全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(1): 5869 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31370690), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-23)和中国农业科学院科技创新工程(CAAS-
ASTIP-2014-TRICAAS)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31370690), the Special Program of Modern Agro-industry Technology System
(CARS-23) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS).
* 通讯作者(Corresponding authors): 杨亚军, E-mail: yjyang@mail.tricaas.com, Tel: 0571-86650266; 王新超, E-mail: xcw75@mail.tricaas.
com, Tel: 0571-86653162
第一作者联系方式: E-mail: wb32244@tricaas.com, Tel: 18757154898
Received(收稿日期): 2015-06-08; Accepted(接受日期): 2015-09-06; Published online(网络出版日期): 2015-10-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151008.1403.030.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00058
茶树生长素外运载体基因 CsPIN3的克隆与表达分析
王 博 1,2 曹红利 1,2 黄玉婷 1,2 胡玉荣 1,2 钱文俊 1,3 郝心愿 1
王 璐 1 杨亚军 1,* 王新超 1,*
1中国农业科学院茶叶研究所 / 国家茶树改良中心 / 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室, 浙江杭州 310008; 2中国农业科学院
研究生院, 北京 100081; 3 西北农林科技大学, 陕西杨凌 712100
摘 要: 从实验室前期茶树冷驯化转录组测序结果中筛选拼接得到 1 条与其他植物 PIN 蛋白高度相似的 EST 序列,
采用反转录 PCR 结合 RACE 技术从茶树中克隆到生长素外运载体基因 PIN3 的全长 cDNA 序列, 命名为 CsPIN3
(GenBank登录号为 KP896474)。CsPIN3全长 2654 bp, 包含 1926 bp的完整开放阅读框(ORF), 编码 641个氨基酸。
生物信息学分析显示, CsPIN3编码的蛋白质分子量为 70.15 kD, 理论等电点为 8.42, 是一种非分泌性蛋白; 亚细胞定
位显示, CsPIN3主要分布于质膜上, 在内质网中有少量分布, 是典型的膜蛋白; 氨基酸序列分析表明, CsPIN3编码蛋
白由两端的疏水区和中间的亲水区构成。疏水区内有多个跨膜螺旋, 其中 N端疏水区有 5个跨膜螺旋, C端有 4个, 与
水稻的 PIN 蛋白结构相似。亲水区存在 2 个可变结构域, 还存在着糖基化位点和磷酸化位点以及调控 PIN 蛋白内吞
作用的 NPNXY保守内在构型(inner motif, IM), 如 PIN蛋白特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PID/PINOID)磷酸化活性
位点 TPRXS(N/S)结构域; 相似性及系统进化分析表明, 该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性, 与杨树、葡萄、
柑橘、烟草、番茄、马铃薯、芝麻等植物的 PIN序列相似性在 80%以上, 与茄科植物的亲缘关系最近。在拟南芥 PIN
蛋白中, AtPIN3与茶树 CsPIN3的亲缘关系较近。组织表达特异性分析表明 CsPIN3在茶树根、茎、叶、花中均有表
达, 在花中的表达量较高, 在茎、叶中的表达量略高于根部。实时定量 PCR分析显示, CsPIN3在龙井 43茶树越冬芽
萌发阶段的表达量高于休眠阶段(休眠初期到膨大期之间), 在茶芽萌动过程中表达上调的速度明显。推测该基因可能
与茶树越冬芽休眠的维持和解除相关。
关键词: 茶树; 休眠; 生长素外运载体基因; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Auxin Efflux Carrier Gene CsPIN3 in Tea
Plant (Camellia sinensis)
WANG Bo1,2, CAO Hong-Li1,2, HUANG Yu-Ting1,2, HU Yu-Rong1,2, QIAN Wen-Jun1,3, HAO Xin-Yuan1,
WANG Lu1, YANG Ya-Jun1,*, and WANG Xin-Chao1,*
1 Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Biology and
Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China; 2 Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing
100081, China; 3 Northwest A&F University, Yangling 712100, China
Abstract: On the basis of previous transcriptome study on tea plant cold acclimatization, we obtained a PIN homology gene
named CsPIN3 and cloned its full-length cDNA sequence by reverse transcription-PCR (RT-PCR) combining with rapid amplifi-
cation of cDNA ends (RACE). The full length cDNA of CsPIN3 is 2654 bp (GenBank accession No. KP896474) and contained a
1926 bp open reading frame (ORF) encoding 641 amino acid residues. Bioinformatic analyses showed that CsPIN3 is not a secre-
第 1期 王 博等: 茶树生长素外运载体基因 CsPIN3的克隆与表达分析 59


