全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(5): 690695 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31170253)和河南省基础与前沿技术研究计划项目(142300413206)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31170253) and the Basic and Advanced Technology Re-
search Project in Henan Province (142300413206).
通讯作者(Corresponding author): 王棚涛, E-mail: wangpt126@126.com
第一作者联系方式: E-mail: lingyunl@henu.edu.cn
Received(收稿日期): 2015-06-09; Accepted(接受日期): 2016-01-11; Published online(网络出版日期): 2016-01-25.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160125.1622.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00690
拟南芥低叶绿素荧光 LCF3基因的克隆与功能分析
刘凌云 刘 浩 赵 晶 王艳霞 王棚涛
河南大学生命科学学院 / 棉花生物学国家重点实验室 / 植物逆境生物学重点实验室, 河南开封 475004
摘 要: 叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的
作用。本研究借助叶绿素荧光成像仪, 从拟南芥 EMS 诱变突变体库中筛选到一株低叶绿素荧光突变体 lcf3-1 (lower
chlorophyll fluorescence 3-1)。遗传分析表明 lcf3-1突变体为单基因隐性突变。突变基因图位克隆结果显示 LCF3是
PsbW的等位基因。另外, LCF3基因的 T-DNA插入突变体及功能回补转基因植物的叶绿素荧光分析结果均证明 LCF3
基因突变导致拟南芥叶绿素荧光 Fv/Fm值降低。进一步实验结果显示, LCF3蛋白定位于叶绿体, 且 LCF3基因在植株
中普遍表达。PsbW蛋白可能细微调整 PSII-LHCII超复合体的组装及稳定。
关键词: 拟南芥; 叶绿素荧光; 光合作用; 图位克隆
Map-based Cloning and Functional Analysis of Low Chlorophyll Fluorescence
Gene LCF3 in Arabidopsis thaliana
LIU Ling-Yun, LIU Hao, ZHAO Jing, WANG Yan-Xia, and WANG Peng-Tao*
Henan Key Laboratory of Plant Stress Biology / State Key Laboratory of Cotton Biology / College of Life Sciences, Henan University, Kaifeng
475004, China
Abstract: Chlorophyll fluorescence has exclusive role for determining the kinetics of light energy absorption, transmission, dis-
sipation and distribution in leaf photosynthesis. In this study, a mutant was screened by chlorophyll fluorescence equipment from
EMS mutagenesis of wild-type Arabidopsis Col-0, which showed lower Fv/Fm than wild-type and was named lcf3-1 (lower chlo-
rophyll fluorescence 3-1). Genetic analysis of lcf3-1 mutant suggested that the mutation was controlled by single recessive gene.
LCF3 gene, which encodes PsbW protein, was isolated by map-based cloning. The T-DNA insertion mutant lcf3-2 showed low
chlorophyll fluorescence phenotype as lcf3-1, and this phenotype could be complemented by LCF3 gene of wild-type. These ex-
periments implied that the phenotype of low-chlorophyll-fluorescence resulted from LCF3 gene mutation. Furthermore, our re-
sults indicated that LCF3 protein is located in chloroplast and LCF3 gene is expressed in various tissues. PsbW protein is impor-
tant for the contact and stability between several PSII-LHCII supercomplexes.
