全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(3): 376388 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31170650), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-23), 浙江省自然科学基金项目(LY14C160001),
浙江省农业新品种选育重大专项(2012C2905-3)和中国农业科学院科技创新工程项目(CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31170650), the Earmarked Fund for China Agriculture Re-
search System (CARS-23), the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY14C160001), the Major Project for New Agricultural
Varieties Breeding of Zhejiang Province (2012C2905-3) and the Chinese Academy of Agricultural Sciences through an Innovation Project for
Agricultural Sciences and Technology (CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS).
* 通讯作者(Corresponding authors): 杨亚军, E-mail: yjyang@mail.tricaas.com, Tel: 0571-86653162; 肖斌, E-mail: xiaobin2093@sohu.com
第一作者联系方式: E-mail: jajyqian9066@mail.tricaas.com
Received(收稿日期): 2015-08-12; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(网络出版日期): 2015-12-18.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151218.0915.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00376
茶树中性/碱性转化酶基因 CsINV10的克隆与表达分析
钱文俊 1,2 岳 川 2 曹红利 2 郝心愿 2 王 璐 2 王玉春 1,2
黄玉婷 2 王 博 2 王新超 2 肖 斌 1,* 杨亚军 1,2,*
1西北农林科技大学园艺学院, 陕西杨凌 712100; 2中国农业科学院茶叶研究所 / 国家茶树改良中心 / 农业部茶树生物学与资源利用
重点实验室, 浙江杭州 310008
摘 要: 基于课题组前期对茶树冷驯化系统的转录组测序分析结果, 从中挑选出 6 条与中性/碱性转化酶基因高度相
似的 EST序列, 电子拼接和 RT-PCR验证后获得一条全长为 2101 bp的核酸序列。该基因包含 1923 bp的 ORF, 编码
640个氨基酸, 蛋白分子量为 71. 8 kD, 理论等电点为 5.69。根据 BlastX同源性比对显示, 该基因与荔枝 LcNI相似
性最高(80%), 为 G100家族成员, 属于中性/碱性转化酶基因, 将其命名为 CsINV10 (GenBank登录号为 KT359348)。
对 CsINV10氨基酸序列的系统进化树分析显示, 其与木薯 MeNINV8亲缘关系最近。进一步分析显示, CsINV10的氨
基酸序列无 N端信号肽, 无跨膜结构域, 属于亲水性蛋白, 并定位在叶绿体上。荧光定量 PCR分析表明, CsINV10具
有组织表达特异性, 在茶树叶和花中的表达量最高, 根系中最低。分析发现, 低温(4℃)、干旱和盐胁迫分别处理茶树
1 d 后, 成熟叶片中 CsINV10 的表达呈逐渐上升趋势; 而在 ABA 条件处理下, 该基因呈先升高后降低趋势, 在处理
5 d 后基本不表达, 表明该基因可能参与茶树对多种逆境胁迫的响应, 这为后续进一步研究转化酶基因在茶树抗寒
等逆境胁迫中的作用奠定基础。
关键词: 茶树; 中性/碱性转化酶基因; 定量分析
Cloning and Expression Analysis of a Neutral/alkaline Invertase Gene
(CsINV10) in Tea Plant (Camellia sinensis L. O. Kuntze)
QIAN Wen-Jun1,2, YUE Chuan2, CAO Hong-Li2, HAO Xin-Yuan2, WANG Lu2, WANG Yu-Chun1,2, HUANG
Yu-Ting2, WANG Bo2, WANG Xin-Chao2, XIAO Bin1,*, and YANG Ya-Jun1,2,*
1 College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 Tea Research Institute of Chinese Academy, Agricultural Sci-
ences / National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou
310008, China
Abstract: Based on the comprehensive RNA-Seq analysis of tea plant during cold acclimation stage, we picked out six ESTs
sequences with a high similarity to neutral/alkaline invertase gene to get a splicing. As a result, a full-length of 2101 bp nucleotide
sequence was obtained from tea plant after validated by using RT-PCR technique. Bioinformatics analysis showed that the se-
quence containing 1923 bp ORF (Open Reading Fram) and encoding 640 amino acid residues with a putative molecular mass of
71.8 kD and theoretical isoelectric point of 5.69, was named as CsINV10 (GenBank accession number: KT359348). BlastX and
phylogenetic analysis indicated that the protein encoded by CsINV10 shared the highest identity (80%) with LcNI in Litchi, and
had a closest genetic relationship with MeNINV8 in Manihot esculenta Crantz. Also, CsINV10 as a neutral/alkaline invertase gene
could be classified into G100 family. The protein had no N-terminal signal peptide and transmembrane domain, and was predi-
第 3期 钱文俊等: 茶树中性/碱性转化酶基因 CsINV10的克隆与表达分析 377


