OpIAP
全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(10): 14901499 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家转基因新品种培育科技重大专项(2013ZX08002-001-004)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 马翎健, E-mail: malingjian@nwsuaf.edu.cn; 张增艳, E-mail: zhangzengyan@caas.cn
第一作者联系方式: E-mail: shenfangdi9@163.com
Received(收稿日期): 2015-03-31; Accepted(接受日期): 2015-06-01; Published online(网络出版日期): 2015-06-23.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150623.1359.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01490
转细胞凋亡抑制基因 OpIAP和 p35增强小麦对纹枯病的抗性
申芳嫡 1,2 洪彦涛 2 杜丽璞 2 徐惠君 2 马翎健 1,* 张增艳 2,*
1西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 /
农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室, 北京 100081
摘 要: OpIAP (Orgyia pseudotsugata inhibitor of apoptosis protein)是黄杉毒蛾核型多角体病毒中编码细胞凋亡抑制
蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)的基因, p35基因编码苜蓿斜纹夜蛾核型多角体病毒中具细胞凋亡抑制作用的
35 kDa 蛋白。本研究人工合成了 OpIAP 和 p35 基因, 构建了同时含有 OpIAP 和 p35 表达盒的转双价基因载体
pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP, 两基因分别由玉米泛素基因启动子(Ubiquitin, Ubi)和水稻蔗糖合酶-1 启动子(sucrose
synthase-1 promoter, RSS1P)驱动。通过基因枪介导法将该载体导入小麦品种扬麦16, 获得双价转基因小麦。对 T0~T2
代植株, 利用 PCR、RT-PCR、qRT-PCR及 Western blot分析, 确认导入的外源 OpIAP和 p35基因能够在 4个转双价
基因小麦株系中遗传并表达。用来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌强致病株型 R0301 和 WK207 对转双价基因小
麦的 T1、T2代植株分别进行纹枯病抗性鉴定, 结果表明, 与受体扬麦 16相比, 双价转基因小麦的 T1、T2代植株对纹
枯病的抗性明显提高, 说明 OpIAP 和 p35 基因的表达可以增强转基因小麦对来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌的
抗性。
关键词: 细胞凋亡抑制基因; OpIAP; p35; 转基因小麦; 小麦纹枯病
Expression of Apoptosis Inhibitor Genes OpIAP and p35 Enhances Resistance
to Rhizoctonia cerealis in Transgenic Wheat
SHEN Fang-Di1,2, HONG Yan-Tao2, DU Li-Pu2, XU Hui-Jun2, MA Ling-Jian1,*, and ZHANG Zeng-Yan2,*
1 College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Im-
provement / Key Laboratory of Crop Genetic and Breeding of Agriculture Ministry / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural
Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: OpIAP (Orgyia pseudotsugata inhibitor of apoptosis protein) gene encodes an inhibitor of apoptosis protein (IAP)
which comes from Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus. p35 gene isolated from an Autographa californica nu-
cleo-polyhedron virus encodes a 35 kDa apoptosis protein inhibitor. The expression of both genes displays enhanced resistance in
tobacco, maize and cotton. In this study, the full-length coding sequences of OpIAP and p35 genes were synthesized, respectively.
The transformation vector pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP containing two gene expression cassettes was constructed. In the expres-
sion vector pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP, the OpIAP gene was driven by the rice sucrose synthase-1 promoter and the p35 gene
was driven by the maize ubiquitin promoter. Embryo calli of Yangmai 16 were bombarded by the gold particle containing
pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP vector DNA. Transgenic wheat plants in T0–T2 generations were subjected to PCR, RT-PCR,
qRT-PCR, and Western blot analyses. The results indicated that the introduced OpIAP and p35 genes could be inherited and ex-
pressed in four transgenic wheat lines. Rhizoctonia cerealis isolate R0301 or WK207 was used to inoculate T1 and T2 plants for