Keywords: Arabidopsis thaliana; Chlorophyll fluorescence; Photosynthesis; Map-based cloning
光合作用是绿色植物最重要的生理活动之一 ,
该作用分为光反应和暗反应2个阶段 , 是植物和光
合细菌将光能转化为化学能的重要过程。光反应中
光的吸收是由仅能吸收利用长波光的系统 P S I
(photosystem I)和只能吸收利用短波光的系统 PSII
(photosystem II)完成[1-2]。其中 PSII是由多个亚单位
组成的色素-蛋白复合体, 该复合体参与植物光合系
统中光解放氧过程[3]。蓝藻 PSII 复合体主要由分子
量<10 kD的低分子量蛋白组成, 高等植物 PSII复合
体则含有蓝藻中不具备的 3个低分子量蛋白 PsbR、
PsbTn 和 PsbW[4], 这 3 个蛋白的细胞定位及功能特
点还不完全清楚。
PsbW是一个6.1 kD的PSII低分子量蛋白亚基 ,
最初发现是菠菜PSII的组成成分[5-6], 该蛋白仅参与
第 5期 刘凌云等: 拟南芥低叶绿素荧光 LCF3基因的克隆与功能分析 691
PSII但不涉及PSI蛋白复合体的组成 [7-8], 具有稳定
PSII同源二聚体结合的潜在作用[9]。然而, 近年发现
PsbW与Lhcb蛋白一起参与PSII后续组装步骤 [10-13],
并且PsbW缺失导致有序排列的PSII-LHCII (light-
harvesting complex II)超复合体的大结构域不能形成,
从而使PSII亚单位之间能量传递效率降低 , 同时
PSII对光胁迫响应的调节变慢[14]。
植物吸收太阳光主要用于光合作用、热耗散和
叶绿素荧光。叶绿素荧光发射除了受到激发能的传
递、天线色素和反应中心色素性质和定位的影响外,
还受PSII反应中心供体侧和受体侧氧化还原状态的
影响[15-17]。叶绿素各荧光参数的变化间接反映叶绿
体及其内部叶绿素状态。因此, 叶绿素荧光成为光
合作用研究中极重要的富含信息的高效指示剂。
叶绿素荧光动力学技术是一种以光合作用理论
为基础, 利用体内叶绿素作为天然探针, 研究和探
测植物光合生理状况及各种外界因子对其影响的新
型植物活体测定和诊断技术。本研究运用此技术 ,
筛选出叶绿素荧光参数Fv/Fm值较野生型低的突变
体lcf3-1, 并对其进行分子克隆及基因定位研究。转
基因回补实验证实该基因是PsbW的等位基因。LCF3
定位于叶绿体, 并在植物中普遍表达。对LCF3的研
究使叶绿素荧光技术筛选突变体的理论和方法得到
不断的完善, 并且为光合作用机制的深入研究提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
将野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)的生
态 型 Columbia (Col) 用 于 表 型 筛 选 , 生 态 型
Landsberg erecta (Ler)用于图位克隆。拟南芥突变体
lcf3-1是EMS (甲基磺酸乙酯)诱变Col野生型得到的
低叶绿素荧光突变体。
1.2 材料种植
拟南芥种子用0.01%升汞悬浮浸泡5 min, 无菌水
漂洗5次后, 播种于含0.6%琼脂的MS培养基上。4℃春
化2~4 d后放入培养间, 待种子萌发, 生长10 d左右移至
土中继续生长。生长条件为22℃ (昼)/18℃ (夜), 光周期
为16 h (光)/8 h (暗), 光强为120~130 mol m–2 s–1。
1.3 突变体的遗传分析
以突变体lcf3-1为母本、野生型Ler为父本, 杂交
得到F1代, F1自交获得F2代。观察F2代表型, 并统计
植株表型的分离比。
1.4 转基因材料的获得
以野生型Col基因组DNA为模板 , 以LCF31F:
5-GGGGGATCCTCTCAGAATGCAGAATATCAGA-
3和LCF31R: 5-CCCAAGCTTCCATGTTAACTATAT
GTGTATTC-3为引物扩增LCF3基因构建回补载体
LCF3::pCAMBIA1300-COM; 以LCF32F: 5-GGGAA
GCTTCAGATATAGTTCACAGCAACAT-3 和 LCF32R:
5-CCCGGATCCGCGGAGGCAGTAAAGCTAGCC-3
为引物构建pLCF3::pCAMBIA1391-GUS载体; 以野
生型Col的cDNA为模板, 分别以LCF33F: 5-GGGG
GTACCATGGCTAGCTTTACTGCCTCCG-3和 LCF3
3R: 5-GGGGGATCCGAGTGAAAGACCAGATTCT
TC-3及LCF34F: 5-GGGAAGCTTATGGCTAGCTTT
ACTGCCTCCG-3和 LCF34R: 5-GGGGGTACCGA
GTGAAAGACCAGATTCTTC-3为引物构建带GFP
标签的永久表达载体LCF3::super1300+-GFP和瞬时
表达载体LCF3::pHBT-GFP。将以上获得的重组载体
分别以农杆菌介导[18]或者PEG介导[19]的方法转入突
变体lcf3-1或野生型拟南芥Col, 以及野生型Col叶肉
细胞原生质体。对其中永久表达植株通过潮霉素筛
选获得阳性转基因材料进行功能分析, 叶肉细胞原
生质体瞬时表达LCF3::GFP在激光共聚焦显微镜下
观察荧光, 进行LCF3蛋白亚细胞定位分析。
