全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(1): 63−71 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2012AA10A309)和国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2013ZX08002-002)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 马庆, E-mail: qingma66@163.com; 陈明, E-mail: chenming02@caas.cn
第一作者联系方式: E-mail: suruibo19@163.com, Tel: 010-82108750
Received(收稿日期): 2013-06-17; Accepted(接受日期): 2013-09-16; Published online(网络出版日期): 2013-10-22.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131022.1651.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00063
用核基质结合区(SAR)序列提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性
苏瑞波 1,2 陈 明 2,* 徐兆师 2 李连城 2 马 庆 1,* 马有志 2
1内蒙古农业大学农学院, 内蒙古呼和浩特 010018; 2 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部麦类生物学与遗传育种
重点实验室 / 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 采用最小表达框技术转化植物可以规避由骨架序列引起的安全风险。核基质结合区序列 SAR (scaffold at-
tachment region)可作为边界元件与核基质结合阻挡转基因片段邻近染色质区的作用与影响, 提高外源基因稳定性。
本研究在最小表达框序列两端添加 SAR 序列, 提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性, 提高转化基因的表达效
率。首先, 以GUS为目的基因构建带有 SAR序列的最小表达框, 以科农 199为受体进行基因枪转化, 同时以不加 SAR
序列的最小表达框片段为对照。带有 SAR序列的最小表达框片段共轰击 857个幼胚, T0代获得 40株再生植株, PCR
检测到 16株阳性植株, 转化效率为 1.87%; 对这 16个阳性单株进行 GUS染色, 15株显色; 从来自 4个 T0阳性植株
的 18 个 T1代植株中随机选取 18 株进行 PCR 和 GUS 染色检测, 有 15 株表现为阳性。不带 SAR序列的对照片段轰
击 1012个幼胚, 获得 31 株再生植株, 其中 5 株 PCR阳性, 转化效率 0.49%, 这 5 个阳性植株中仅 2株为 GUS 染色
阳性; 来自于 5 个 T0代 PCR 阳性株系的 10 个 T1代单株中没有发现 PCR 和 GUS 染色阳性株。表明 SAR 序列可以
提高基因枪转基因效率和目的基因表达稳定性。为了创制抗旱转基因小麦, 以来自大豆的抗旱相关转录因子基因
GmDREB3为目的基因, Bar基因为筛选标记基因, 转化受体小麦济麦 22, 共轰击 6045个幼胚, 获得再生植株 130株,
PCR检测阳性植株 30株, 转化效率为 0.50%; 随机选取 6株 PCR阳性植株进行 RT-PCR分析, 其中 5株可检测到外
源基因的转录。进一步对这 5 株 RT-PCR 阳性植株插入片段完整性进行分析, 其中 4 株插入片段基本完整。通过
real-time PCR 分析, 发现 T0代 6个 RT-PCR阳性植株的外源 GmDREB3的拷贝数为 1~3个。以上结果证明, 在最小
表达框两端加上 SAR序列后可以提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性。
关键词: SAR序列; 最小表达框转化法; DREB类基因; 基因枪转化法
Improvement of Minimal Gene Cassette Expression Stability by Scaffold At-
tachment Region (SAR) Sequence in Wheat Transformation
SU Rui-Bo 1,2, CHEN Ming 2,*, XU Zhao-Shi 2, LI Lian-Cheng 2, MA Qing1,*, and MA You-Zhi2
1Agriculture College, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic
Improvement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Science, Chinese
Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: The minimal expression cassette only containing the promoter, coding sequence and terminator sequence is transformed