sharp eyespot severity assessments. The results showed that the transgenic wheat plants expressing OpIAP and p35 displayed sig-
nificantly enhanced resistance to sharp eyespot compared with non-transgenic wheat Yangmai 16. Thus, the introduced OpIAP and
p35 genes could be used in improving wheat resistance to wheat sharp eyespot caused by different Rhizoctonia cerealis isolates.
Keywords: Apoptosis Inhibitor Gene; OpIAP; p35; Transgenic wheat; Wheat sharp eyespot
第 10期 申芳嫡等: 转细胞凋亡抑制基因 OpIAP和 p35增强小麦对纹枯病的抗性 1491
小麦纹枯病是世界性的小麦土传真菌病害。近
年来, 小麦纹枯病已成为多个国家和地区(中国、波
兰等)影响小麦高产稳产的主要威胁[1-2]。我国小麦纹
枯病主要由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起 ,
侵染小麦的基部叶鞘、茎秆及韧皮部, 阻碍营养物
质的运输,造成倒伏、枯死和枯白穗, 进而导致小麦
产量损失严重, 一般减产10%~30%, 严重年份超过
50%[3]。然而目前生产上推广的小麦品种大多对纹枯
病的抗性较差, 并且缺乏理想的抗小麦纹枯病的种
质资源; 近期研究表明, 小麦纹枯病抗性由几个主
效基因和多个微效基因共同控制, 且存在基因间互
作[4-5], 常规育种方法在培育小麦抗纹枯病品种方面
进展缓慢。因此, 挖掘和利用抗病有效基因、开展
基因工程改良抗病性研究, 为抗纹枯病小麦育种提
供了一条新途径。
细胞凋亡(apoptosis)是机体的正常细胞在受到
生理和病理性刺激后出现的一种自发性死亡过程。
对细胞凋亡抑制机制的认识主要来自动物细胞凋亡
的研究 , 其作用过程一般包括起始阶段 (initiation
phase)、效应阶段 (effector phase)和降解阶段
(degradation phase)。外界的各种凋亡信号刺激细胞,
使细胞在起始阶段发生一系列的生化反应并转变成
多条信号转导通路, 进而激活下游的效应因子, 如
Caspase(半胱氨酰天门冬氨酸特异性蛋白酶), 进入
效应阶段, 在随后的降解阶段, 则会出现DNA的降
解、细胞膜通透性增加等一系列细胞凋亡的典型表
现。因此, Caspase是介导细胞凋亡中信号转导和实
行细胞凋亡的直接效应物, 也是细胞凋亡过程的中
心成分[6-7]。近年来, 一些细胞凋亡抑制因子越来越
多地被人们所认识 , 常见的有Bcl-2 (B-cell leuke-
mia/lymphoma 2)家族、 CrmA (cytokine response
modifier A)、IAPs (inhibitors of apoptosis proteins)和
p35等。其中, Bcl-2家族蛋白成员间的相互作用对线
粒体介导的细胞凋亡信号通路具有调控作用 [8];
CrmA来自牛痘病毒, 是血清蛋白酶抑制剂, 能够直
接抑制多种细胞凋亡中蛋白酶的活性 [9]; IAPs是一
个庞大的蛋白家族, 能通过半胱氨酸和组氨酸的重
复区域(baculoviral inhibitor of apoptosis repeats, BIR)
与细胞凋亡中的效应因子结合, 抑制其活性, 进而
参与细胞凋亡的调控[10]。本研究中OpIAP基因来源
于黄杉毒蛾核型多角体病毒 (Orgyia pseudotsugate
nuclear polyhedrosis virus)基因组 , 编码由269个氨
基酸组成的 IAP蛋白OpIAP, 含有2个BIR。BIR是
OpIAP抑制Caspase活性的核心区, 也是OpIAP抗细
胞凋亡所必需的。OpIAP分子在C末端含有一个锌指
结构, 该结构具有泛素连接酶(Ubiquitin ligase, E3)
的活性, 能够参与蛋白质的泛素化降解, 进而抑制
细胞凋亡发生[11]。p35是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病
毒(Autographa californica nuclear polyhedral virus,
AcNPV)基因组中的1个细胞凋亡抑制因子, 由于该
蛋白的电泳带为35 kD而得名[12-13]。研究表明, p35
蛋白的顶部有一突环结构 , 包含Caspase切割位点 ,
当Caspase接近并切割这个突环时, p35分解为10 kD
和25 kD的2个片段, 它们与Caspase形成紧密而稳定
的复合物, 达到抑制Caspase活性的目的[14-15]。
植物在受到病原菌等外界刺激后, 也会产生细
胞凋亡反应 , 也称为HR (hypersensitive response),
是植物防御活体型病原菌的重要机制。近年发现一
些细胞凋亡抑制因子的表达可以提高转基因烟草、
番茄和棉花等对腐生型病原菌的抗性。Dickman等将
Bcl-2、Bcl-xl (B-cell lymphoma-extra large)、Ced-9
(Caenorhabditis elegans cell death gene 9)以及OpIAP
等细胞凋亡抑制基因转入烟草, 发现转基因烟草能
够抵抗腐生型真菌Sclerotinia sclerotiorum、Botrytis
cinerea、Cercospora nicotianae的侵染和腐生型番茄
点状枯萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)的感
染[16]。IAPs和p35分别属于作用机制不同的2类抗细
胞凋亡因子 [17], 若二者共同作用, 推测可能会更好
地保护植物细胞免受病原菌的侵染。程梦兰[18]利用
农杆菌介导法 , 将p35和SeIAP (Spodoptera exigua
inhibitor of apoptosis protein)基因同时导入玉米中,
得到的6株转双价基因玉米对纹枯病均表现出良好的
抗性; Tian等[19]用农杆菌介导法将OpIAP和p35转入
棉花中 , 获得了对棉花黄萎病抗性明显提高的转
OpIAP和p35基因棉花。但目前尚未见转OpIAP和p35
双价基因在小麦抗病研究方面的相关报道。
本课题组人工合成了细胞凋亡抑制基因OpIAP
和p35, 成功构建了双价转基因载体pUbi:p35-RSS1P:
Myc-OpIAP。采用基因枪介导法将OpIAP和p35基因
转入推广的小麦品种扬麦16中, 对转基因小麦T0~T2
代植株进行了PCR检测、表达分析与纹枯病抗性鉴
定, 以明确细胞凋亡抑制基因OpIAP和p35在转基因
小麦抗纹枯病育种上的应用前景。
1 材料与方法
1.1 试验材料
小麦品种扬麦16作为转OpIAP和p35双价基因
的受体材料, 由江苏省农业科学院里下河地区农科
1492 作 物 学 报 第 41卷
所程顺和研究员和张伯桥研究员提供。小麦纹枯病
致病菌禾谷丝核菌R0301是江苏地区小麦纹枯病的
主要致病菌种, 由江苏省农业科学院陈怀谷研究员
和蔡士宾研究员惠赠; 禾谷丝核菌WK207是采自山