tory protein and had a molecular weight of 70.15 kD, atheoretical isoelectric point of 8.42. Subcellular localization prediction
showed that CsPIN3 is a typical membrane protein mainly located in plasmalemma and then in endoplasmic reticulum. Moreover,
amino acid sequence analysis indicated that CsPIN3 protein contained hydrophobic regions in both ends and hydrophilic regions
in the middle. Similar to PIN protein in rice, the hydrophobic regions of CsPIN3 consisted of several transmembrane helixes,
among which five was in N motif and four in C motif. The hydrophilic regions of CsPIN3 had two unstable domains, several
o-glycosylation sites, several phosphorylation sites like TPRXS (N/S) motif (a PID/PINOID phosphorylation site) and a well
characterized conserved inner motif NPNXY regulating the endocytosis of PIN. Comparison of sequences similarity showed that
the amino acid sequence coded by CsPIN3 had more than 80% similarity with reported PINs of Populus trichocarpa, Vitis vinifera,
Citrus sinensis, Nicotiana tomentosiformis, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, and Sesamum indicum. Phylogenetic tree
analysis showed that CsPIN3 had the closest genetic relationship with Solanaceae and the highest identity with AtPIN3 of Arabi-
dopsis thaliana PIN proteins. The CsPIN3 gene differentially expressed in different tea plant tissues, and transcript abundance in
flower was much higher than that in leaf, stem and root. In addition, we analyzed the expression of CsPIN3 by qRT-PCR during
the different phases of bud dormancy formation and break, and the results indicated that in cultivar Longjing 43, the expression
level of CsPIN3 at growth phase was higher than that at dormant phase (from initial dormant stage to expanding stage) and an
obvious expression jump was detected at bud sprouting stage. These results demonstrated that CsPIN3 might be associated with
the regulation of tea plant bud dormancy formation and break.
Keywords: Tea plant (Camellia sinensis); Dormancy; Auxin efflux carrier; Expression analysis
茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]是多年生
木本植物, 每年秋、冬季, 短日照和低温促使芽进入
休眠状态。安全越冬后, 随着气温回升及光照时间
的增加, 打破休眠使芽萌发。芽休眠作为茶树长期
自然演化获得的一种生物学适应性, 有助于茶树的
安全越冬[1]。茶树芽休眠受诸多因素的影响, 其中内
源激素生长素是一个重要因素 [2], 生长素运输载体
蛋白作为生长素转运的载体, 可在植物组织或器官
中建立生长素的不对称分布, 生长素通过其运输载
体介导的极性运输在植物组织或器官中建立浓度梯
度, 进而在植物生长发育过程中表现出广泛的生理
效应[3]。因此研究茶树生长素运输载体基因家族与
茶树芽休眠和解除的关系, 使之用于茶树种质资源
早生品种的筛选鉴定, 以辅助茶树育种工作, 有着
重要的理论和实践意义。
PIN 蛋白家族是植物生长素运输载体中最为重
要的基因家族, 负责向细胞外运输生长素 [4], 目前,
已知模式植物拟南芥中 PIN 蛋白家族有 8 个成员,
分别被命名为 PIN1~PIN8。PIN 蛋白家族成员均为
膜蛋白, 均由位于两端的疏水区和中间的亲水区构
成, 两端的疏水区皆由 5个跨膜螺旋构成, 亲水环在
细胞内, 在亲水区域存在着糖基化位点和磷酸化位
点[5]。PIN1 是生长素动态运输的重要组件[6]; PIN2
位于根表皮组织基部皮层细胞的顶端, 具有分配与
根向地生长有关的生长素功能[7]; PIN4和 PIN7主要
是非极性定位, PIN4 参与根尖分生组织静止中心生
长素库的建立[8]; PIN7 定位在基部细胞质膜的上表
面, 调节胚轴的形成和根中生长素的向顶式运输[9];
定位于内质网的 PIN5、PIN6、PIN8 主要参与调节
细胞内生长素的动态平衡[8]; Keuskamp 等[10]研究表
明, PIN3主要定位在茎芽内皮层细胞、重力响应根柱
以及中柱鞘细胞质膜上, 能将重力刺激信号转化为
生长素的非对称分布, 从而控制植物的向性生长。另
外, He等[11]研究表明, 在葡萄越冬芽萌发时, 如果下
调 PIN3 表达会降低生长素从芽内向外运输的能力,
延缓休眠芽从生理休眠向生态休眠的转变, 推迟萌
发; Leduc等[12]研究推测, 植物通过调控PIN1的定位,
将光信号转化为生长素信号影响芽的萌发。
PIN 蛋白家族在植物生长素运输过程中具有重要
功能。目前, 已经从多种植物, 如马铃薯[13]、芒果[14]、
狗蔷薇[15]、拟南芥、大米、番茄[16]等中克隆了 PIN
基因。但茶树中有关 PIN 蛋白家族的研究还未见报
道。本研究利用 RACE 结合 RT-PCR 的方法, 以本
实验室通过转录组测序获得的茶树中与 PIN 高度同
源的 EST 片段为模板 , 克隆茶树 CsPIN3 全长
cDNA序列, 分析 CsPIN3在茶树不同组织间的表达
差异及芽休眠不同阶段的表达模式及其在茶树越冬
芽休眠解除中的功能, 为研究生长素在茶树越冬芽
休眠与解除中的作用机制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2013 年 10 月至 2015 年 3 月, 在中国农业科学
院茶叶研究所内实验基地种植特早生国家级茶树品
种龙井 43。于茶树盛花期, 取茶树的根、茎、叶、
花等组织。从茶树进入休眠期开始, 根据芽的发育
情况, 分别于 2013—2014年 11月 2日、12月 1日、
1 月 2 日、2 月 14 日、3 月 3 日、3 月 14 日、3 月
60 作 物 学 报 第 42卷