into plants genome, which will reduce the security risks that may be caused by the vector skeleton sequence. Scaffold attachment
region (SAR) combining with the nuclear matrix to separate transformed DNA fragment with adjacent genome sequence, which
block the influence of the neighboring chromatins and improve the stability of exogenous gene. In this study, a new vector was
constructed with the minimal expression cassette flanked with SAR sequences. This vector was used in wheat transformation by
micro-particle bombardment aiming at improving stability of exogenous gene expression. GUS as a reporter gene was constructed
in the minimal expression cassette flanked with SAR sequences, and this DNA fragment was transformed into wheat variety
Kenong 199. At the same time, the fragment with the minimal expression cassette but without the SAR was used as a control. A
total of 857 immature embryos were bombarded using the minimal expression cassette with GUS and SAR sequences, and 40 T0
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plants were obtained, of which 16 plants were positive by PCR testing and 15 plants were positive by GUS staining. The trans-
formation efficiency was 1.87%. In the 18 individuals randomly selected from the T1 generation derived from four positive T0 plants,
15 plants showed positive reactions in PCR testing and GUS staining. In contrast, transformation efficiency of the control was only
0.49% (five PCR positive plants/1012 immature embryos), and only two PCR positive plants were confirmed by GUS staining. In 10
T1 plants of the control derived from five T0 PCR positive lines, no positive plant was identified by either PCR assay or GUS stain-
ing. Using this improved method, a new drought-related transcription factor gene GmDREB3 from soybean was transformed into
wheat receptor Jimai 22. A total of 130 T0 plants were obtained from 6045 immature embryos bombarded, of which 30 plants were
positive by PCR testing with transformation efficiency of 0.50%. Six positive plants were randomly selected for expression analysis,
and five showed GmDREB3 expression by RT-PCR assay. Integrality of inserted fragment in transgenic wheat genome was further
identified in the five plants by PCR assay, and four transgenic plants had amplified products similar to the fragment transformed.
Real-time PCR results showed 1–3 copies of GmDREB3 genes in the six positive T0 plants. These results indicate that the transforma-