东泰安的强致病性菌株, 由山东农业大学植物保护
学院于金凤教授惠赠。R0301和WK207分别用于鉴
定T1代和T2代转基因植株。单子叶表达载体质粒
pAHC25和 pAHC20均由美国农业部农业研究院
Peter Quail博士惠赠, 中国农业科学院作物科学研
究所张增艳实验室保存, pRSS1P:Myc-TaPIEP1由本
课题组祝秀亮博士构建。
1.2 双价基因转化载体的构建
1.2.1 pRSS1P:Myc-OpIAP、pUbi:p35表达载体的构建
根据已公布的OpIAP (GenBank登录号为L22564.1)
和p35 (GenBank登录号为M16821.1)基因序列, 在其
5′端和3′端分别添加Sma I和Sac I限制性内切酶的酶
切位点, 由北京奥科生物技术公司合成。用限制性
内切酶Sma I和Sac I (TaKaRa)消化含上述酶切位点
的OpIAP和p35基因以及单子叶表达载体pAHC25和
pRSS1P:Myc-TaPIEP1, 分别回收OpIAP (817 bp)和
p35 (910 bp)基因的目的片段 , 切除GUS基因的
pAHC25载体骨架及 TaPIEP1基因的 pRSS1P:Myc-
TaPIEP1载体骨架 , 利用T4连接酶分别将回收的
OpIAP基因的开放阅读框(ORF)和pRSS1P:Myc载体
以及p35基因的ORF与pAHC25骨架载体片段连接
(摩尔浓度比为3︰1), 构成表达载体pRSS1P:Myc-
OpIAP和pUbi:p35 (图1), 分别转化到E. coli Top10感
受态细胞中 , 通过菌落PCR筛选阳性克隆并测序 ,
以确定成功构建转基因表达载体pRSS1P:Myc-OpIAP
和pUbi:p35。
1.2.2 pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP转基因表达载
体的构建 用限制性内切酶Sph I (TaKaRa)分别
酶切质粒pRSS1P:Myc-OpIAP和pUbi:p35, 回收含目
的基因表达盒的片段。用T4连接酶将这2个目的片段
连接, 16℃孵化20 h (图1)。将连接产物转入E. coli
TOP10感受态细胞, 通过菌落PCR筛选具上述2个基
因表达盒的阳性克隆并测序分析, 测序正确后提取
质粒DNA pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP, –20°C保存。
其中p35基因转录受玉米泛素基因(Ubiquitin, Ubi)启
动子驱动 , OpIAP基因转录受水稻蔗糖合酶启动子
(sucrose synthase-1 promoter, RSS1P)控制。c-Myc标
签 3′端序列与OpIAP基因 5′端序列相融合 , 能以
Myc-OpIAP融合蛋白的形式表达。
1.3 转基因小麦植株的获得
利用徐惠君等[20]报道的基因枪介导法, 将转基
因载体 pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP 质粒 DNA 和
pAHC20 (含由 Ubiquitin启动子驱动的 Bar基因选择
标记)按 1︰1体积充分混合, 包裹在直径 1.6 μm的
金粉微粒上。采用 PDS-1000 He–1基因枪(Bia-Rod)
轰击扬麦 16 幼胚愈伤组织共 1978 块。轰击后的愈
伤组织于高渗培养基(SD2 + 0.4 mol L–1 甘露醇 +
0.4 mol L–1山梨醇)上处理 16 h, 然后转入 SD2 (MS +
2,4-D 2 mg L–1)培养基黑暗条件下(26℃)恢复培养 2
周, 转至 1/2 MS + Bialaphos 4 mg L–1培养基上选择
并分化成苗, 小苗长到 1~2 cm 时, 移入 1/2 MS +
IAA 0.5 mg L–1+Bialaphos 3 mg L–1的培养基上壮苗,
再生植株生长到 6~8 cm 高且根系较好时移入花盆,
置中国农业科学院作物科学研究所温室培养, 以获
得转 OpIAP和 p35双价基因小麦的 T0代植株。从外
源 OpIAP 和 p35 基因 PCR 呈阳性的转基因小麦 T0
代植株上收获 T1代种子, 单株种植 T1代转基因植株,
并进行转基因的分子检测和抗病性鉴定, 逐代类推。
1.4 转基因植株中外源双价基因的分子检测
1.4.1 PCR 检测 采用改良 CTAB 法[21], 从转
OpIAP和 p35双价基因小麦及扬麦 16幼苗叶片中提
取基因组 DNA 作为 PCR 检测的模板。根据 OpIAP
和 p35 双价表达转基因载体 pUbi:p35-RSS1P:Myc-
OpIAP 的序列 , 设计 2 对特异引物 (OpIAP-TF/
OpIAP-TR 和 p35-TF/p35-TR)检测转入的 2 个基因
(图 2)。引物 OpIAP-TF (5′-GATGACTGAGGCGTG
TGTG-3′)位于 OpIAP基因读码框, OpIAP-TR (5′-AT
GTATAATTGCGGGACTCTAAT-3′)位于 Tnos终止子;
p35-TF (5′-TGGGGCAAATCCGAAAAGTA-3′)位于
p35基因读码框, p35-TR (5′-AAAAACCCATCTCAT
AAATAACG-3′)位于 Tnos终止子。转 OpIAP和 p35
基因的预期扩增片段大小分别为 424 bp和 307 bp。
以转 OpIAP 和 p35 基因小麦扬麦 16 的 T0~T2植株
DNA 为模板进行 PCR 扩增检测, 用扬麦 16 作为阴
性对照, 质粒 pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP 作为阳
性对照。检测转入的 OpIAP基因的扩增条件为 94℃
5 min; 94℃ 45 s, 58℃ 45 s, 72℃ 45 s, 35个循环;
72℃ 10 min。检测转入的 p35基因的扩增条件为 94℃
5 min; 94℃ 45 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 36个循环;
72℃10 min。扩增产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4.2 RT-PCR和 qRT-PCR分析 用 TRIzol试剂
(Invirogen)提取转基因小麦及扬麦16小麦株系的叶
片总 RNA, 按 FastQuant RT kit (with gDNase) cDNA
第 10期 申芳嫡等: 转细胞凋亡抑制基因 OpIAP和 p35增强小麦对纹枯病的抗性 1493
图 1 pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP表达载体的构建
Fig. 1 Construction of expression vector pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP
图 2 pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP双价基因的植物表达载体框架图
Fig. 2 Scheme of pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP expression vector
箭头指示区为用特异引物 PCR扩增的转基因片段区。
The double-head arrows indicate the regions amplified in the PCR assays.