27日, 2014—2015年 11月 4日、12月 2日、1月 5
日、2 月 5 日、3 月 3 日、3 月 18 日、3 月 23 日采
摘茶树顶芽 , 以液氮速冻所有样品并迅速置–80℃
冰箱保存待用。
SMART RACE cDNA Synthesis Kit和Advantage 2
PCR Kit、Universal Primer Mix购于 Clontech公司
(Mountain View, CA, USA); SYBR Premix Ex Taq
(Perfect Real Time)试剂盒、Prime Script Reagent试
剂盒、克隆载体 PCR2.1 vector、IPTG、X-gal、大肠
杆菌 DH5α 感受态细胞和 rTaq 酶均为 TaKaRa 公司
产品(大连); 逆转录酶 SuperScript III购自 Invitrogen
公司(Carlsbad, USA); DNA Marker、琼脂糖凝胶回收
试剂盒为购自 Axygen 公司 (California, USA)的
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit。其余试剂为国产分
析纯。由杭州擎科生物技术有限公司合成 PCR引物,
由上海华津生物技术有限公司测序。
1.2 总 RNA的提取、cDNA的合成
取 0.2~0.5 g 不同休眠阶段的茶树样品, 参考
Chang 等[17]方法提取茶树总 RNA。使用 NanoDrop
ND100微量核酸蛋白测定仪(Pittsburgh, PA, USA)测
定吸光值, 确定 RNA浓度, 用 1.0%变性琼脂糖凝胶
电泳检测总 RNA质量, 最后调整 RNA浓度至 1 μg
μL–1, 于–80℃保存备用。
以 1 μg提取的龙井 43顶芽总 RNA为模板, 参
照 SMART RACE cDNA Synthesis Kit操作步骤, 合
成 5′和 3′的 cDNA链, 用于 RACE-PCR; 以 1 μg顶
芽总 RNA 为模板, 根据 SuperScript III 试剂盒的操
作说明合成第 1链 cDNA用于反转录 PCR (RT-PCR)
来扩增 ORF; 用 1 μg 不同休眠阶段顶芽提取的总
RNA按照 Prime Script Reagent试剂盒的操作说明合
成 cDNA, 稀释 10倍后作为模板进行荧光定量 PCR
(qRT-PCR)检测。
1.3 茶树 CsPIN3克隆
本实验室前期对茶树冷驯化样品做了转录组测
序(NCBI 登录号为: SRA061042)[18], 在此基础上筛
选出与生长素外运载体 PIN 高度同源的 EST 序列,
以 DNAStar 软件拼接, 获得一条序列。根据序列设
计 5′和 3′特异引物(表 1), 按照 SMART-RACE 试剂
盒的要求进行 5′-和 3′-RACE-PCR反应, 得到该基因
的 5′和 3′端扩增序列。RACE-PCR条件为 94℃、30
s, 68℃、30 s, 72℃、3 min, 30个循环。RACE-PCR
产物经 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒纯化回收后,
连接到 PCR2.1 vector 上, 转化至大肠杆菌 DH5α,
蓝白斑筛选挑取白色单菌落鉴定, 对每个连接产物
至少挑选 3 个阳性菌落的菌液送上海华津生物科技
有限公司测序。
测序得到的序列去载体、比对拼接, 得到基因
的 5′端和 3′端序列, 再与原 EST 序列拼接, 初步得
到 PIN的 cDNA全长序列。在开放阅读框(ORF)上、
下游区域设计 RT-PCR特异引物(表 1), 以 PCR扩增
得到 ORF序列。反应条件为 94℃ 4 min, 94℃ 30 s,
55℃ 30 s, 72℃ 2 min, 30个循环; 72℃ 10 min。
PCR 产物经回收、连接、转化、测序后, 得到茶树
完整的 PIN全长 cDNA序列[19]。
1.4 CsPIN3序列的生物信息学分析
试验中所用核酸及氨基酸序列均从 NCBI 网站
下载, 利用 NCBI 的 BlastX 工具进行同源性比对分
析; 利用 DNAStar 软件进行序列拼接和开放阅读框
查询; 利用 ClustalW 软件进行多序列对齐和排序,
使用 GenDOC 和 MEGA5.0 软件输出同源比对和进
化树构建结果 [20]; 用 SingaIP 进行信号肽预测 [21];
用 ProtParam 计算蛋白质的相对分子质量和理论等
电点[22]; 利用 ProtScale 进行蛋白质疏水性分析; 利
用 SOPMA 进行蛋白质的二级结构分析 [23]; Dic-
tyOGlyc 1.1 Server 预测 O-糖基化位点[24]; NetPhos
2.0 Serve软件预测磷酸化位点, PSORT进行蛋白质
的亚细胞定位[25]; 利用 TMHMM预测蛋白质的跨膜
结构域并用 TMRPres2D软件作图[26]。