tion stability is significantly improved by adding SAR sequences flanked with the minimal expression cassette.
Keywords: SAR sequence; Transformation with minimal expression cassette; DREB-like gene; Gene gun-mediated trans-
formation
基因枪转化法具有转化效率高、无宿主限制、
简单易操作等优点, 在小麦遗传转化中得到广泛应
用。传统的小麦基因枪转化法多以环形质粒 DNA转
化为主, 这种方法可能会导致载体骨架序列伴随目
的基因同时整合进植物基因组。转化中所使用的环
形质粒载体通常含有一些选择标记基因, 如抗生素
抗性基因。这些包含抗生素抗性基因的载体骨架序
列的整合, 给转基因植物带来了极大的安全隐患。
Barro等[1]和 Cannell等[2]分别对基因枪转化获得的 6
株转基因阳性植株进行 Southern-blot 分析, 发现这
些阳性植株的子二代中各有 3 株带有氨苄抗性基因
bla。此外, 载体骨架序列中会存在一些潜在的重组
热点序列, 引起外源基因不同程度的重排、断裂, 导
致遗传不稳定 [2]; 质粒的复制原点会促进复制介导
的基因重排[3]; 载体骨架序列中富含 A-T 的序列会
导致DNA片段的多聚化, 从而引起外源基因的多拷
贝插入[4]。
鉴于环状质粒的载体骨架序列在遗传转化中存
在的问题, Fu等[5]用包含启动子、编码框和终止子的
DNA 最小表达框轰击水稻愈伤组织并获得阳性植
株, Southern-blot结果显示转基因植株含 1~2个外源
基因拷贝, 转基因引起的重排反应频率较低。姚琴
等 [6]利用基因枪法进行小麦最小表达框转化, 虽获
得了阳性植株, 但没有进一步验证目标基因表达的
稳定性。目前用最小表达框转化法获得转基因小麦
的成功报道还很少, 我们也发现最小表达框转化法
转化小麦时存在转化基因表达稳定性差的问题。为
了推进该转化技术的应用, 提高转化基因的表达效
率及稳定性是关键。
核基质结合区 SAR (scaffold attachment region)
可作为DNA的边界元件与核基质结合, 使两个 SAR
之间的基因片段被界定成一个独立的染色质环状结
构, 从而阻挡邻近染色质区的作用与影响, 提高外
源基因的稳定性[7-8]。现已从真核蓝藻、酵母、动物、
植物及人类中分离出多种 SAR序列, 并对其功能进
行了验证。采用来自真核蓝藻 SAR序列构建的载体,
能够提高转基因的表达水平, 增强外源基因表达的
稳定性[8]。从酵母中扩增到 SAR 序列, 并在最小表
达框一端或两端加上 SAR序列, 采用基因枪法转化
烟草悬浮细胞, 结果加 SAR序列能提高目的基因的
表达, 而且两端加 SAR 序列比对照(无 SAR 序列的
最小表达框)目的基因的表达量高 20倍以上[9]。利用
来自烟草中的 SAR序列, 同样可以增强目的基因的
表达[10]。
本研究通过在最小表达框两端加 SAR序列, 改
进了小麦最小表达框转化技术。通过转化 GUS报告
基因比较了不加 SAR 序列的载体与加 SAR 载体的
转化效率及 GUS 基因的表达稳定性。并且采用加
SAR 序列的载体转化抗逆相关基因 GmDREB3, 通
过 PCR的方法鉴定转基因小麦中插入片段的完整性,
利用 real-time PCR方法估算转化基因的拷贝数。结
果证实我们改进的最小表达框转化技术可以提高小
麦基因枪转化效率, 提高目的基因在转基因小麦中
的表达效率及遗传稳定性, 且片段完整性良好。改
进的最小表达框转化技术为获得安全转基因小麦新
品种、新种质提供了新思路。
1 材料与方法
1.1 植物材料
烟草(Nicotiana tobacum cv. W38)种植于中国农
业科学院作物科学研究所人工气候温室。以科农 199
为受体的转 GUS 基因小麦和以济麦 22 为受体的转
GmDREB3 基因小麦种植于中国农业科学院作物科
学研究所可控温室。
第 1期 苏瑞波等: 用核基质结合区(SAR)序列提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性 65


1.2 最小表达框表达载体的构建
以烟草 W38基因组 DNA为模板, 设计引物(表
1)扩增 SAR序列, 反应条件为 94 5 min; 94 30 s, ℃ ℃
57 30 s, 72 2 min, ℃ ℃ 循环 35次; 72 10 min℃ 。分
别将 2 个 SAR 序列插入 pBluescriptSK 载体多克隆
位点的 5′和 3′端, 构建重组载体 pSAR12。用 Hind III
单酶切 pAHC25-GUS回收GUS基因全长片段, 插入
pSAR12构建表达载体 pSGUS (图 1)。为了转化抗逆
相关基因, 设计引物(表 1)扩增大豆转录因子基因
GmDREB3, 反应条件为 94 5 min; 94 30 s, 58 ℃ ℃ ℃
30 s, 72 50 s, ℃ 循环 35 次 ; 72 10 min℃ 。用
GmDREB3替换 pSGUS中的 GUS基因, 构建表达载
体 pSHGmDREB3。对构建完成的载体均进行酶切验
证和测序验证。

表 1 目的基因片段及其对应扩增引物序列
Table 1 Target gene fragment and its corresponding amplification primers