合成试剂盒(TIANGEN)说明书合成第1链cDNA。以
第1链cDNA为模板, 首先用小麦TaActin基因特异引
物(TaActin-F: 5′-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3′;
TaActin-R: 5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′)使各
样本cDNA模板量均一化。然后用OpIAP基因特异的
引物 (OpIAP-QF: 5′-ATGAGCAGCCGAGCAATT-3′;
OpIAP-QR: 5′-ACGCCTCAGTCATCACCC-3′), p35
基因特异引物(p35-426F: 5′-CGACGAACGCAACGA
1494 作 物 学 报 第 41卷
CTACTA-3′; p35-672R: 5′-TTTGAACGACGACGGC
AATA-3′), 对转基因小麦中目标基因转录情况进行
半定量RT-PCR分析。扩增OpIAP基因的条件为94℃
5 min; 94℃ 45 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 36个循环;
72℃ 10 min。扩增p35基因的条件为94℃ 5 min; 94℃
45 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环; 72℃ 10 min。
在 ABI PRISMR7300实时荧光定量 PCR仪(ABI,
USA)上进行实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)分析。反
应体系 25 µL, 按 SuperReal PreMix Plus (SYBR
Green) (TIANGEN)反应体系, 95℃预变性 5 min; 95
℃变性 15 s, 60℃退火 31 s, 41个循环, 以 TaActin为
内参照(引物为 TaActin-F和 TaActin-R), 用 OpIAP和
p35 特异的引物 OpIAP-QF/OpIAP-QR 和 p35-426F/
p35-672R进行扩增。每个反应均有 3次独立的重复
试验。以转基因阴性植株 Z3-27 为对照, 用 2−ΔΔCT
方法[22]计算转基因小麦中 OpIAP、p35 基因的相对
表达量。
1.5 转基因植株蛋白质的提取及Western blot分
析
选取 T2代转基因株系中分子检测为阳性的植株,
提取叶片总蛋白。将–70℃冻存的小麦叶片在液氮中
充分研磨, 加入蛋白质提取液混匀。该蛋白提取液
含 62.5 mmol L–1 Tris-HCl (pH 7.4)、10%甘油、0.1%
SDS、2 mmol L–1 EDTA-Na2、1 mmol L–1 PMSF
(phenyl methane sulfonyl fluoride)和 5% β-巯基乙醇。
将混合液放置冰上 10 min, 然后于 4℃下 13 400 × g
离心 20 min, 上清液即为总蛋白质。将总蛋白进行
SDS-PAGE 电泳并经湿转法转膜后, 与稀释 900 倍
的 anti-c-Myc 抗体(一抗)杂交, 用一步法快速 WB
(HRP)试剂盒(康为世纪)进行第二次杂交, 化学发光
后进行曝光显影, 检测 c-Myc-OpIAP 融合蛋白在过
表达株系中的表达。
1.6 转基因小麦对纹枯病的抗性及生长发育状况
将纹枯菌在煮熟的麦粒上培养, 待麦粒表面长
满菌丝后待用。在小麦分蘖盛期, 用消毒镊子夹取
长满菌丝的麦粒, 放入麦苗根基部, 每株放 4~5 粒
有菌麦粒, 保湿 3~5 d。于乳熟期进行纹枯病抗性调
查, 每株系鉴定约 30株, 按 0~5级调查纹枯病病级,
0级为无症状; 1级为叶鞘变褐, 有病斑, 但病菌未侵
入茎秆; 2 级为病菌侵入茎秆, 病斑环绕茎秆不超过
1/2; 3级为病斑环绕茎秆的 1/2~3/4; 4级为病斑环绕
茎秆的 3/4以上; 5级为出现枯、白穗或整株死亡[23]。
按魏学宁等[24]报道的方法计算病情指数(DI)。
5
0DI 100
5
i iix
N
式中, i为某个病级, xi为该病级的植株数, N为调
查总植株数。
抽穗期调查转基因小麦T1、T2代植株(已检验确
定的阳性植株)的株高及1~3蘖的百分率, 与未转基
因扬麦16比较。每个株系调查30株。
1.7 统计分析
用Microsoft Excel软件作统计分析, 采用t-检验
分析转基因株系与阴性对照间差异的显著性 ,
P<0.05表明差异显著, P<0.01则表明差异极显著。
2 结果与分析
2.1 转OpIAP和 p35双价基因小麦的获得及分子
检测
2.1.1 转OpIAP和p35双价基因小麦的获得 由
测序分析结果可知, OpIAP和p35双价表达转基因载
体pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP构建成功, 2个基因表
达盒的序列和方向均正确。p35基因转录受玉米泛素
基因(Ubiquitin, Ubi)启动子驱动。OpIAP基因转录受
水稻蔗糖合酶启动子 (sucrose synthase-1 promoter,
RSS1P)驱动, 且c-Myc标签与OpIAP基因融合, 能以
c-Myc-OpIAP融合蛋白的形式表达。
利用基因枪介导法将上述载体 pUbi:p35-RSS1P:
Myc-OpIAP 的质粒 DNA 轰击转化小麦推广品种扬
麦 16 的幼胚愈伤组织 1978 块, 经过分化、筛选和
再生, 获得 77株再生植株。利用 OpIAP和 p35转基
因特异引物 PCR分析这些再生植株中转入的基因。
结果表明, 转 OpIAP 和 p35 双价基因均为阳性的植
株有 4株(Z3-2、Z3-17、Z3-42和 Z3-75), 转化率为
0.2% (4/1978)。
2.1.2 转OpIAP和 p35基因小麦的 PCR检测 提
取转基因小麦 T0~T2代植株叶片基因组 DNA作为目
标基因 PCR 检测的模板, 利用 2 个转基因表达盒所
特异的引物对转 OpIAP 和 p35 基因小麦 T0~T2代植
株进行 PCR 检测。结果表明, 4 个转基因小麦株系
(Z3-2、Z3-17、Z3-42和 Z3-75)的 T0~T2代植株中均
能检测到外源 OpIAP 和 p35 (图 3), 说明导入的
OpIAP和 p35在这 4个转基因小麦株系中均能遗传。
2.1.3 转基因植株中 OpIAP和 p35基因的转录表达
采用半定量 RT-PCR 分析上述4个转 OpIAP 和
p35双价基因小麦株系T2代植株中OpIAP和 p35的转
录水平 , 结果表明 , 这4个转基因抗病株系植株中
第 10期 申芳嫡等: 转细胞凋亡抑制基因 OpIAP和 p35增强小麦对纹枯病的抗性 1495
OpIAP 和 p35 的转录水平均高于未转基因小麦(受体)
扬麦 16。进一步以转基因小麦中的阴性植株 Z3-27
为对照, 利用 qRT-PCR 分析上述 4 个转基因小麦株
系中 OpIAP 和 p35 基因的相对表达量, 结果表明,
这4个转基因株系的抗病植株中OpIAP和 p35基因的
表达水平明显高于转基因小麦中的阴性植株 Z3-27
和受体扬麦16, 且在不同植株中的表达量存在差异,
RT-PCR与 qRT-PCR结果基本吻合(图4)。
图 3 转 OpIAP和 p35基因小麦的 T2代 PCR检测图谱
Fig. 3 PCR analyses of OpIAP and p35 transgenic wheat plants in T2 generations
A0~A2: PCR检测 T0~T2代 OpIAP基因; B0~B2: PCR检测 T0~T2代 p35基因; P: 转基因载体质粒 pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP; Y16: 未
转基因扬麦 16; Z3-2~Z3-75: 4个转基因株系。
A0–A2: PCR analyses of OpIAP in T0–T2; B0–B2: PCR analyses of p35 in T0–T2; P: transformation vector pUbi:p35-RSS1P:Myc-OpIAP; Y16:
untransformed Yangmai 16; from Z3-2 to Z3-75: four transgenic wheat lines.