cated to be a hydrophilic protein localized in chloroplast. The expression analysis of CsINV10 under different abiotic stress condi-
tions showed that cold, PEG and salt stresses could gradually promote the expression of CsINV10 when treated for one day, how-
ever, it had a transient increase when treated by ABA for three hours. Consequently, we speculated that CsINV10 might be in-
volved in the tea plant response to abiotic stresses. Moreover, we found that CsINV10 had a tissue-specific expression pattern in
leaf and flower. These results provide a theoretical basis for the functional analysis of invertase genes of tea plant in response to
various stresses.
Keywords: Tea plant (Camellia sinensis); Neutral/alkaline invertase gene; Expression analysis
蔗糖作为非还原型双糖, 在大多数植物中基于
异养型组织的生理和生化需要, 被运送到不同的亚
细胞区域, 水解为葡萄糖和果糖, 参与到三羧酸循
环和糖酵解途径中, 以维持植物正常生长发育和对
逆境胁迫的抗性。双糖中的碳可用于生物合成原初
代谢, 对植物生长发育非常重要。同样, 蔗糖可能转
化为聚合物, 如淀粉、三酸甘油酯或多肽用于长期
储存; 或者形成次级化合物使植物能够适应各种生
物和非生物逆境胁迫[1]。蔗糖作为碳水化合物和能
量的来源, 关键在于其能够水解为己糖, 在植物中
主要靠两类蔗糖水解酶来催化这一反应: (i)蔗糖合
成酶(Suc, EC2.4.1.13), 是一类糖基转移酶, 能够可
逆水解蔗糖形成尿苷二磷酸葡萄糖和果糖, 主要在
器官成熟过程中参与维持库强的稳固和合成库产物
方面起作用; (ii)转化酶(INV, EC3.2.1.26), 能够不可
逆地将蔗糖水解为葡萄糖和果糖, 在蔗糖分布和调
控“库—源”关系方面具有十分重要的作用[2-4], 同时,
该类酶能广泛参与调控植物生长、信号响应、原初
碳代谢和逆境胁迫响应等方面[5-8]。
根据不同的细胞定位, 转化酶可以分为胞质转
化酶 (cytoplasmic invertase, CIN)、液泡转化酶
(vacuolar invertase, VIN)和细胞壁结合转化酶(cell
wall invertase, CWIN)三类, 其中 CIN又可分为 α和
β 亚族, α 亚族主要定位于细胞器, 如线粒体和叶绿
体; β亚族则主要定位于核内。而根据其生化活性和
pH的不同又可分为酸性转化酶(acid invertase, AI)和中
性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase, A/N-Inv)[9],
前者 pH 在 5.0 左右时有较高的酶活性, 而后者 pH
6.5~8.0 左右时具有较高的转化酶活性。A/N-Inv 还
存在 2种不同的异构体, 最佳酶活 pH为 6.5时为中
性转化酶, pH为 8.0时为碱性转化酶[10]。
目前, 关于转化酶在植物中作用的研究已经非
常广泛, 特别是对酸性转化酶的研究, 涉及到酸性
转化酶对植物生长发育、开花结果、生物和非生物
逆境胁迫响应等各方面 [11-18]。然而, 由于 A/N-Inv
并未被糖基化, 蛋白很难纯化, 具有不稳定性和较
低的酶活性, 使得目前关于这类酶的研究较之酸性
转化酶少。近年来, 陆续在胡萝卜[4]、小麦[10]、拟
南芥[19]、水稻[20]、葡萄[21]、杨树[22]、百脉根[23]、甘
蔗[24]、番茄[25]、木薯[26]等中克隆出 A/N-Inv 基因。
最近的研究表明, A/N-Inv在植物生长和发育、能量
代谢、碳水化合物平衡和环境胁迫响应方面也发挥
着重要作用[10, 27-30]。借助于植物中的 A/N-Inv基因突
变, 证明 A/N-Inv基因在植物生长发育中发挥重要作
用。例如, 在拟南芥中有研究表明 A/N-Inv功能的丧
失能够降低根系原初生长[28,31], 另外, 敲除拟南芥叶
绿体中一个At-A/N-InvE能够降低拟南芥中A/N-Inv活
性, 并且在突变体植株中既检测不到 A/N-Inv 活性
也检测不到含有 A/N-Inv 蛋白, 同时还伴随着淀粉
含量的减少[27]。在水稻中突变一个与拟南芥同源的
A/N-Inv 基因 OsCyt-inv1 会导致水稻突变体根系变
短, 推迟开花和部分不育, 然而通过外源施用葡萄
糖又能修复根系的生长[32]。相似地, 在百脉根中将
一个 A/N-Inv基因 LjINV2突变后发现其 A/N-Inv活
性和表型都不受影响, 然而, 对另一个A/N-Inv基因
LjINV1突变处理发现, 其能够降低A/N-Inv活性, 且
极大降低根系和茎干生长, 同时阻遏花粉形成和损害
开花。有趣的是, 这种突变体能够形成功能性根瘤,
LjINV1 对植物整体生长具有重要作用, 但对茎节的形
成和功能却并不重要[23]。然而, 目前依然未知 A/N-Inv
是如何调控细胞的生长, 同时, 有关 A/N-Inv基因在响
应植物逆境方面的作用研究也报道较少。
茶树作为多年生常绿叶用植物, 其生长和分布
受到温度、光照、土壤、水分等多种环境因子的影
响, 其中温度是限制茶树自然分布和产量的主要因
素。近年来, 茶树低温危害成为茶叶生产最常见的
环境逆境, 严重影响了茶叶的产量与经济效益。为
此, 如何提高茶树抗寒性以抵御低温伤害已是近几
年众多研究者们所关注的热点问题。众多研究表明,
植物抗寒性的提高需要经过一定时间和程度的低温
冷驯化才能表现出来[33]。Wang等[34]对冷驯化条件下
的茶树进行转录组全局分析发现, 茶树在冷驯化条
件下总共有 1770个差异表达基因, 这些差异基因主
要包括低温感应或信号转导基因、低温响应转录因
378 作 物 学 报 第 42卷