表 1 试验引物及其序列
Table 1 Sequence of primers used in this study
引物名称
Primer
上游引物序列
Forward sequence (5′→3′)
下游引物序列
Reverse sequence (5′→3′)
PIN3 3′ RACE CCAGTGCATCACCCGTGTCGGAAGG TGTCTGTGTCTGTGGCTGTGATGGT
PIN3 ATCTCTTGGCACGACCTCTACACCG TGCAGGATGAACATTATATTCTTTGG
PIN3 qRT-PCR ACACCCTAAAATGGCCGGAG CATAGCAACATGCCACCTGC
PTB TGACCAAGCACACTCCACACTATC TGCCCCCTTATCATCATCCACAA

第 1期 王 博等: 茶树生长素外运载体基因 CsPIN3的克隆与表达分析 61


1.5 CsPIN3基因的表达模式分析
以茶树 CsPTB基因作为内参基因[27], 根据目的
基因序列设计荧光定量 PCR 引物(表 1)。以龙井 43
不同休眠阶段的顶芽总 RNA 为材料, 按照 Prime
Script Reagent 试剂盒的操作说明合成 cDNA, 稀释
10倍作为模板。荧光定量反应体系为 SYBR Premix
Ex Taq 10 μL, 上、下游引物(10 μmol L–1)各 0.8 μL,
ROX Dye II 0.4 μL, cDNA 2 μL, 加水至终体积
20 μL。反应在 ABI PRISM 7500实时定量 PCR仪上
进行, 95℃变性 30 s, 95℃变性 5 s, 60℃退火延伸
34 s, 40个循环[27]。反应结束后分析荧光值变化曲线
和熔解曲线。每个反应重复 3次, 采用 2–ΔΔCt算法[28]
分析结果。
2 结果与分析
2.1 CsPIN3 cDNA全长序列的的克隆及分析
从实验室前期茶树冷驯化转录组测序结果中筛
选拼接得到 1 条 PIN 的 EST 序列, 在 NCBI 中进行
BlastX 同源性比对, 结果显示该序列与其他植物中
的 PIN 序列高度相似, 但无完整的开放阅读框。根
据此中间序列分别设计 RACE 特异引物, 分别扩增
得到约 1.2 kb 的 3′端序列和约 1 kb 的 5′端序列(图
1), 测序后经BlastX显示两端序列均编码 PIN, 然后
将两序列片段与原 EST 序列拼接, 能够查找到编码
PIN 氨基酸序列的完整开放阅读框(ORF), 在 ORF
两端设计引物, 进行 RT-PCR检测并测序验证, 最后
获得了长为 2654 bp的 cDNA序列, 其 5′端有 114 bp
的非编码区(5′-UTR), 3′端有 624 bp 的非编码区
(3′-UTR), 终止子 TGA 后具有非常保守的多聚腺苷
酸加尾结构。依据上述特征, 判断本研究获得了茶
树 PIN的完整 cDNA全长序列。该序列全长 2654 bp,
包含 1926 bp的 ORF, 编码 641个氨基酸。对氨基酸
序列分析表明, 其含有 PIN3蛋白的 2个重要保守域,
即 NPNXY 内在保守结构域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激
酶 (PID/PINOID)磷酸化活性位点——TPRXS(N/S)
结构域, 由此推测克隆到的基因属于 PIN3, 命名为
CsPIN3, GenBank登录号为 KP896474 (图 2)。
2.2 茶树 CsPIN3基因系统发育分析
将茶树 CsPIN3序列的全长 cDNA在 NCBI中进
行 BlastX 同源比对, 结果显示它编码的氨基酸序列
与其他物种中报道的生长素外运载体 PIN 蛋白的相
似性均在 80%左右 , 其中与杨树 (Populus tricho-
carpa, XP002308100.1)的相似性最高, 达 85%。与葡
萄(Vitis vinifera, XP002284302.1)、柑橘(Citrus sinensis,
XP006469168.1)、烟草(Nicotiana tomentosiformis, XP
009601548.1)、番茄(Solanum lycopersicum, NP00123
4184.1)、马铃薯(Solanum tuberosum, XP006344239.1)
和芝麻(Sesamum indicum, XP011070630.1)等的相似
性分别为 82%、82%、82%、81%、81%和 80%。
在 NCBI上筛选出与茶树 CsPIN3基因氨基酸序
列相似性较高的 8 个不同物种的生长素外运载体
PIN蛋白, 并将其与茶树 CsPIN3基因预测的氨基酸
序列进行多序列比对。结果显示, 茶树 CsPIN3与其
他 PIN 氨基酸序列有较高的保守性, 特别是可变结
构域、磷酸化位点及糖基化位点等重要功能位点的
序列保守型更高。此外, 所有 PIN 蛋白都存在调控
其内吞作用的 NPNXY 保守内在构型(inner motif,
IM)(图 3)。在 MEGA5.0 软件中用邻接相对法绘制
CsPIN3 与拟南芥及其他物种的 18 个 PIN 氨基酸序
列之间的进化树(图 4), 结果显示茶树的 CsPIN3 蛋