图 4 转基因小麦中 OpIAP和 p35基因 RT-PCR (A1、B1)与 qRT-PCR (A2、B2)分析
Fig. 4 RT-PCR (A1, A2) and qRT-PCR (B1, B2) assays on OpIAP and p35 transcript in transgenic wheat plants
A1, A2: OpIAP基因; B1, B2: p35基因; Y16: 未转基因扬麦 16; Z3-27: 转基因阴性小麦植株; Z3-2~Z3-75: 4个转基因株系。 *和**分别
表示在 P<0.05, P<0.01水平与对照转基因阴性小麦 Z3-27有显著差异。
A1, A2: OpIAP; B1, B2: p35; Y16: untransformed Yangmai 16; Z3-27: negative transgenic wheat; from Z3-2 to Z3-75: four transgenic wheat
lines. * and ** indicate significant differences compared with negative transgenic wheat Z3-27 at P<0.05 and P<0.01, respectively.
2.2 转基因植株的Western blot分析
野生型受体小麦扬麦16的蛋白不能与 anti-c-
Myc 抗体产生杂交条带, 而4个转基因株系(Z3-2、
Z3-17、Z3-42、Z3-75)的蛋白均能与 anti-c-Myc抗体
产生杂交带 , 说明在这4个转双价基因小麦株系中
c-Myc-OpIAP 融合蛋白均被表达(图5), 且这4个转
基因小麦株系中 c-Myc-OpIAP融合蛋白表达量与这
些外源基因的转录表达水平相吻合。
2.3 转基因小麦的纹枯病抗性鉴定
对转 OpIAP和 p35双价基因小麦 T1、T2代4个株
系的植株、受体扬麦16以及抗、感病对照 (抗病
品种 CI12633 和感病品种扬麦 158)分别接种禾谷丝
核菌 R0301、WK207进行纹枯病抗性鉴定。其中, T1
图 5 转 OpIAP-p35双价基因小麦中 c-Myc-OpIAP蛋白的
western blot分析
Fig. 5 Western blot analysis on c-Myc-OpIAP protein in
transgenic and wild-type wheat plants.
Y16: 未转基因扬麦 16; Z3-2~Z3-75: 4个转基因小麦株系。
Y16: untransformed Yangmai 16; from Z3-2 to Z3-75: four
transgenic wheat lines.
1496 作 物 学 报 第 41卷
代中阳性植株共 39 株(Z3-2 株系 9 株、Z3-17 株系
10株、Z3-42株系 11株、Z3-75株系 9株), T2代阳
性植株共 43株(Z3-2株系 12株、Z3-17株系 9株、
Z3-42株系 10株、Z3-75株系 12株)。鉴定结果表明,
转 OpIAP 和 p35 双价基因小麦株系 Z3-2、Z3-17、
Z3-42 和 Z3-75 的 T1、T2代各株系阳性植株的病级
与病情指数均低于同株系中阴性植株及未转基因小
麦扬麦 16 (受体)。其中接种禾谷丝核菌 R0301的 T1
代转基因小麦的平均病级为 1.45 (1.27~1.62), 平均病
情指数为 29.00 (25.42~32.34), 而 4 个株系中阴性植
株的平均病级为 2.01 (1.85~2.17), 平均病情指数为
40.61 (36.94~43.34), 未转基因小麦扬麦 16的平均病
级为 2.31, 平均病情指数为 45.17; 接种禾谷丝核菌
WK207的 T2代转基因小麦的平均病级为 1.57 (1.35~
1.79), 平均病情指数为 31.28 (27.04~35.78), 而 4个
株系的阴性植株的平均病级为 2.25 (2.00~2.50), 平
均病情指数为 45.05 (40.00~48.00), 未转基因小麦扬
麦 16 的平均病级为 2.46, 平均病情指数为 49.31。
T1、T2 代转基因阳性植株比阴性植株的病情指数分
别降低了 28.6%和 30.6%, 比受体小麦扬麦 16 的病
情指数分别降低了 35.8%和 36.6% (表 1)。转基因小
表 1 转 OpIAP和 p35基因小麦及受体的纹枯病抗性鉴定
Table 1 Responses of OpIAP and p35 transgenic and host
wheat lines to R. cerealis
T1 T2 株系
Line IF DI IF DI
扬麦 16
Yangmai 16
2.31 45.17 2.46 49.31
Z3-2 (+) 1.27** 25.42** 1.47** 29.33**
Z3-17 (+) 1.62** 32.34** 1.35** 27.04**
Z3-42 (+) 1.58** 31.57** 1.65** 32.95**
Z3-75 (+) 1.33** 26.67** 1.79** 35.78**
Z3-2 (–) 1.85* 36.94* 2.11 42.20
Z3-17 (–) 2.13 42.56 2.00* 40.00*
Z3-42 (–) 2.17 43.34 2.40 48.00
Z3-75 (–) 1.88* 39.60* 2.50 50.00
CI12633 1.03 20.67 1.13 22.56
扬麦 158
Yangmai 158
2.41 46.22 2.61 52.11
扬麦 16: 未转基因扬麦 16; (+): 该系中阳性植株; (–): 该
系中阴性植株。IT: 平均病级 ; DI: 平均病情指数。*,**表示在
P<0.05, P<0.01水平上各转基因株系与对照扬麦 16有显著差异。
Yangmai 16: untransformed Yangmai 16; (+): positive plants
of that line; (–): negative plants of that line. IT: average infection
type; DI: average disease index. * and ** indicates significant dif-
ferences between each transgenic wheat line and Yangmai 16 at
P<0.05 and P<0.01.
