方法更加完
善。将双链 cDNA过柱纯化(图 4-D), 除去 200 bp以
下的小片段。通过同源重组把纯化的双链 cDNA 整
合到 pGADT7-Rec 载体上, 再转化进入酵母 Y187
中, 得到所需的 cDNA文库, 保存于–80℃冰箱。
2.4 花生中 AhCaM相互作用蛋白的筛选
以 pGBKT7-AhCaM 为诱饵筛选花生叶片
cDNAs 文库, 将文库质粒转入含有诱饵蛋白表达载
体 pGBKT7-AhCaM 的酵母细胞 Y2HGold, 在 SD/–
Trp/–Leu/–His/–Ade 培养板上培养至菌落出现 , 重
新接种于新的 SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade/X-α-gal选择
培养基, 30℃培养 24~36 h, 得到单克隆(图 5)。之后
用菌落 PCR 方法初筛(图 6-A), 除去 500 bp 以下的
小片段, 再利用酶切方法鉴定(图 6-B)。最后选择酶
图 4 cDNA文库的建立
Fig. 4 Construction of a two-hybrid library
M1: 12 000 bp DNA marker; M2: 10 000 bp DNA marker; M3: 1200 bp DNA marker; 1: RNA的提取; 2: mRNAs的分离; 3: 双链 cDNAs
合成; 4: 双链 cDNAs过柱纯化。
M1: 12 000 bp DNA marker; M2: 10 000 bp DNA marker; M3: 1200 bp DNA marker; 1: total RNA analysis; 2: isolation of mRNAs; 3: simple
of ds-cDNAs; 4: purify ds cDNAs with CHROMA SPIN TE-400 Columns.
图 5 花生 cDNA文库与 AhCaM共转化后在
SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade/X-α-gal四缺板的筛选
Fig. 5 CaM interaction proteins screened through
co-transformation with bait vector and cDNA prey library on
SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade/X-α-gal plate
切大小不同的单克隆提取质粒进行核苷酸序列测定,
通过测序及与 GenBank 数据库同源性比较, 将得到
的相同结果视为一个, 并将载体的阅读框与目的基
因不同的克隆排除掉, 最终获得 NAD激酶、电压依
赖性阴离子通道、泛素、根瘤素酶及乙醇脱氢酶 5
个无重复性克隆, 并从中选择与抗逆相关的重要蛋
白 NAD激酶(NAD kinase)、电压依赖性阴离子通道
(voltage dependent anion channel)及泛素(ubiquitin)进
行进化树分析(图 7)。
2.5 相互作用酵母体内验证
为进一步验证 AhCaM与靶蛋白 AhUbiquitin的
相互作用, 分别将 AhUbiquitin/pGADT、AhUbiquitin/
AhCaM、AhCaM/pGBKT7、阴性对照及阳性对照质
1060 作 物 学 报 第 41卷
图 6 AhCaM互作蛋白的鉴定
Fig. 6 Identification of AhCaM-interactive proteins
M: trans 2K Plus II DNA marker; A: 用 PCR检测酵母双杂交 cDNA文库插入片段大小; B: 对选取的阳性克隆用 Taq I酶切鉴定。
M: trans 2K Plus II DNA marker; A: PCR detection of inserts from yeast two-hybrid cDNA library; B: screening of positive clones from AD
plasmids by restriction digestion.
图 7 AhCaM互作蛋白进化树分析
Fig. 7 Phylogenetic analysis of AhCaM-interactive proteins
粒转入酵母菌株 Y2HGold, 涂在 SD/–Trp–Leu (DDO)
和 SD/–Trp–Leu–His–Ade (QDO/A/X)的培养基上 ,
30℃培养 3~5 d, 结果表明, 在 DDO 上阳性克隆都
能正常生长(图 8), 而在 QDO/A/X 培养基上筛选,
只有阳性对照、AhCaM 与靶蛋白 AhUbiquitin 同时
存在并相互作用时才会长出变蓝的单克隆, 验证了
筛选得到阳性克隆的准确性, 同时降低了假阳性的
可能性。
3 讨论
2007年孟玉环等[16]首次从花生中分离得到钙调
素蛋白, 然而未进一步研究其功能。本实验室初步
研究表明, AhCaM 参与对花生叶黄素循环途径的调
控, 从而有利于逆境胁迫条件下耗散掉过剩能量以
保护光系统反应中心[14]; 而且过量表达该基因的转
基因烟草植株耐盐性有显著提高(未发表资料), 说