图 1 CsPIN3 5′和 3′-RACE(左)及 RT-PCR(右)电泳结果
Fig. 1 Electrophoresis results of 5′ and 3′ fragments (left) and ORF fragment (right) of CsPIN3
62 作 物 学 报 第 42卷


图 2 茶树生长素外运载体基因 CsPIN3全长 cDNA的核苷酸序列和推测氨基酸序列
Fig. 2 Full length cDNA and putative amino acid sequences of CsPIN3 in tea tree
下画线表示开放阅读框, 阴影部分为跨膜螺旋区域, 删除线部分为可变结构域, 方框部分为 NPNXY保守内在构型(IM)。↓: O-糖基化
修饰位点。起始终止密码子以加粗示出, 多聚腺苷酸加尾信号用黑体标出。
The open reading frame is underlined, the transmembrane domains are shaded, the low complexity domains are strikethrough and pane areas
are NPNXY conserved inner motif (IM). ↓: O -linked glycosylation sites. The initiation and termination codon are showed by bold fonts and
the putative poly (A) tail signal is showed in bold type.

白与茄科植物的亲缘关系最近。此外 , 在拟南芥
PINs蛋白中, AtPIN3与茶树CsPIN3的亲缘关系较近,
处于不同于其他 AtPINs的一个大的进化分支上。
2.3 CsPIN3蛋白质特征分析与 3D结构预测
2.3.1 CsPIN3理化性质 经 Protparam程序预测,
CsPIN3 的理论分子量为 70.15 kD, 理论等电点(pI)
为 8.42。含量最丰富的氨基酸有 10.3% Ser、9.0% Leu
和 7.6% Gly。CsPIN3中的酸性氨基酸(Asp + Glu)有
44个, 碱性氨基酸(Arg + Lys)有 47个; 利用 SignaIP-
4.1分析 CsPIN3蛋白信号肽和预测信号肽位点表明,
其平均分小于 0.500, 利用最大 Y 值预测表明
CsPIN3蛋白不存在信号肽及切割位点, 属于非分泌
蛋白(图 5); 作为蛋白质折叠的主要驱动力, 蛋白质
的亲水、疏水氨基酸的组成能够影响蛋白质的结构
和特性, 经在线软件 ProtScale 采用 Hyhob/Kyte &
Doolittle 的方法分析显示(图 6), 最大正值为 2.989,
最小负值为–3.100。CsPIN3蛋白是由 N端和 C端的
疏水区和中间第 181氨基酸(N端)至第 477氨基酸(C
端)的亲水区构成; 蛋白质的功能与亚细胞的定位存
在着非常密切的联系, 以往的研究表明, 生长素外
运载体 PIN家族均为膜蛋白, 利用 PSORT分析显示
CsPIN3蛋白主要位于质膜上, 内质网上也有少量的
分布, 属于典型的膜蛋白。
2.3.2 CsPIN3 蛋白的跨膜结构 利用在线软件
TMpred预测 CsPIN3蛋白跨膜结构(图 7), 显示该蛋
白在 N端和 C端疏水区各有一个跨膜结构域, 属于
跨膜蛋白。其中 N 端有 5个跨膜螺旋, 分别位于第
10~29、第 42~61、第 71~93、第 100~122、第 132~154
位氨基酸之间; C 端有 4 个跨膜螺旋, 分别位于第
526~548、第 558~580、第 585~607、第 617~639 位
氨基酸之间。这表明 CsPIN3 蛋白是以膜结合蛋白的
形式存在的, 这与其作为转运载体的功能是相适应的。
第 1期 王 博等: 茶树生长素外运载体基因 CsPIN3的克隆与表达分析 63



图 3 茶树 CsPIN3与其他植物 PIN氨基酸序列比对
Fig. 3 Mutiple aligement of deduced amino acid sequence of CsPIN3 with other plant PIN protein
方框显示可变结构域; ↓: NPNXY保守内在构型(IM); ▲: O-糖基化修饰位点; 横线: PINOID磷酸化的保守结构域。
Pane areas are low complexity domains; ↓: NPNXY conserved inner motif (IM); ▲: O-linked glycosylation sites; Transverse line: PINOID
phosphorylation conserved domains.
64 作 物 学 报 第 42卷


图 4 CsPIN3与其他植物 PIN氨基酸序列的系统进化分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of CsPIN3 and PIN in other species