子基因、渗透响应相关基因等, 此外, 通过对这些基
因的 KEGG 途径搜索发现, 碳水化合物代谢途径和
钙离子信号途径在茶树响应低温胁迫方面起主要作
用。Yue 等[35]进一步研究发现, 随着茶树的冷驯化,
茶树成熟叶中的可溶性糖含量逐渐增加, 其中蔗糖
(Suc)、葡萄糖(Glc)、果糖(Fru)和半乳糖(Gal)的含量
在抗寒性阶段达到最大 , 随着脱驯化又逐渐降低 ;
且蔗糖等的含量变化与茶树抗寒能力密切相关。
A/N-Inv 作为蔗糖水解的关键酶类, 其在茶树冷驯
化诱导抗寒性方面也可能起重要作用, 但关于该类
基因在茶树中的研究报道较少。本研究在课题组前
期转录组测序的基础上 , 拼接克隆一个 CsINV10,
通过对该基因生物信息学分析和表达模式的研究 ,
旨在为深入研究 A/N-Inv 在响应茶树逆境胁迫方面
的作用和探索冷驯化诱导茶树抗寒的分子机制奠定
理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验材料为 2年生国家级茶树良种龙井 43扦插
苗 , 种植于中国农业科学院茶叶研究所内实验基
地。试验试剂主要有 SYBR Premix Ex Taq (Perfect
Real-time)试剂盒、Prime Script RT Reagent Kit、克
隆载体 pMD18-T、大肠杆菌 DH5α 感受态细胞和
rTaq酶均购自 TaKaRa公司(大连); PCR SuperMix、
逆转录酶 SuperScript III 和 PCR Cleanup Kit 购自
Invitrogen 公司(Carlsbad, USA); DNA Marker 购自
Axygen 公司 (California, USA); RNA 提取试剂
CTAB、EDTA、LiCl、β-巯基乙醇、无水乙醇等均
为国产分析纯。引物合成和基因测序由上海华津生
物有限公司完成。
1.2 总 RNA提取及 cDNA的合成
参照岳川等[36]所述方法提取不同处理样品的总
RNA, 然后分别参照 SuperScript III试剂盒和 Prime
Script RT Reagent 试剂盒说明书反转录合成基因扩
增用 cDNA和表达分析用 cDNA。
1.3 CsINV10基因克隆
基于课题组前期对冷驯化茶树的转录组测序结
果[34], 从中筛选出 6条与其他物种中 A/N-Inv基因同
源的 EST 序列, 在 Seqman 软件中对这些序列进行
拼接, 将拼接好的序列在 NCBI 中进行 BlastX 同源
比对分析, 最后根据拼接好的序列设计相应引物进
行 RT-PCR验证(引物如表 1所示)。PCR反应含 PCR
SuperMix 45 μL、cDNA 1.0 μL、上下游引物各 1.0 μL,
加 ddH2O至终体积 50 μL; 反应程序为 94℃ 5 min;
94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 2.5 min, 35个循环; 72℃
10 min; 4℃保存。PCR反应后, 利用 1%琼脂糖凝胶
电泳, 将获得的条带利用 PCR Cleanup Kit回收纯化,
取 2 μL回收产物与 pMD18-T载体后转化到大肠杆
菌 DH5α 中进行蓝白斑筛选, 菌液 PCR 后挑选阳性
单克隆测序。
1.4 生物信息学分析
利用 DNASTAR 软件包中的 Seqman 软件对
CsINV10全长序列进行拼接, Editseq进行 ORF查询;
在 NCBI数据库中分别用 BlastN和 BlastX对核酸序
列和氨基酸序列进行同源性分析; 在 ClustalX 2.0软
件中对多序列比对后, 利用 DNAMAN和MEGA 5.0
输出同源比对和进化树构建结果[37]。用 ProtParam
预测蛋白分子量、等电点、氨基酸组分等[38]; SignalP
4.1 Server进行信号肽预测[39], TMHMM Server v. 2.0
预测蛋白的跨膜结构, ProtScale Sever在线分析分析
蛋白疏水性, GOR4 在线分析 CsINV10 蛋白的卷曲
螺旋结构, TargetP1.1 预测该蛋白的亚细胞定位[40],
SMART 服务器分析 CsINV10 蛋白的结构功能 ,
NetPhos 2.0 Server[41]和 YinOYang 1.2 Server[42]预测
蛋白磷酸化和糖基化位点, SWISS-MODEL 预测该
蛋白的三级结构, 通过 Phymol软件编辑得到蛋白三
维结构模型[43]。

表 1 RT-PCR和 qRT-PCR引物对
Table 1 RT-PCR and qRT-PCR primers
引物名称 Primer name 核酸序列 Sequence (5–3) 用途 Purpose
CsINV10-F1 CCATCTAAAACCTTAATCT
CsINV10-R1 TGTTCTCAATCAGGTGTCCC
RT-PCR