第 7期 杨 莎等: 利用酵母双杂交系统筛选花生 AhCaM相互作用蛋白 1061
图 8 酵母双杂交系统验证 AhCaM与 AhUbiquitin相互作用
Fig. 8 Yeast two-hybrid analysis of interaction between AhCaM and AhUbiquitin
明 AhCaM 蛋白能够在提高植物抗逆性方面发挥作
用, 但在花生中 CaM提高植物抗逆性的具体分子机
制和其他方面的生物学功能还不清楚。酵母双杂交
技术是研究蛋白质间相互作用的有效分子生物学方
法, 在分析新基因的生物学功能和发现新的作用蛋
白质方面有着广泛应用[17-18]。在本研究中, 我们成
功地利用酵母双杂交系统筛选到了与 AhCaM 蛋白
相互作用的5个靶蛋白 , 通过对这些靶蛋白的进化
及功能分析, 不仅对AhCaM在植物抗逆的分子机制
方面有所了解, 还为探索AhCaM蛋白的未知生物学
功能提供了新线索。
利用美国国立生物技术信息中心数据库(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), 对得到的靶蛋白进
行结构功能域和同源性分析。结果发现, 筛选到 5
种与 AhCaM 互作的蛋白, 包括 NAD 激酶、电压依
赖性阴离子通道、泛素、根瘤素酶及乙醇脱氢酶。
其中NAD激酶是已知与钙调素互作的蛋白, 是植物
细胞内 CaM所作用的重要靶酶之一[19]。该蛋白广泛
存在于各种植物细胞内, 是目前所发现的唯一能催
化NAD磷酸化生成NADP的酶, 这一过程对细胞内
的许多代谢过程有重要的调控作用。其中 CaM可以
通过 NAD 激酶来对光合作用起调节作用[20], 因为
光反应的最终电子受体正是 NAD 激酶所催化的反
应产物 NADP。除此之外, CaM与 NAD激酶相互作
用在植物发育、抗逆等途径中均起重要作用。电压
依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel,
VDAC)作为线粒体外膜上分子或离子交换的一种出
入通道, 在钙稳态维持和细胞活性调节中起关键作
用。大量证据表明, 线粒体 Ca2+转运既可影响线粒
体基质内 Ca2+敏感代谢酶的活性, 调控线粒体能量
代谢, 也可通过摄取或释放 Ca2+而调控胞内的 Ca2+
浓度[21]。其中过度表达 VDAC-GFP, 可允许 Ca2+从
内质网释放后, 快速扩散到线粒体内, 增加线粒体
基质中 Ca2+的浓度[22]。研究报道, 由 VDAC本身的
功能状态或与 ROS、Ca2+、HK、Bcl-2以及谷氨酸、
腺嘌呤核苷酸等物质的相互作用可以推测, CaM 很
可能通过与 VDAC间的相互作用调节 VDAC的开放、
关闭, 在线粒体功能和细胞钙信号之间的相互影响中
发挥作用[23]。
植物在逆境条件下 , 由于活性氧伤害等原因 ,
会造成无功能蛋白质的积累增加, 因此逆境条件下
加强无功能蛋白质的清除能力对于提高生物的逆境
适应能力就显得很重要。在许多情况下, 受损蛋白
在各种分子伴侣的协助下可以得到一定程度的修复
或重新折叠[24]。但是一旦异常蛋白积累过多, 通过
蛋白降解途径及时清除“垃圾”, 就成为一种重要的
解决方式。已有研究发现这些蛋白质的降解与泛素
/26S 蛋白酶体通路介导无功能蛋白质的降解关系密
切[25]。泛素是一种由 76个氨基酸残基组成的小分子
量蛋白质, 广泛存在于各种真核生物中。细胞内需
要降解的靶蛋白首先在 ATP的作用下被泛素标记形
成缀合物, 这个过程称为泛素化。泛素化过程循环
下去, 目标蛋白就被运输到 26S 蛋白酶体降解。目
前研究较为深入的是 Ub/26S 蛋白酶体途径参与植
物响应干旱胁迫[26]、盐胁迫[27]、热胁迫[28]等逆境过
程。除此之外, 植物细胞中光敏素可与泛素结合。
植物细胞中 Pfr 型光敏素的量是严格控制的, 一旦
产生就会迅速被降解, 而 Ub/26S蛋白酶体途径介导
Pfr 的降解[25]。这一发现首次表明 Ub/26S 蛋白酶体
途径参与病原体防御[29]。目前, 人们对泛素途径的
组成和在生物体内的功能已经有了较深刻的认识。
本试验通过酵母双杂交系统将钙调素与泛素联系起
1062 作 物 学 报 第 41卷
来, 并已对这 2个蛋白之间的相互作用进行了验证。
而对于根瘤素酶(extensin/nodulin protein)和乙醇脱
氢酶(alcohol dehydrogenase)的研究目前多集中在人
和动物, 植物中的功能研究较少, 有研究表明逆境
胁迫可诱导拟南芥中根瘤素酶的表达[30]。
综上所述 , 本研究从花生叶片cDNA文库中获
得多个与AhCaM相互作用的靶蛋白。通过分析这些
靶蛋白的生物学功能, 发现它们均参与植物逆境胁
迫的响应。初步提出了AhCaM提高植物抗逆性的可
能分子机制, 可以相信, 对AhCaM功能及作用机制
的深入研究必将大大推动植物钙信号调控途径在提
高花生抗逆机制中的研究与应用, 为改良花生品质,
培育抗逆新品种提供重要理论依据。
4 结论
利用酵母双杂交筛选花生叶片中CaM相互作用
蛋白, 获得 5个初步验证的阳性克隆。测 AhCaM基
因可能通过与这些蛋白结合, 在维持细胞结构的稳
定及抗逆过程中起作用。
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