图 5 CsPIN3蛋白的信号肽分析
Fig. 5 Signal peptide analysis of CsPIN3

2.3.3 CsPIN3 蛋白磷酸化和糖基化位点 蛋白
质的磷酸化和糖基化是对蛋白质的重要修饰, 可以
调节蛋白质的活力和功能。分别运用 NetPhos 2.0
Serve、DictyOGlyc 1.1 Server在线软件预测 CsPIN3
基因翻译后磷酸化、O-糖基化修饰情况, 结果显示
CsPIN3 蛋白有可能发生磷酸化修饰的位点有 35 个,
其中色氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)可能发
生磷酸化修饰的位点分别有 25、6、4个(图 8); 有可
能发生 O-糖基化修饰的位点有 2 个, 均为苏氨酸
(Thr), 分别在肽链的第 220、第 281 位(图 9)。糖基
化、磷酸化位点均集中分布在中间亲水区。

图 6 CsPIN3亲水性/疏水性预测
Fig. 6 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of CsPIN3

2.3.4 CsPIN3蛋白结构 运用 SOPAM预测蛋白
二级结构显示, CsPIN3蛋白含有 23.34%的 α-螺旋、
15.23%的延伸链和 48.52%的随机卷曲。经 SMART
在线查询后在 NCBI 上进行保守域分析表明, 茶树
CsPIN3蛋白第 331~356氨基酸、第 431~448氨基酸
位之间存在 2 个可变结构域, 将亲水区分割成 3 个
恒定区。CsPIN3蛋白在第 9~636氨基酸位之间是个
高度保守的结构功能域——生长素外运载体蛋白家
族 PIN的保守结构域, E值为 4.5e–184。此外, 在第
495~499氨基酸位置存在 CsPIN3蛋白 IM保守结构
第 1期 王 博等: 茶树生长素外运载体基因 CsPIN3的克隆与表达分析 65



图 7 CsPIN3蛋白跨膜区预测
Fig. 7 Prediction model of transmenbrane domain of CsPIN3 protein

图 8 CsPIN3蛋白氨基酸序列翻译后磷酸化修饰位点预测
Fig. 8 Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of CsPIN3 protein

图 9 CsPIN3蛋白氨基酸序列翻译后 O-糖基化修饰位点预测
Fig. 9 Prediction of O-glycosylation site modification in amino acid sequence of CsPIN3 protein

NPNXY, 在第 241、第 281氨基酸位点还存在着 PIN
蛋白特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PID/PINOID)磷
酸化活性位点——TPRXS(N/S)结构域。利用 SWISS-
MODEL Workspace软件在线预测 CsPIN3蛋白的三
维结构模型显示(图 10), CsPIN3 蛋白具有类似运输
载体的结构, 充分说明该基因确为茶树生长素外运
载体蛋白家族的一员。
2.4 组织表达特异性分析
图 11显示, CsPIN3在茶树的根、茎、叶片和花
中均有表达 , 但表达具有明显的组织差异性 ;
CsPIN3 在茶树花中的表达量最高, 在根中的表达量
最低, 在茎、叶中的表达量略高于根部, 在花中的表
达量是根中的 5倍左右。

图 10 CsPIN3蛋白三维结构模型
Fig. 10 Tertiary structure homology-modeling of CsPIN3
66 作 物 学 报 第 42卷


图 11 CsPIN3基因在茶树不同组织中的表达
Fig. 11 Expression of CsPIN3 gene in various tea plant organs

2.5 茶树顶芽发育不同时期 CsPIN3基因的表达
利用荧光定量 PCR 技术分析 CsPIN3 基因从秋
季茶树顶芽开始休眠到春季萌发期间不同时间点的
相对表达发现, 该基因在茶树顶芽休眠萌发的不同
时期均有表达, 且在萌发阶段的表达量高于休眠阶
段(休眠初期到膨大期之间)。与休眠初期相比, 随着
休眠程度的加深, 该基因的表达量维持在一个较低
的水平, 随着芽发育程度即茶树顶芽由生理休眠向
生态休眠继而向一芽一叶转变的过程中, CsPIN3 基
因的表达量持续上调, 到芽叶期表达量为休眠阶段
的 3 倍以上, 且在茶芽萌动过程中表达上调的速度
较明显(图12)。说明该基因与茶树越冬芽的休眠维持
与解除关系密切。

图 12 顶芽不同阶段 CsPIN3基因的相对表达量
Fig. 12 Relative expression of CsPIN3 gene at different stages of terminal buds
A: 1: 休眠初期(11月 2日); 2: 休眠期(12月 1日); 3: 深休眠期(1月 2日); 4: 膨大期(2月 14日); 5: 萌动期(3月 3日); 6: 鱼叶期(3月
14日); 7: 一芽一叶期(3月 27日)。B: 1: 休眠初期(11月 4日); 2: 休眠期(12月 2日); 3: 深休眠期(1月 5日); 4: 膨大期(2月 5日);
5: 萌动期(3月 3日); 6: 鱼叶期(3月 18日); 7: 一芽一叶期(3月 23日)。
A: 1: initial dormant stage (Nov. 2); 2: dormant stage (Dec. 1); 3: deep dormant stage (Jan. 2); 4: expanding stage (Feb. 14); 5: sprouting stage
(Mar. 3); 6: fish leaf stage (Mar. 14); 7: one leaf and a bud stage (Mar. 27). B: 1: initial dormant stage (Nov. 4); 2: dormant stage (Dec. 2); 3:
deep dormant stage (Jan. 5); 4: expanding stage (Feb. 5); 5: sprouting stage (Mar. 3); 6: fish leaf stage (Mar. 18); 7: one leaf and a bud stage
(Mar. 23).