麦阳性植株茎基部的纹枯病病斑均明显小于受体小
麦扬麦 16 (图 6-A)。以上结果表明, 转入细胞凋亡抑
制基因 OpIAP 和 p35 的表达能够显著增强转基因小
麦对来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌的抗性。
2.4 转基因小麦生长发育状况对比分析
于抽穗期对转 OpIAP和 p35双价基因小麦 T1、
T2代植株分别进行生长发育状况统计。结果表明, 与
未转基因小麦扬麦16相比, 转 OpIAP 和 p35双价基
因小麦株系 Z3-2、Z3-17、Z3-42和 Z3-75的 T1、T2
代植株的株高与分蘖均未见明显差异。其中 T1代转
基因小麦的平均株高为45.08 cm (38.83~47.00 cm),
而未转基因小麦扬麦16的平均株高为46.5 cm; T2代
转基因小麦的平均株高为43.90 cm (39.00~45.00 cm),
未转基因小麦扬麦16的平均株高为47.2 cm (图6-B)。
从分蘖数统计结果上看, T1、T2代转基因小麦与未转
基因受体小麦扬麦16的分蘖数分布状况基本相近
(图6-C)。以上结果表明, 细胞凋亡抑制基因 OpIAP
和 p35的表达对转基因小麦的生长发育未产生明显
影响。
3 讨论
目前, 对植物中细胞凋亡抑制基因的作用机制
还了解甚少, 一些研究表明, 转入的细胞凋亡抑制
基因的表达可以不同程度地提高一些转基因植物对
腐生型病原菌的抗性[16-19,25-26]。如Pual等[25]通过农杆
菌介导法将细胞凋亡抑制基因(Bcl-xl、Bcl-2和Ced-9)
转入香蕉 , 得到2株转Bcl-xl、2株转Bcl-2和3株转
Ced-9基因的香蕉植株 , 与对枯萎病 (Fusarium ox-
ysporum f. sp. cubense)敏感的对照Lady Finger相比,
这7株转基因香蕉的抗病性均明显增强。Lincoln等[26]
和Wang等 [27]研究表明, 细胞凋亡抑制基因p35的表
达能够有效阻碍由一些腐生型病原菌所引起的细胞
凋亡。小麦对纹枯病的抗性受多基因控制, 尚未发
现主效QTL。本实验室克隆并研究了几个小麦抗纹
枯病相关基因的功能[28-29], 但OpIAP和p35基因是否
可以提高小麦纹枯病抗性未见报道。本研究构建了
细胞凋亡抑制基因OpIAP和p35的双价表达转基因
载体, 通过基因枪介导法获得4个转OpIAP和p35双
价基因小麦株系, 经T0~T2代分子检测, 证明了转基
因植株的真实性。T1、T2代转基因小麦的纹枯病接
种鉴定结果表明, 转入OpIAP和p35基因的表达显著
提高了转基因小麦对纹枯病的抗性。这些说明细胞
凋亡抑制基因在单子叶和双子叶作物防御一些腐生
型病原菌反应中具有一定作用。
第 10期 申芳嫡等: 转细胞凋亡抑制基因 OpIAP和 p35增强小麦对纹枯病的抗性 1497
图 6 转 OpIAP和 p35双价基因小麦纹枯病表型鉴定及生长发育状况对比分析
Fig. 6 Symptoms of sharp eyespot and analyses of growth in OpIAP and p35 transgenic wheat plants
A: 转基因小麦 T2代纹枯病表型鉴定; B: T1、T2代株高统计; C: T1、T2代分蘖数统计。Y16: 未转基因扬麦 16; Z3-2~Z3-75: 4个转基因
小麦株系。
A: symptoms of sharp eyespot in T2 generation; B: plant height in T1, T2 generations. C: tiller number in T1, T2 generations; Y16: untrans-
formed Yangmai 16; from Z3-2 to Z3-75: four transgenic wheat lines.