CsINV10-F2 CTTTTGAGGATGAGGCGTGG
CsINV10-R2 TGTATGAAGGATGAAGTTGCG
qRT-PCR

CsPTB1-F TGACCAAGCACACTCCACACTATCG
CsPTB1-R TGCCCCCTTATCATCATCCACAA
qRT-PCR


第 3期 钱文俊等: 茶树中性/碱性转化酶基因 CsINV10的克隆与表达分析 379


1.5 CsINV10不同组织中的表达分析
以实验室保存的龙井 43茶树不同组织(根、茎、
叶、花)为材料进行 qRT-PCR 分析, 参照岳川等[36]
所述方法取样, 以生长于露天茶园的大小和长势基
本一致的 2年生盆栽龙井 43品种茶树为材料, 在开
花季(10 月)分别取茶树顶端成熟叶、茎干、根系和
花在液氮中速冻后–80℃保存备用。以茶树 PTB 为
内参基因[44], 荧光定量反应体系为 SYBR Premix Ex
Taq 10 μL、上下游引物(10 μmol L–1)(表 1)各 1 μL、
ROX Dye II 0.6 μL、cDNA 2 μL, 加水至终体积 20
μL。充分混匀, 短暂离心后, 于 ABI PRISM 7500实
时定量 PCR 仪上进行 PCR 扩增, 反应程序为 95℃
15 s; 94℃ 5 s, 60℃ 34 s进行 40个循环后增加熔解
曲线。每个处理进行 3 次生物学重复和 3 次技术学
重复 , 最后采用 2–ΔΔCT 法 [45]分析结果 , 并用
SPSS18.0软件分析差异显著性。
1.6 CsINV10不同非生物胁迫下的表达分析
对不同胁迫处理(低温、盐分、干旱、ABA)茶
树成熟叶片进行 CsINV10的 qRT-PCR分析。参照曹
红利等[46]所述, 选取 6 盆大小和长势基本一致的盆
栽茶树于 LED冷光源植物气候箱中(24℃, 16 h光照
/8 h黑暗, 湿度 65%)培养两周后进行 4℃低温处理,
分别在处理后 0 h、1 h、3 h、9 h、1 d、2 d、3 d和
4 d取茶树顶端第 3片成熟叶进行基因表达分析。在
温室中分别随机选取 3 盆大小和长势基本一致的茶
树, 用 250 mmol L–1NaCl溶液以浇灌的方式进行盐
分处理; 同样, 另取 3 盆茶树用 100 mmol L–1 的
ABA溶液均匀喷洒在茶树新稍上, 在处理后 0 h、1
h、3 h、9 h、1 d、3 d和 5 d分别取茶树顶端第 3片
成熟叶进行基因表达分析。参照岳川等[36]所述方法,
将 3 盆大小和长势基本一致的茶树从盆中取出, 用
自来水清洗根系并在纯净水中平衡 15 min 后, 将
茶树放入 10% (w/v) PEG-6000 溶液中进行干旱胁
迫处理, 处理时间和取样方法同 ABA 处理。以茶
树 PTB为内参基因, qRT-PCR程序及结果分析参照
1.5方法。
2 结果与分析
2.1 CsINV10的克隆
基于课题组前期对茶树冷驯化进行的转录组测
序结果, 从中挑选出与 A/N-Inv基因高度同源的 6条
EST序列, 利用 Seqman对这些序列进行拼接获得一
条全长为 2101 bp的核酸序列, 利用 NCBI数据库中
的 ORF Find 查找该序列的 ORF, 然后进行 BlastX
比对发现该序列包含完整的开放阅读框 , 全长为
1923 bp, 编码 640个氨基酸。根据序列拼接和比对
结果设计 1对 RT-PCR引物进行全长验证, 通过 1%
琼脂糖凝胶电泳获得 2.5 kb 左右的单一条带(图 1),
将其回收后和 pMD18-T连接转化到大肠杆菌 DH5α
进行蓝白斑筛选, 挑阳性单克隆摇菌送测序, 测序
结果和之前的拼接结果基本一致 (图 2), 提交
GenBank, 登录号为 KT359348。

图 1 茶树中性/碱性转化酶基因 CsINV10 RT-PCR电泳结果
Fig. 1 Electrophoresis result of neutral/alkaline invertase gene
CsINV10 in tea plant

2.2 序列结构和同源性分析
在NCBI数据库中对CsINV10的氨基酸序列进行
Blastx比对, 显示其与荔枝中已报道的中性/碱性转
化酶LcNI (JQ773414)氨基酸序列相似性最高 , 达
80%, 与橡胶树HbNIN3 (AGU19630)、木薯MeNINV8
(AFH77954)相似性分别为78%和76%。用相邻连接
法构建进化树显示CsINV10与木薯中性/碱性转化酶
家族中的MeNINV8 (AFH77954)亲缘关系最近 , 与
定位于叶绿体上的拟南芥At-A/N-InvE (At5g22510)、
水稻OsNIN3 (AK121301)聚为一类(图3)。因而, 推测
CsINV10蛋白可能也定位于叶绿体, 属于A/N-Inv α
亚家族成员。
结合聚合进化树分析结果, 从中挑选部分At-A/
N-Inv蛋白氨基酸序列进行同源性比对(图4)。所有比
对序列中间大约450 bp左右的氨基酸序列具有较高
的保守性。另外, 在这些保守氨基酸序列中发现有
38个位点的氨基酸残基能用于将At-A/N-Inv分成不
380 作 物 学 报 第 42卷


图 2 CsIINV10的编码序列
Fig. 2 Encoding sequence of CsIINV10
下画线部分代表 CsINV10的开放阅读框, 粗体字分别代表起始子和终止子, 阴影部分代表保守结构域。
The underlined part represents open reading frame of CsINV10, the shadow represents conserved domains and the bolds represent start codon
and terminator respectively.