3 讨论
生长素外运载体蛋白 PIN是生长素运输载体中最
为重要也是最先发现的一类, 为陆生植物所特有[29],
目前已经从多种植物上分离出 PIN 基因[13-16]。其中
拟南芥 PIN 蛋白家族是研究的最好的一类, 根据其
亲水环的长度分为两类, 亲水区较长的 PIN1、PIN2、
PIN3、PIN4、PIN7定位于质膜上, 负责向细胞外运
输生长素, 亲水区较短的 PIN5、PIN6、PIN8定位于内
质网上, 负责胞浆和内质网上的生长素调配[5,29-30]。
PIN3定位在茎芽内皮层细胞、重力响应根柱以及中
柱鞘细胞质膜上, 呈对称分布, 主要通过调节生长
素的再分配参与植物的向性生长如向光性、向地性
等。本研究从茶树中克隆的 CsPIN3 基因具有 PIN
基因的家族典型的序列特征。CsPIN3基因 cDNA序
列含有 1926 bp的完整开放阅读框(ORF), 编码氨基
酸数、蛋白质分子量、理论等电点等均与其他植物
的 PIN相似。CsPIN3蛋白与茄科植物的亲缘关系最
近, 与拟南芥 AtPIN3 从属一个分支。CsPIN3 基因
编码蛋白不存在信号肽 , 属于非分泌的水溶性蛋
白。CsPIN3蛋白在第 9~636氨基酸位之间是个高度
保守的结构功能域——生长素外运载体蛋白家族
PIN 的保守结构域, 该蛋白能够与生长素特定结合,
并能饱和分布于生长素运输细胞的基部[31]。同其他
植物的 PIN蛋白一样, CsPIN3是由两端的疏水区和
中间的亲水区构成, 亲水区较长。CsPIN3 N端疏水
区和 C端疏水区分别存在 5个和 4个跨膜螺旋, C端
疏水区跨膜螺旋数比拟南芥少 1个, 但与水稻结构一
致[32], C端疏水区较N端疏水区缺失部分序列, 反映
N端和 C端的跨膜结构对 PIN功能的重要性不同[33];
CsPIN3定位于质膜上, 与AtPIN3不同的是它在内质网
上也有少量的分布, 这与以往的一些研究一致[34]。多序
列比对显示, CsPIN3 编码的氨基酸序列与其他植物
第 1期 王 博等: 茶树生长素外运载体基因 CsPIN3的克隆与表达分析 67