通过对T0~T2代转基因植株中转入基因的PCR
检测和转录分析, 我们发现OpIAP和p35两基因在4
个转基因小麦株系中遗传并表达; 利用Western blot
进一步分析 , 发现上述4个转基因株系中蛋白均能
与anti-c-Myc抗体产生一条杂交带, 说明这4个转基
因小麦株系中c-Myc-OpIAP融合蛋白能够表达。由
于OpIAP基因与p35基因位于同一个转基因表达载
体上, p35蛋白也应该在这些转基因小麦株系中表达,
是否如此仍需后续实验来验证。此外, 本研究采用
南方和北方致病力不同的 2个禾谷丝核菌菌株
(R0301和WK207)进行抗病性鉴定 , 转OpIAP和p35
双价基因小麦T1、T2代植株的平均病情指数分别比
受体扬麦16分别降低35.8%和36.6%, 说明转入细胞
凋亡抑制基因OpIAP和p35的表达能够在一定程度
上提高转基因小麦对来源不同、致病力不同的禾谷
丝核菌的抗性, 具有一定的应用价值。
研究表明, 细胞凋亡抑制基因OpIAP和p35的导
入能够提高植物抑制由病原菌所引起的细胞凋亡。
1498 作 物 学 报 第 41卷
如Hansen等[30]用去氧核醣核酸断裂法(DNA ladder-
ing)观察农杆菌处理后转基因愈伤组织DNA的形态
及农杆菌处理后的玉米胚胎横截面, 发现将凋亡抑
制基因OpIAP和p35导入玉米胚性愈伤组织可以抑
制农杆菌诱导的PCD (programmed cell death)。Tian
等[18]通过DNA laddering和流式细胞仪分析OpIAP和
p35基因对棉花枯萎菌毒素引起细胞凋亡的抑制作
用, 发现与受体棉花植株相比, OpIAP和p35基因的
表达在一定程度上抑制了转基因棉花对枯萎菌毒素
所引起的细胞凋亡。因此 ,我们推断转OpIAP和p35
表达也应该提高转基因小麦的细胞凋亡抑制能力,
是否如此仍需后续实验的进一步验证。
为了解OpIAP和p35基因表达对转基因小麦生
长发育的影响 , 我们还对转OpIAP和p35基因小麦
T1、T2代植株的株高和分蘖数进行了调查。结果表
明, 与转基因受体小麦扬麦16相比, 转基因小麦T1、
T2代在株高、分蘖数以及成熟时间方面均未受到显
著影响, 可能与使用的启动子具有韧皮部组织与诱
导表达特点有关。驱动OpIAP转录的RSS1P启动子具
有在韧皮部组织特异表达的特性 [31], 能驱动OpIAP
在小麦的韧皮部组织特异表达 ; 驱动p35基因的
Ubiquitin启动子可被如热击、干旱、冷害等逆境和
病原菌诱导表达[29,32-33], p35基因可在接种禾谷丝核
菌的转基因植株根部及茎基部受诱导而表达更强。
4 结论
通过人工合成基因、双价表达转基因载体构建
与遗传转化 , 成功将细胞凋亡抑制基因 OpIAP 和
p35 转入小麦品种扬麦 16 中; 经过分子检测与接种
抗病鉴定, 创制、选育出纹枯病抗性提高的转 OpIAP
和 p35双价基因小麦新种质 4份。
References
[1] Lemańczyk G, Kwaśna H. Effects of sharp eyespot (Rhizoctonia
cerealis) on yield and grain quality of winter wheat. Eur J Plant
Pathol, 2013, 135: 187–200
[2] Hamada M S, Yin Y, Chen H, Ma Z H. The escalating threat of
Rhizoctonia cerealis, the causal agent of sharp eyespot in wheat.
Pest Manag Sci, 2011, 67: 1411–1419
[3] 张会云, 陈荣振, 冯国华, 刘东涛, 王静. 中国小麦纹枯病的
研究现状与展望. 麦类作物学报, 2007, 27: 1150–1153
Zhang H Y, Chen R Z, Feng G H, Liu D T, Wang J. The research
status and prospect of wheat sharp eyespot. J Triticeae Crops,
2007, 27: 1150–1153 (in Chinese with English abstract)
[4] 吴纪中, 颜伟, 蔡士宾, 任丽娟, 頲汤 . 小麦纹枯病抗性的主
基因+多基因遗传分析. 江苏农业学报, 2005, 21(1): 6–11
Wu J Z, Yan W, Cai S B, Ren L J, Tang T. Genetic analysis of
sharp eyespot resistance by using major gene plus polygene
mixed inheritance analysis in wheat (Triticum aestivum). Jiangsu
J Agric Sci, 2005, 21(1): 6–11 (in Chinese with English abstract)
[5] 张小村, 李斯深, 赵新华, 李瑞军. 15 个小麦重组自交系群体
抗纹枯病性的遗传分析. 麦类作物学报, 2004, 24(3): 13–16
Zhang X C, Li S S, Zhao X H, Li R J. Genetic analysis on
resistance to sharp eyespot by using fifteen populations of
recombinant inbred lines in wheat. J Triticeae Crops, 2004, 24(3):
13–16 (in Chinese with English abstract)
[6] Shi Y. Mechanisms of caspase activation and inhibition during
apoptosis. Mol Cell, 2002, 9: 459–470
[7] Daniel P T. Dissecting the pathways to death. Leukemia, 2000, 14:
2035–2044
[8] Behrens T W, Mueller D L. Bcl-x and the regulation of survival
in the immune system. Immunol Res, 1997, 16: 149–160
[9] Zhou Q, Snipas S, Orth K, Muzio M, Dixit V M, Salvesen G S.
Target protease specificity of the viral serpin CrmA. Analysis of
five caspases. J Biol Chem, 1997, 272: 7797–7800
[10] Yang Y, Fang S, Jensen J P, Weissman A M, Ashwell J D. Ubiq-
uitin protein ligase activity of IAPs and their degradation in pro-
teasomes in response to apoptotic stimuli. Science, 2000, 288:
874–877
[11] Wright C W, Clem R J. Sequence Requirements for Hid binding
and apoptosis regulation in the baculovirus inhibitor of apoptosis
Op-IAP Hid binds Op-IAP in a manner similar to Smac binding
of XIAP. J Biol Chem, 2002, 277: 2454–2462
[12] Hershberger P A, Dickson J A, Friesen P D. Site-specific
mutagenesis of the 35-kilodalton protein gene encoded by
Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: cell line-
specific effects on virus replication. J Virol, 1992, 66: 5525–5533
[13] Friesen P D, Miller L K. Divergent transcription of early 35- and
94-kilodalton protein genes encoded by the Hind III K genome
fragment of the baculovirus Autographa californica nuclear
polyhedrosis virus. J Virol, 1987, 61: 2264–2272
[14] Fisher A J, Zoog S J, Schneider C L, Friesen P D. Crystal
structure of baculovirus p35: role of a novel reactive site loop in
apoptotic caspase inhibition. EMBO J, 1999, 18: 2031–2039
[15] Manji G A, Hozak R R, LaCount D J, Friesen P D. Baculovirus
inhibitor of apoptosis functions at or upstream of the apoptotic
suppressor p35 to prevent programmed cell death. J Virol, 1997,
71: 4509–4516
[16] Dickman M, Park Y, Oltersdorf T, Li W, Clemente T, French R.