1.5 叶绿素荧光的测定
参照 Wang 等[20]方法进行 β-葡糖苷酸酶(GUS)
的组织化学染色和共聚焦显微镜观察 GFP 荧光定
位。利用叶绿素荧光成像仪(CF Imager, Technologica
公司)于 25℃下测定叶绿素荧光猝灭过程。叶片暗适
应 30 min后, 测定 Fv/Fm值。Fv/Fm比值反映光合系
统 II 光化学反应的最大光合效率。该参数被广泛应
用于光合系统受胁迫程度的检测, Fv/Fm值降低暗示
光合系统 II受损伤。
2 结果与分析
2.1 叶绿素荧光突变体 lcf3-1的表型分析
突变体 lcf3-1 在植株形态和叶片颜色及开花时
间上与野生型均无明显差异。在培养皿中培养 lcf3-1
10 d 后, 利用叶绿素荧光成像仪检测其叶绿素荧光
表型, 发现突变体 Fv/Fm值低于 Col及 Ler野生型(图
1-B)。将突变体 lcf3-1移栽土中培养 25 d后, 其Fv/Fm
值仍低于野生型(图 1-D), 数据统计分析显示两者之
间存在显著相差(P < 0.05)。经暗处理 3 d后, 二者在
叶绿素含量上无明显区别(图 2-A), 但二者 Fv/Fm值
相差 0.20左右, 较暗处理前差异明显增大(图 2-B)。
692 作 物 学 报 第 42卷
图 1 叶绿素荧光突变体的筛选
Fig. 1 Mutants screening by chlorophyll fluorescence imaging
A: 培养皿中生长 10 d的幼苗; B: 培养皿中生长 10 d幼苗的叶
绿素荧光图像; C: 土中生长 25 d的幼苗; D: 土中生长 25 d幼苗
的叶绿素荧光图像。
A: Seedlings grown on MS culture medium for 10 days; B: Chlo-
rophyll fluorescence of seedlings grown on MS culture medium for
10 days; C: Seedlings grown in soil for 25 days; D: Chlorophyll
fluorescence of seedlings grown in soil for 25 days.
图 2 lcf3-1突变体叶绿素含量及 Fv/Fm值
Fig. 2 Chlorophyll content and chlorophyll fluorescence
Fv/Fm in WT and lcf3-1 mutant
A: 暗处理 3 d后叶绿素含量; B: 暗处理 3 d后叶绿素荧光。
A: Chlorophyll a and b contents after dark treatment for 3 days;
B: Chlorophyll fluorescence after dark treatment for 3 days.
2.2 突变体 lcf3-1的遗传分析
将突变体与 Col 野生型回交, 回交 F1代所有植
株均表现野生型表型, F1代自交得到 F2代, F2代种下
后经暗处理, 叶绿素荧光成像检测 Fv/Fm, 发现 F2代
表型出现分离, 分离比例接近 3∶1 (表 1), 这表明
lcf3-1 为单基因隐性突变, 可以通过图位克隆的方
法找到该突变位点。
2.3 LCF3基因的图位克隆
将 lcf3-1突变体和 Ler野生型杂交得到 F1代, F1
自交得到 F2代, 挑选 F2代中具有 lcf3-1 突变体表型
的 88株植株分别提取 DNA, 利用 TAIR网站上的引
物(marker)信息粗定位。经过 PCR 及凝胶电泳检测
发现 lcf3-1 突变位点与第 2 染色体中下游 NGA168
BAC 明显连锁, 重组率约为 10.94%。由此推断, 该
突变基因位于第 2 染色体下端附近。在此基础上扩
大遗传群体, 用 616 个 F2代 lcf3-1 低叶绿素荧光表
型植株的 DNA在 NGA168 BAC的两端分别设计引
物进一步细定位 , 发现突变位点可能位于 T6B20
BAC上, 重组率为 1.62% (图 3-A)。通过进一步精细
定位和测序确定突变基因为 At2G30570, 该基因只
含有一个内含子, lcf3-1突变体中 At2G30570内含子
的 3´端剪接边界区发生突变, 由鸟嘌呤(G)转换为腺
嘌呤(A)(图 3-B), 从而使 lcf3-1突变体中 LCF3基因
的 mRNA 出现不同大小的剪接版本(图 4), 表明
lcf3-1突变体中 LCF3正常的剪接过程出现了错误。
2.4 LCF3影响叶绿素荧光表型的功能验证
从 SALK中心获得了 PsbW (At2G30570)基因的
T-DNA 插入突变体 SAIL_885_A03, 命名为 lcf3-2,
并通过半定量 RT-PCR检测其 At2G30570未表达(图
5)。在 lcf3-1突变体背景下构建了 PsbW自身启动子
驱动的 PsbW 回补转基因植株, 暗处理后, 突变体
lcf3-1和 lcf3-2均显示出明显低于野生型的低叶绿素
荧光表型(图 6-A), 而 lcf3-1 突变体背景的回补转基
因植株则表现出和野生型相似的表型(图 6-B)。这一
结果进一步证实 lcf3-1 突变体的低叶绿素荧光表型
是由 LCF3/PsbW (At2G30570)基因突变所致。
2.5 LCF3蛋白亚细胞定位分析
LCF3 基因突变导致拟南芥低叶绿素荧光表型,