的同源性较高, 具有 PIN典型的高度保守的NPNXY
内在构型, 即 IM结构域, 它调控 PIN蛋白的内吞作
用, 介导小泡分拣过程中膜蛋白与受体细胞的互作[35]。
磷酸化和去磷酸化是蛋白质一种重要的转录后修饰,
通过对氨基酸序列的磷酸化位点分析发现, CsPIN3
具有 PIN 蛋白特有的丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶
(PID/PINOID)磷酸化活性位点 TPRXS(N/S)结构域。
PID 对生长素与质膜、内质网之间的运输有重要作
用[36], 通过此位点, PID可以直接磷酸化 PIN蛋白的
中央亲水区调节 PIN 蛋白的极性定位进而调控生长
素的定向运输[37]。生长素也可以调节 PID蛋白的活
性, 当 PID 蛋白磷酸化 PIN 蛋白引起局部生长素浓
度升高时, 胞浆内钙离子增加, 钙离子信号调节的
钙结合蛋白(TOUCH3)及 PBPI (PINOID Bind Pro-
tein1)通过改变 PID 的活性使得 PIN 蛋白定位反转,
改变生长素的运输方向[38], 植物的向性生长及生长
发育中受拮抗剂、抑制剂的影响机制均是如此[39]。此
外 CsPIN3 还存在着 PP2A (Serine/Threo-nine Phos-
phatase 2A)磷酸酶的活性位点, 它能够调节 PIN 蛋
白的向顶、向基运输, 对 PID 蛋白诱导的 PIN 的极
性定位有拮抗的作用[36]。依据这些分析结果可以推
测本研究克隆的 CsPIN3 为茶树生长素外运载体基
因, 这为进一步研究生长素在茶树芽休眠解除中的
作用机制打下了坚实的基础。
通过对 CsPIN3 在茶树组织中的表达结果分析,
发现在茶树根、茎、叶和花 4 种组织器官中均能检
测到 CsPIN3基因的表达, 但表达具有组织特异性。
CsPIN3 在茶树根中的表达量相对较低, 花中的表达
量最高, 在茎、叶中的表达量居中。整体上, CsPIN3
基因在茶树中按形态学上端至形态学下端的顺序表
达量依次降低, 这与生长素的极性运输大体上是一
致的。研究表明, 花的开放受内源激素生长素的调
控[40]。尽管内源激素在开花过程中的分配及作用机
制还未证实, 但已有的研究表明, 在开花的初始阶
段, 生长素内向转运载体 Aux/IAA 的表达量升高,
并且参与生长素在植物花瓣中细胞间的运输, 促进
花的萌发[41]。在盛花期, 花是茶树生长发育比较活
跃的组织, 大量的生长素通过生长素外运载体基因
运出, 通过位于茎内皮层细胞的载体基因再运输到
茶树其他组织中。由此可见, 在茶树生长发育过程
中, 生长素外运载体基因参与的生长素极性运输发
挥了重要的作用。
在植物的生长发育过程中, 生长素参与其大多
数的生命活动, 与植物芽休眠也密切相关, 生长素
通过其运输载体介导的极性运输在植物组织或器官
中建立生长素的不对称分布, 进而在植物生长发育
过程中表现出广泛的生理效应。研究表明, 生长素
转运载体参与拟南芥芽萌发早期的生长发育[42]。因
此作为生长素外运载体 PIN家族的一员, CsPIN3可
能在茶树越冬芽的休眠与解除中发挥重要的作用。
在 2013—2014和 2014—2015年, 对龙井 43茶树芽
休眠的CsPIN3不同阶段的表达分析表明, CsPIN3在
顶芽萌发阶段的表达量高于休眠阶段(休眠初期到
膨大期之间), 休眠初期 CsPIN3 基因的表达量始终
维持在一个较低的水平, 随着芽的萌发CsPIN3基因
的表达量持续上调, 到芽叶期表达量为休眠阶段的
3 倍以上, 且在茶芽萌动过程中表达上调的速度较
明显, 与牡丹[43]、葡萄[44]上的研究结果类似。这可
能是因为在生理休眠阶段, 芽中各组织活动相对停
滞, 生长素内向转运载体的表达量较低, 萌发后芽中
各组织细胞恢复生长, 表达量快速升高。Nagar 等[45]
研究发现, 在茶树休眠芽中游离态的生长素含量较
低 , 在休眠解除后 , 游离态的生长素含量升高 , 结
合态的生长素则相反。这种结果与本研究所发现的
CsPIN3 基因表达结果相匹配。Medvedova 等[46]、
Balla等[47]研究发现, 芽中生长素的外运可以促进芽
的萌动。生长素的持续外运诱导 PIN基因的表达, 促
进 PIN 蛋白在芽中重新进行极性定位, 新的维管组
织将沿着 PIN 标记的生长素运输路径开始分化, 促
进芽的萌发, 因此芽的萌发伴随着 PIN 的表达, 这
与本研究结果一致。
游离态生长素的含量、CsPIN3基因的表达、茶
树休眠芽的萌发三者之间存在着密切的联系。芽休
眠时, 游离态生长素含量较低, CsPIN3 表达量也较
低, 萌发后游离态生长素含量增加, CsPIN3 表达量
也上调。这可能是由于芽休眠时, 游离生长素的含
量较低, 无法诱导 CsPIN3基因的表达, 但随着生长
素内向运输载体在深休眠时表达量的增高, 芽中游
离生长素通过不断的累积含量逐渐增加, 通过诱导
CsPIN3基因的表达以及诱发钙离子信号调节 PIN蛋
白的活性提高生长素的外运, 促进萌发。因此, 生长
素外运载体 CsPIN3 可能与茶树越冬芽休眠的维持
和解除有关系。
本研究克隆了茶树 CsPIN3 基因并研究了其在
茶树不同组织间的表达差异及芽休眠不同阶段的表
达模式, 探讨了生长素外运载体基因CsPIN3与茶树
68 作 物 学 报 第 42卷

越冬芽休眠解除的关系, 为深入揭示生长素调控越
冬芽休眠的分子机制提供了理论依据。但生长素运
输载体基因数量众多, 且参与生长素调控越冬芽休
眠解除的基因有很多, 如生长素响应因子 ARF、生
长素受体基因 TIR 等。因此, 下一步应将 PIN 与其
他基因结合起来, 从基因的功能及信号转导通路方
面深入揭示生长素调控茶树越冬芽休眠的作用机制。
4 结论
获得茶树生长素外运载体基因 CsPIN3 的全长
cDNA。CsPIN3编码蛋白具有 PIN家族的一般特性。
CsPIN3 编码蛋白是定位于质膜上的非分泌性蛋白,
由两端的疏水区和中间的亲水区构成, 疏水区内有
多个跨膜螺旋, 在亲水区存在 2个可变结构域, 还存
在着糖基化位点和磷酸化位点 TPRXS(N/S)结构以
及 IM 保守结构 NPNXY, 与茄科植物的 PIN3 亲缘
关系最近。CsPIN3 具有组织表达特异性, 在茶树越
冬芽萌发阶段的表达量高于休眠阶段(休眠初期到
膨大期之间), 且在茶芽萌动过程中表达上调的速度
较明显。该基因可能与茶树越冬芽的休眠维持与解
除有关。
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