同的亚家族, 其中 30个氨基酸位点能将 At-A/N-Inv
分成 α和 β亚家族(红色框内所示), 4个位点能将定
位于线粒体的 At-A/N-Inv 与叶绿体、细胞质中的
At-A/N-Inv区分开(橙黄色框内所示), 3个位点能将
定位于叶绿体上的 At-A/N-Inv与定位于线粒体、细
胞质中的 At-A/N-Inv 分开(黄色框内所示), 还有 1
个氨基酸位点能分别将定位于叶绿体、线粒体和细
胞质的 At-A/N-Inv 区分开(绿色框内所示)。利用这
些特异的氨基酸位点可将不同的 At-A/N-Inv定位于
不同的亚细胞中, 这种分类结果和利用系统进化树
的分类结果完全一致。
2.3 蛋白序列基本性质分析
2.3.1 理化性质分析 利用 ProtParam 预测
CsINV10 蛋白分子量为 71.8 kD, 理论等电点 pI 为
5.69, 总共包括 10034 个原子, 分子式为 C3223H4981
N857O944S29。在组成 CsINV10蛋白的 20种氨基酸中,
亮氨酸(Leu)所占比例最高 , 达到 9.7%, 而组氨酸
(His)所占的比例最低, 为 1.7%; CsINV10 蛋白的不
稳定指数为 43.81, 脂肪指数为 87.61, 总平均亲水
性(GRAVY)为–0.166, 根据 Guruprasad 法判断该蛋
白不稳定。
2.3.2 信号肽分析 SignalP 4.1 Server预测该蛋
白信号肽显示 S 平均值(mean S-score)为 0.237<0.5,
因而预测为不包含信号肽, 属于非分泌蛋白和非 N
端糖基化蛋白。
2.3.3 疏水性分析 利用 ProtScale Sever 在线分
析软件中的 Hyhob/Kyte & Doolittle 法对该基因的
亲水性和疏水性预测显示(图 5), 最大正值为 2.467,
最小负值为–3.267, 表明该蛋白属于亲水性蛋白。
2.3.4 跨膜结构预测 利用在线软件 TMHMM
Server v. 2.0对 CsINV10进行跨膜区分析显示, 该蛋
白不存在跨膜螺旋区, 不属于跨膜蛋白(图 6), 这和
该蛋白的疏水性区域分析结果(图 5)基本一致。
2.3.5 亚细胞定位 TargetP1.1 在线软件预测该
蛋白的亚细胞定位显示目的蛋白最可能定位于叶绿
体上, 这与系统进化树预测结果(图 3)一致。
2.3.6 卷曲螺旋(Coil 区)分析 GOR4 在线软件
分析 CsINV10 蛋白的卷曲螺旋结构显示, CsINV10
第 3期 钱文俊等: 茶树中性/碱性转化酶基因 CsINV10的克隆与表达分析 381


蛋白由 26.88% α-螺旋、21.56% β-折叠和 51.56%无
规则卷曲组成。
2.3.7 蛋白磷酸化和糖基化位点预测 利用
NetPhos 2.0 Server对 CsINV10蛋白的磷酸化位点预
测显示 , 该蛋白在翻译后可能存在28个磷酸位点 ,
其中包含14个丝氨酸(Ser)位点、4个苏氨酸(Thr)位点
和9个络氨酸 (Tyr)位点(图7)。利用 YinOYang 1.2
Server 进行蛋白糖基化位点预测, 结果显示该蛋白
氨基酸序列中包含11个潜在的 O-GlcNAc 位点, 包
括 Ser (2、3、4、24、83、183、295、466、519、
634)残基和一个 Thr (182)残基, 其中丝氨酸(519)可
能是 YinYang位点(图8)。
2.4 结构域及 motif搜索
用 SMART对 CsINV10蛋白的结构功能预测显
示, CsINV10 蛋白氨基酸序列 156~599 位之间高度
保守(图 2), 属于糖苷水解酶家族 100 (G100)成员共
有的典型结构域, 可能具有糖肽 α-N-乙酰半乳糖胺
酶活性。
2.5 CsINV10三级结构预测
通过SWISS-MODEL在线软件对CsINV10三级
结构预测后, 利用PhyMol软件编辑获得图9所示结
果, CsINV10 (194-552)三级结构主要由14个α螺旋、
17个无规则卷曲和第2和第3个α螺旋之间的2个小的
β折叠构成。

图 3 CsINV10与其他物种中的 A/N-Inv氨基酸序列聚合进化树分析结果
Fig. 3 Phylogenetic tree of amino acid of CsINV10 and A/N-Inv in other plants
参与构建系统进化树的 A/N-Inv分别为: 拟南芥 A/N-InvA~I (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000,
At1g35580, At3g05820, At4g09510)、水稻OsNIN1~3, 7~8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741)、木薯MeNINV1~10
(JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533729, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533731, KF533732)、小麦 Ta-A/N-INV
AM295169)、甜菜 BvINV (AJ422050)、胡萝卜 DcINV (Y16262)、百脉根 LjInv1 (AJ717412)、毒麦 LtINV (AJ003114)、甘蔗 SoNIN1
(JX109944)、橡胶树 HbNIN1 (GU573728)和 HbNIN2 (GU573727)、茶树 CsINV10 (KT359348)。
The Phylogenetic tree grouped by A/N-InvA–I (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000, At1g35580,
At3g05820, At4g09510), Arabidopsis thaliana; OsNIN1–3, 7–8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741), Oryza sativa;
MeNINV1–10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533729, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533731, KF533732),
Manihotesculentacrantz; Ta-A/N-INV (AM295169), Triticum aestivum; BvINV (AJ422050), Beta vulgaris; DcINV (Y16262), Daucuscarota;
LjInv1 (AJ717412), Lotus japonicus; LtINV (AJ003114), Lolium temulentum; SoNIN1 (JX109944), Saccharum officinarum; HbNIN1 and
HbNIN2 (GU573728, GU573727), Hevea brasiliensis; CsINV10 (KT359348), Camellia sinensis.
382 作 物 学 报 第 42卷