推断 LCF3 蛋白可能是在叶绿体中发挥作用。
pHBT-GFP 空载体转化拟南芥叶肉细胞原生质体时,
GFP荧光几乎充满整个细胞质部分(图 7-A)。融合蛋
白 LCF3::GFP的绿色荧光则特异地出现在细胞内叶
绿体中(图 7-B)。另外 LCF3::super1300+-GFP永久转
表 1 突变体遗传分析
Table 1 Genetic analysis of lcf3-1 mutant
世代
Generation
总株数
Total plants
野生型
Wild-type
突变体
Mutant
χ2 P0.05
F1 98 98 0
F2 711 535 176 2.1316 3.84
第 5期 刘凌云等: 拟南芥低叶绿素荧光 LCF3基因的克隆与功能分析 693
图 3 LCF3基因的克隆
Fig. 3 Map-based cloning of LCF3 gene
A: LCF3基因图位克隆; B: lcf3-1突变体中 At2G30570内含子 3´端边界发生 G/A突变。
A: Map-based cloning of LCF3 gene; B: Mutation from G to A in intron 3′ border of gene AT2G30570 in lcf3-1.
图 4 lcf3-1突变体基因突变位点分析
Fig. 4 Analysis of mutation site of lcf3-1 mutant
半定量 PCR检测 LCF3基因表达情况, ACTIN2为内参基因。
Expression analysis of LCF3 in WT and lcf3-1 by RT-PCR, ACTIN2
gene was used as control.
图 5 野生型及 lcf3-2突变体中 LCF3基因表达情况
Fig. 5 Expression analysis of LCF3 in WT and T-DNA
insertion line lcf3-2 by RT-PCR
半定量 PCR检测 lcf3-2突变体中 LCF3基因表达情况, ACTIN2
为内参。
Expression analysis of LCF3 in WT and T-DNA insertion line lcf3-2
by RT-PCR, ACTIN2 gene was used as control.
基因植株也显示气孔保卫细胞中 LCF3::GFP融合蛋
白绿色荧光与叶绿体红色自发荧光完全重合 (图
7-C)。以上结果说明 LCF3蛋白定位于叶绿体中。
2.6 LCF3基因组织表达分析
利用分离得到的 LCF3 基因启动子与报告基因
图 6 LCF3基因突变导致低叶绿素荧光表型的验证
Fig. 6 Verification of the function of LCF3 gene on
chlorophyll fluorescence
A: lcf3-1和 lcf3-2突变体叶绿素荧光均低于 Col野生型;
B: lcf3-1突变体中回补 At2G30570基因使转基因植株叶绿素
荧光表型恢复。
A: Chlorophyll fluorescence of lcf3-1 and lcf3-2 was lower than
that of WT. B: Complementation transgenic line showed the same
chlorophyll fluorescence as WT.
GUS 融合的转基因植株, 检测 LCF3 在拟南芥不同
组织中的表达模式。组织化学染色表明, 14 d龄植株
叶片与根成熟区有强烈的 GUS表达, 而根尖分生组
织没有 GUS 表达。植物抽薹后对花进行 GUS 活性
染色, 发现花萼、花药以及柱头中均有 GUS表达(图
8)。这一结果暗示 LCF3可能在植物发育的不同时期
均有作用。
3 讨论
本文根据叶绿素荧光动力学原理, 用叶绿素荧
光成像仪筛选出荧光参数 Fv/Fm 值比野生型低的拟
南芥突变体 lcf3-1, 并发现其低叶绿素荧光表型可
694 作 物 学 报 第 42卷
图 7 LCF3蛋白亚细胞定位
Fig. 7 Subcellular localization of LCF3
A: pHBT-GFP空载体转化拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光分布; B: pHBT::LCF3-GFP转化拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光分布;
C: super1300+::LCF3-GFP永久转基因植株保卫细胞荧光分布。Bar=5 μm。
A: Fluorescence distribution of mesophyll protoplast of Arabidopsis transformed by pHBT-GFP vector. B: Fluorescence distribution of
mesophyll protoplast of Arabidopsis transformed by pHBT::LCF3-GFP vector. C: Fluorescence distribution of guard cell from transgenic
plants by super1300+::LCF3-GFP. Bar=5 μm.