Abrogation of disease development in plants expressing animal
antiapoptotic genes. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:
6957–6962
[17] LaCount D J, Hanson S F, Schneider C L, Friesen P D. Caspase
inhibitor p35 and inhibitor of apoptosis OpIAP block in vivo pro-
teolytic activation of an effector caspase at different steps. J Biol
Chem, 2000, 275: 15657–15664
[18] 程梦兰. 转细胞凋亡抑制基因 p35和 iap玉米抗纹枯病的研究.
华中农业大学硕士学位论文, 湖北武汉, 2013. pp 76–79
Cheng M L. Transformation of Maize with Anti-Apoptotic Genes
p35 and iap Confers Resistance to Sheath Blight. MSThesis of
Huazhong Agricultural University, Wuhan, China, 2013. pp
76–79 (in Chinese with English abstract)
[19] Tian J, Zhang X, Liang B, Li S, Wu Z, Wang Q, Leng C, Dong J,
第 10期 申芳嫡等: 转细胞凋亡抑制基因 OpIAP和 p35增强小麦对纹枯病的抗性 1499
Wang T. Expression of baculovirus anti-apoptotic genes p35 and
OpIAP in cotton (Gossypium hirsutum L.) enhances tolerance to
Verticillium wilt. PloS One, 2010, 5: e14218
[20] 徐惠君, 庞俊兰, 叶兴国, 杜丽璞, 李连城, 辛志勇, 马有志,
陈剑平, 陈炯, 程顺和, 吴宏亚. 基因枪介导法向小麦导入黄
花叶病毒复制酶基因的研究. 作物学报, 2001, 27: 688–693
Xu H J, Pang J L, Ye X G, Du L P, Li L C, Xin Z Y, Ma Y Z, Chen
J P, Chen J, Cheng S H, Wu H Y. Study on the gene transferring
of Nib8 into wheat for its resistance to the Yellow mosaic virus by
bombardment. Acta Agron Sin, 2001, 27: 688–694 (in Chinese
with English abstract)
[21] Saghai-Maroof M A, Soliman K M, Jorgensen R A, Allard R W.
Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mende-
lian inheritance, chromosomal location, and population dynamics.
Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81: 8014–8019
[22] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression
data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCT method.
Methods, 2001, 25: 402–408
[23] 王裕中, 吴志凤, 史建荣, 陈怀谷, 邵伯坤. 小麦纹枯病流行
规律研究. 江苏农业科学, 1993, (麦类纹枯病专辑): 48–53
Wang Y Z, Wu Z F, Shi J R, Chen H G, Shao B K. epidemic law
research of wheat sharp eyespot. Jiangsu Agric Sci, 1993, (special
issue of wheat sharp eyesport): 48–53 (in Chinese)
[24] 魏学宁, 任丽娟, 张淼, 张巧凤, 刘欣, 周淼平, 马鸿翔, 吴继
中, 马翎健, 张增艳. 人工合成抗纹枯病小麦新种植的鉴定.
植物遗传资源学报, 2015, 16: 373–378
Wei X N, Ren L J, Zhang M, Zhang Q F, Liu X, Zhou M P, Ma H
X, Wu J Z, Ma L J, Zhang Z Y. Identification of synthetic wheat
accession with resistance to wheat sharp eyespot. J Plant Genet
Resour, 2015, 16: 373–378 (in Chinese with English abstract)
[25] Paul J Y, Becker D K, Dickman M B, Harding R M, Khanna H K,
Dale J L. Apoptosis-related genes confer resistance to Fusarium
wilt in transgenic ‘Lady Finger’ bananas. Plant Biotechnol J,
2011, 9: 1141–1148
[26] Lincoln J E, Richael C, Overduin B, Smith K, Bostock R, Gil-
christ D G. Expression of the antiapoptotic baculovirus p35 gene
in tomato blocks programmed cell death and provides broad
spectrum resistance to disease. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99:
15217–15221
[27] Wang Z, Song J, Zhang Y, Yang B, Wang Y, Chen S. Mechanism
analysis of broad-spectrum disease resistance induced by expres-
sion of anti-apoptotic p35 gene in tobacco. Chin J Biotech. 2008,
24: 1707–1713
[28] Chen L, Zhang Z, Liang H, Liu H, Du L, Xu H, Xin Z. Overex-
pression of TiERF1 enhances resistance to sharp eyespot in
transgenic wheat. J Exp Bot, 2008, 59: 4195–4204
[29] Zhu X, Qi L, Liu X, Cai S, Xu H, Huang R, Li J, Wei X, Zhang Z.
The wheat ethylene response factor transcription factor patho-
gen-induced ERF1 mediates host responses to both the necrotro-
phic pathogen Rhizoctonia cerealis and freezing stresses. Plant
Physiol, 2014, 164: 1499–1514
[30] Hansen G. Evidence for Agrobacterium-induced apoptosis in
maize cells. Mol Plant-Microbe Interactions, 2000, 13: 649–657
[31] Shi Y, Wang M B, Powell K S, Van Damme E, Hilder V A,
Gatehouse A M R, Boulter D, Gatehouse J A. Use of the rice
sucrose synthase-1 promoter to direct phloem specific expression
of β-glucuronidase and snowdrop lectin genes in transgenic
tobacco plants. J Exp Bot, 1994, 45: 623−631
[32] Zhang Z, Liu X, Wang X, Zhou M, Zhou X, Ye X, Wei X. An
R2R3 MYB transcription factor in wheat, TaPIMP1, mediates
host resistance to Bipolaris sorokiniana and drought stresses
through regulation of defense and stress-related genes. New
Phytol, 2012, 196: 1155–1170
[33] Streatfield S J, Magallanes-Lundback M E, Beifuss K K, Brooks
C A, Harkey R L, Love R T, Bray J, Howard J A, Jilka J M, Hood
E E. Analysis of the maize polyubiquitin-1 promoter heat shock
elements and generation of promoter variants with modified
expression characteristics. Transgenic, 2004, 13: 299–312