图 4 CsINV10与其他物种中的 A/N-Inv氨基酸序列同源比对结果
Fig. 4 Homologous analysis of amino acid sequences among different plants
参与同源比对的 A/N-Inv分别为茶树 CsINV10 (KT359348)、拟南芥 A/N-InvA~I (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650,
At5g22510, At1g72000, At1g35580, At3g05820, At4g09510)、水稻 OsNIN1~3, 7~8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562,
AK102741)、木薯 MeNINV1~4, 6~8, 10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533732)。红色
框用于区分 α和 β亚族, 黄色框用于区分叶绿体定位的 A/N-Inv, 橙色框用于区分线粒体定位的 A/N-Inv, 绿色框用于区分细胞质、叶
绿体、线粒体定位的 A/N-Inv; 红色箭头代表可能的催化位点。
The homologous sequences include A/N-InvA–I (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000, At1g35580,
At3g05820, At4g09510), Arabidopsis thaliana; OsNIN1–3, 7–8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741), Oryza sativa;
MeNINV1–4, 6–8, 10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533732), Manihot esculenta Crantz;
CsINV10 (KT359348), Camellia sinensis. The red boxes are used to separate α and β subfamily, orange boxes to separate A/N-Invs located in
mitochondria, yellow boxes to separate A/N-Invs located in chloroplast, and green box to identify different A/N-Invs located in cytoplasm,
chloroplast and mitochondria. The red arrow represents candidate catalytic residues.
第 3期 钱文俊等: 茶树中性/碱性转化酶基因 CsINV10的克隆与表达分析 383



图 5 CsINV10亲水性/疏水性分析
Fig. 5 Hydrophobicity/hydrophilicity analysis of CsINV10

图 6 CsINV10蛋白跨膜结构域预测
Fig. 6 Prediction model for transmenbrane domain of
CsARF1 protein

图 7 CsINV10磷酸化位点预测
Fig. 7 Phosphorylation sites prediction of CsINV10 protein

图 8 CsINV10糖基化位点预测
Fig. 8 Glycosylation sites prediction of CsINV10 protein

2.6 CsINV10基因的表达模式分析
2.6.1 组织表达差异性 图 10表明, CsINV10基
因在成熟叶片和花中的表达要明显高于根系中的表
达, 茎干中的表达量较成熟叶片和花都要低, 但也
比根系中高, 说明该基因在茶树中具有组织表达特
异性。
2.6.2 不同非生物胁迫下的表达模式 NaCl 处
理下, 茶树成熟叶片中 CsINV10 基因表达量随着处
理时间的延长呈逐渐升高趋势(图 11), 在处理 5 d后,
其表达量为未处理前的 13倍, 差异达到显著水平。
PEG 条件下, 叶片中该基因的表达量在处理后 3 h
达到最大值, 是处理前的 5.3倍, 随后又逐渐降低并
在处理后 1 d 达到最小值, 而后随着处理时间的延
长, 表达又逐渐升高, 在处理 5 d后其表达量又基本
恢复到处理 3 h 的水平。ABA 处理下, 该基因表达
量在处理后 3 h 达到最大值, 随后随着处理时间的
延长呈现逐步降低的趋势。低温条件下, CsINV10基
因在茶树成熟叶中的表达随着处理时间的延长呈现
384 作 物 学 报 第 42卷


图 9 CsINV10蛋白三维结构预测
Fig. 9 Three-dimension structure of CsINV10 protein

图 10 同一品种不同组织器官中 CsINV10的表达分析
Fig. 10 Expression analysis of CsINV10 in different organs
of a tea plant
柱上小写字母不同表示差异达到显著水平(P < 0.05)。
The columns with different small letters are significantly different
(P < 0.05).