图 8 LCF3基因的组织表达分析
Fig. 8 Organ-specific expression of LCF3 in Arabidopsis
A: 14 d的拟南芥幼苗; B: 花; C: 14 d幼苗根尖放大。
A: Arabidopsis seedlings of 14 days-old; B: Flower; C: Root tip in
picture of 14 days-old seedlings.
以稳定遗传。对 lcf3-1突变体的遗传分析表明, lcf3-1
是单基因隐性突变体。突变基因经图位克隆最终将
突变位点限定在拟南芥第 2 染色体中下部的 T6B20
和 F7F1 BAC之间, 对这 2个 BAC间所有基因的生
物信息学分析, 找到 3 个可能与光合作用有关的基
因, 并进行基因测序, 最终认定 lcf3-1突变体中突变
基因 LCF3为 At2G30570。在 lcf3-1突变体中, 该基
因内含子 3边界一个碱基发生突变, 由鸟嘌呤(G)转
换为腺嘌呤(A)。该突变导致 LCF3基因的转录本在
剪切成熟过程中发生错误, 部分转录本的内含子无
法被剪切, 导致所编码的蛋白功能异常。我们所克
隆的 LCF3突变基因与已经报道的 PsbW基因是等位
基因。LCF3 基因突变导致拟南芥叶绿素荧光 Fv/Fm
值低于野生型。LCF3 的 T-DNA 插入缺失突变体
lcf3-2也表现出类似于 lcf3-1的低叶绿素荧光表型。
结合我们获得的表型回补转基因植株能够恢复拟南
芥 lcf3-1 突变体低叶绿素荧光表型, 证明该突变体出
现的低叶绿素荧光表型确实是由 PsbW (At2G30570)基
因突变所致。
PsbW 基因编码一个分子量为 6.1 kD 的小分子
蛋白, 存在于真核光合细胞中, 是光系统 II 蛋白复
合体的一个成分。已有文献报道 PsbW 基因 T-DNA
插入敲除突变体与反义抑制突变体均导致光系统 II
超分子复合体不稳定[14]。只有光系统 II (PSII)与集
光复合体(LHCII)未结合形成超分子复合体时, 能够
检测或分离出游离的 PsbW蛋白。PsbW蛋白缺失表
现出叶绿素荧光参数 Fv/Fm减少, 光系统 II 核心蛋
白磷酸化作用显著降低, 以及暗适应叶片中质体醌
池氧化还原状态的明显改变。此外, PsbW蛋白缺失
还导致质体醌池中氧化还原反应加快。PsbW缺失突
变体和反义抑制突变体能够光自养正常生长, 说明
第 5期 刘凌云等: 拟南芥低叶绿素荧光 LCF3基因的克隆与功能分析 695
PsbW蛋白对光合细胞来说不是必不可少的亚基。虽
然 PsbW 缺失突变体植株 PSII-LHCII 超复合体结构
改变, 但突变体细胞中叶绿体结构与野生型类似。
因此 PSII-LHCII超分子复合体的稳定性对植物叶绿
体类囊体膜上基粒的形成可能不是必需条件 [21]。
PsbW 蛋白亚基在高等植物叶绿体中的进化源于陆
生植物, 其与叶绿体膜上的捕光天线色素蛋白一起
参与光合作用。PsbW蛋白可能细微调整 PSII-LHCII
超复合体的组装及稳定, 因此能在叶绿体基粒膜上
形成 PSII-LHCII 超复合体的有序排列, 优化陆生植物
的光合作用, 有效地应对植物生存环境条件的改变。
叶绿素荧光动力学技术作为光合作用研究手段,
在植物光合作用突变体筛选中起到了重要作用[22-24],
本文的实验结果也印证了这一点。同时这一技术也
随着人们对光合作用认识的不断深入而改进。
4 结论
利用图位克隆技术成功克隆到 LCF3 基因。该
基因突变导致拟南芥叶绿素荧光降低。lcf3-1突变体
的叶绿素荧光表型为 At2G30570 基因突变所致。
LCF3 基因在植物中普遍性表达。LCF3 定位于叶绿
体, 与其参与光合作用调节的功能相吻合。
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