先下调后上调的趋势, 在处理 3 h 后表达量达最小
值, 随后逐渐升高, 在处理 4 d后为处理前的 5.7倍。
表明 CsINV10 基因的表达受多种逆境胁迫诱导, 同
时 ABA能够瞬时诱导该基因的表达, 而低温、PEG
和盐分处理下该基因表达量在处理 1 d 后较对照都
要高, 说明该基因可能作为一个长效表达基因参与
响应茶树的逆境胁迫。
3 讨论
在氨基酸序列中, CWIN 和 VIN 在接近成熟蛋
白 N 端处都有一个 β-呋喃果聚糖苷酶基序(NDPD/
NG)[1], 而在接近 C 端则有一段保守的(WECV/PD),
该序列被认为是酸性转化酶蛋白家族中保守结构域
和催化活性所必须的序列[47], 而 A/N-Inv 缺乏 N 端
信号肽, 既不是糖基化蛋白, 也不是 β-呋喃果糖苷
酶, 具体催化位点依然未知。酸性转化酶能够水解
包含有 β-呋喃果糖苷基的低聚糖糖如蔗糖、棉子糖
和水苏糖等, 而 A/N-Inv只能特异水解蔗糖。本研究
从茶树成熟叶片中克隆的转化酶基因, 通过与其他
物种中已报道的 A/N-Inv 进行氨基酸比对显示, 这
类转化酶氨基酸序列中间的 450 多个氨基酸具有较
高的保守性, 而 N 端和 C 端的同源性非常低, 在这
段保守结构域中存在多个能将不同亚细胞定位的
A/N-Inv 区分开的氨基酸残基位点, 同时还包含 Ji
等[19]报道的 12 个保守结构域和两个潜在的催化残基
Asp88 和 Asp149 (图 4 红色箭头所示 )。此外 ,
CsINV10 的氨基酸序列与茶树中已报道的酸性转化
酶氨基酸序列基本没有同源性, 而与另外几个预测
为 A/N-Inv基因的序列具有较高同源性, CsINV10氨
基酸序列不包含酸性转化酶的特征五肽(NDPNG)和
(WECV/PD), N 端不含跨膜结构域和信号肽, 且具
有较高的亲水性。CsINV10 蛋白氨基酸序列性质和
胡萝卜[4]、小麦[10]、甘蔗[24]等的 A/N-Inv 蛋白性质

图 11 CsINV10在不同非生物胁迫下的表达分析
Fig. 11 Expression analysis of CsINV10 in various abiotic stresses
柱上小写字母不同表示差异达到显著水平(P < 0.05)。
The columns with different small letters are significantly different (P < 0.05).
第 3期 钱文俊等: 茶树中性/碱性转化酶基因 CsINV10的克隆与表达分析 385


相似 ,  说明我们所克隆获得的 CsINV10 也属于
A/N-Inv基因。根据进化树分析显示, CsINV10与水
稻 OsNIN3 和拟南芥 A/N-InvE 聚为一大类 , 而
OsNIN3 和 A/N-InvE 均已报道定位于叶绿体, 因而
推测 CsINV10 也可能定位于叶绿体, 这与 TargetP1.1
预测结果一致。然而, 本研究所报道的 CsINV10 在
酶学水平上, 具体属于中性还是碱性转化酶, 最佳
pH 值为多少; 它的底物特异性如何, 米氏常数(Km)
值为多少, 催化位点在哪等众多问题还需要我们后
期更深入的研究后才能确定。
目前, 很多研究认为 A/N-Inv 在调控植物根系
生长和生殖发育方面具有重要作用。Qi等[28]对拟南
芥 Atcyt-inv1突变体研究发现, Atcyt-inv1能够通过控
制细胞内己糖浓度来抑制侧根发育, 拟南芥中另外
2 个 A/N-Inv 基因 AtCIN7 和 AtCIN9 (cINV1/cINV2)
双突变的突变体中 A/N-Inv 活性较对照降低了 40%,
抑制了根系生长, 同时还伴随着细胞的畸形扩增[48]。
相似地, 百脉根中的 LjCIN1 (LjINV1)突变后降低了
根系和茎干的生长、阻遏花粉形成和损害开花 [23],
水稻中 OsCIN8 (OsCyt-INV1)的突变造成突变体植
株根系变短, 推迟开花和部分不育[32]。植物中组织
器官的生长不仅需要己糖作为能量和碳的来源, 还
需要一个细胞伸长的驱动力, 即相对稳定的细胞渗
透压和一个细胞壁伸展性的增加[1]。在上述突变体
中根系缩短可能是由于转化酶活性的降低导致己糖
含量匮乏使得细胞壁元件合成减少和细胞延长所需
的驱动力降低, 最终降低细胞长度。碳水化合物在花
药和花粉发育中具有重要作用, 对马铃薯[49]和烟草[50]
花药组织中的胞外转化酶研究发现蔗糖的胞外水解
和花药、花粉之间存在紧密的联系, A/N-Inv活性的
变化会影响花粉的育性。本研究通过对茶树不同组
织中 CsINV10的表达进行 qRT-PCR分析发现在茶树
成熟叶和花中其表达量最高, 茎干中的表达量则低
于二者, 这可能与 CsINV10 蛋白亚细胞定位于叶绿
体有关。茶树作为常绿植物, 叶片中较高的 A/N-Inv
活性能够充分水解光合产物——蔗糖产生大量葡萄
糖和果糖参与到茶树生长发育和对逆境胁迫的响应
过程, 而叶片中的叶绿体作为植物参与光合作用的
主要细胞器, 其内部可能存在较高的 A/N-Inv 活性
以参与蔗糖水解过程。茎干作为蔗糖运输通道, 较
低的 A/N-Inv 活性可能更利于蔗糖通过产生浓度梯
度从源器官向库器官中运输。而花作为快速生长分
化组织, 较高的 A/N-Inv 活性能够促进蔗糖的水解
合成己糖 , 为开花过程提供必要的碳水化合物来
源。基于 CsINV10 基因在茶树成熟叶和花中较高的
表达量, 推测该基因可能主要在参与响应茶树体内
蔗糖从“源器官”到“库器官”的分配、生长发育、开
花结果等方面具有重要作用, 但关于 A/N-Inv基因是
如何介导响应植物生长发育过程, 比如是通过糖信
号途径还是通过不同信号途径(如赤霉素、细胞分裂
素和磷脂酰肌醇等)之间互作等众多问题都还有待
更深入的研究。另外, 本研究发现 CsINV10 基因在
茶树根系中的表达量较其他组织都低, 推测该基因
在响应茶树根系生长方面的作用可能并不明显, 原
因可能也和 CsINV10 的亚细胞定位有关, 该蛋白的
亚细胞定位与上述报道的 AtCIN7、AtCIN9、LjCIN1、
OsCIN8 不同, 后四者都被报道定位于细胞质中, 属
于 β亚家族, 同时四者相互之间具有较高的同源性。
因此, 我们推测在茶树中可能还存在能特异调控茶
树根系生长发育的转化酶基因, 但这还需我们后续
深入研究。
最近有研究表明植物体内的A/N-Inv基因被敲除
后, 突变体植株中由于A/N-Inv活性的降低或缺失对
植株造成了叶片、茎干、根系生长不良和花期推迟
等不良影响, 说明A/N-Inv是植物生长和发育不可或
缺的部分[29]。此外, 植物A/N-Inv在胁迫条件下还伴
随着酶活性的升高 [32,48], 其可能通过调控细胞质或
细胞器中蔗糖浓度, 或是通过调控能被线粒体中相
关己糖激酶响应或作为己糖激酶底物的葡萄糖浓度
来调节线粒体活性氧的平衡。Xiang等[29]分别敲除拟
南芥中定位于细胞质的At-A/N-InvG和线粒体中的
At-A/N-InvA基因后发现, 缺失突变体的生长明显受
到抑制, 两种突变体中的A/N-Inv活性都降低了30%
以上; 另外, 他们对野生型拟南芥进行过氧化氢处
理后发现, At-A/N-Inv基因和HXK1在野生型中的表
达量都明显增加 , 因而推测At-A/N-Inv可能作为抗
氧化系统的成员参与调控胞内活性氧的平衡。Vargas
等[10]对小麦一个碱性转化酶在不同环境胁迫中活性
变化情况的研究表明, 在低温和甘露醇处理小麦72
h中, 小麦体内A/N-Inv活性随着处理时间的延长呈
逐渐升高的趋势, 在处理24 h后达到最高, 随后缓
慢降到一定程度后便维持在一个相对稳定水平, 同
时 , 一个碱性转化酶基因Ta-A-Inv在低温和甘露醇
处理72 h后表达量较对照要高, 推测小麦幼苗叶片
中A/N-Inv水解蔗糖可能作为植物常规代谢机制的
开端, 通过提供较高的能量和生物合成化合物来抵
386 作 物 学 报 第 42卷

御逆境胁迫。本研究发现, 在4℃低温条件下, 茶树
成熟叶片中CsINV10基因的表达呈先降后升趋势 ,
ABA和PEG处理下则呈现瞬时增加后急剧降低趋势,
但与ABA不同的是, PEG处理下该基因的表达量在
降到一定程度后又随着处理时间的延长逐渐升高。
而在NaCl处理条件下, 该基因随着处理时间的延长
逐渐上调表达, 在处理5 d后, 表达量较处理前提高
了13倍, 呈极显著水平。总体而言, 无论是低温、盐
分还是PEG胁迫处理茶树1 d后, CsINV10的表达量
都较对照要高, 并随处理时间延长逐渐升高, 说明
该基因能够响应茶树非生物逆境胁迫, 其在参与茶
树抵御环境胁迫方面可能具有重要作用。然而, 王
菲 [51]报道的一个枳叶片中的中性转化酶基因
PtrNINV在低温、干旱、盐胁迫下的表达模式却与
CsINV10基因在相同逆境胁迫下的表达相反 , 这些
A/N-Inv基因在不同物种中表达模式的差异可能受物
种间差异限制, 同时也可能与它们的亚细胞定位或
最佳酶活pH不同有关。PtrNINV被报道定位于细胞
质中的线粒体上, 属于中性转化酶基因 [51], 而我们
所克隆的CsINV10根据亚细胞定位预测显示定位于
叶绿体上。由于时间和空间的差异使得不同亚细胞
定位的A/N-Inv基因对逆境胁迫的响应可能有不同的
时空表达模式。
本研究明确了该类酶编码基因在茶树响应逆境
胁迫中的表达模式, 但关于它们在茶树抗逆中的作
用机制仍有待进一步深入研究。例如: (i)茶树逆境
胁迫下A/N-Inv活性变化与 A/N-Inv基因表达之间的
对应关系如何; (ii)胁迫条件下, A/N-Inv与激素之间
是否具有对应关系, 又是通过什么信号途径参与调
控茶树体内活性氧的平衡 ; (iii)不同细胞器中
A/N-Inv 和 AI 基因之间在茶树逆境下是如何协同表
达; (iv)逆境下, A/N-Inv基因表达的高低是否由相关
转录因子来调控。同时, A/N-Inv活性变化除被相应
A/N-Inv 基因调控外, 其他影响因素又是什么等问题,
有待在以后的研究中逐一揭开。
4 结论
克隆获得一个全长 ORF 为 1923 bp, 编码 640
个氨基酸的A/N-Inv基因CsINV10, 该基因编码的蛋
白氨基酸序列无 N-端信号肽, 无跨膜结构域, 属于
亲水性蛋白并定位于叶绿体。茶树中 CsINV10 的表
达具有组织表达差异性, 该基因的表达受多种逆境
胁迫诱导, 表明它与茶树抗逆响应密切相关。
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