基因
Gene
引物
Primer
序列
Sequence (5′–3′)
用 途
Application
片段大小
Fragment size
(bp)
SAR1-F1 GGACTAGTTAAAAATCCCAATTATATTTGGTCT
(Spe I)
SAR
SAR1-R1 CCGATATCATTTTCAGAAGAAGTTCCCA
(EcoR V)
扩增 SAR1序列(目标序列 5′端)
Cloning SAR1 fragment (5′ end of
target sequence)
1190
SAR2-F2 CCATCGATTAAAAATCCCAATTATATTTGGTCT
(Cla I)
SAR
SAR2-R2 CCGTCGAGATTTTCAGAAGAAGTTCCCA
(Xho I)
扩增 SAR2序列(目标序列 3′端)
Cloning SAR2 fragment (3′ end of
target sequence)
1190
F-GUS ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAAC GUS
R-GUS TCATTGTTTGCCTCCCTGCTG
扩增 GUS基因全长序列
Cloning full length of GUS gene
1813
t-F-GUS ACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGG t-GUS
t-R-GSU AATACTCCACATCACCACGCT
扩增 GUS片段
Identification of part of GUS gene
380
DREB3-F1 CGAGCTCTCAGTGATGATGATGATGAT GmDREB3
DREB3-R1 GTTAACATGGCGAAACCCAGCA
扩增 GmDREB3全长序列
Cloning full length of GmDREB3
614
GmDREB3-F2 TAAGACTACCCAACAGCCGTCA t2-GmDREB3
GmDREB3-R2 GTAATCGGATGCGTAACCACTC
扩增 GmDREB3基因片段
Identification of part of GmDREB3
300
tGmDREB3F3 GAGGAGCATAGCGATTCCAA t3-GmDREB3
tGmDREB3R3 ATTTCGGATACCCATTTGCC
GmDREB3基因Real-time PCR引物
Real-time PCR assay of GmDREB3
100
doline-b-F1 AGATAGCACCACAATGTCGC puroindoline-b
doline-b-R1 AATACCTCACCTCGCCAAAT
内标基因 Real-time PCR引物
Real-time PCR assay of control gene
100
A1 SAR1-F1 TTAAAAATCCCAATTATATTTGGTCT
A2 SAR1-F2 TATTAACTTTAAATAATTGGTTGTACGA
B1 Ubiquitin-F ATATGCAGCAGCTATATGTGGATTT
C1 NOS-R CAACAGAAATTATATGATAATC
D1 SAR-R ATTTTCAGAAGAAGTTCCCA
插入片段完整性检测
Integrality analysis of fragments
inserted


1.3 基因枪法转化小麦
用 Spe I 和 Kpn I 双酶切 pSGUS 质粒和
pSHGmDREB3 质粒, 分别回收 6.6 kb 包含 SAR 序
列、启动子、GUS报告基因、终止子和 SAR序列的
线性片段和 5.8 kb包含 SAR序列、启动子、GmDREB3
基因、终止子和 SAR序列的线性片段(图 2); 用 EcoR I
单酶切 pAHC25-Bar质粒, 回收 2.89 kb包含启动子、
Bar筛选基因和终止子的线性片段; 用 Hind III单酶
切 pAHC25-GUS, 回收 4.3 kb包含启动子、GUS基
因、终止子的线性片段。将上述胶回收的线性片段
产物浓缩为 1 μg μL−1, −80℃储存备用。
将制备好的含 SAR序列和不含 SAR序列的GUS
线性片段和 GmDREB3 线性片段, 分别与不含 SAR
序列的 Bar基因线性片段按 1 1 (∶ V/V)混合制弹, 进
行基因枪共转化。其中 GUS基因转化的受体为科农
199, GmDREB3 基因转化的受体为济麦 22, 金粉用
量为每枪 45 μg, DNA用量为每枪 1 μg。轰击后将愈
伤组织在原培养基上培养 16~18 h, 转移到 SD培养
66 作 物 学 报 第 40卷



图 1 pSGUS表达载体构建
Fig. 1 pSGUS expression vector construction

图 2 pSGUS (A)和 pSHGmDREB3 (B)表达载体的结构
Fig. 2 Structure of pSGUS (A) and pSHGmDREB3 (B) vectors

基(MS培养基的无机盐成分中添加 VB1 1 mg L−1、
天门冬酰胺 150 mg L−1和 2,4-D 2.0 mg L−1)上恢复培
养 2 周。将恢复培养的愈伤组织再转移到筛选分化
培养基上培养至愈伤组织分化出幼苗, 将苗转移到
生根培养基上继续筛选 3 次。壮苗后, 待植株生长
到 15 cm 左右时移栽到花盆中, 在可控温室中培养
生长, 生长光照设置长日照为 16 h 光照/8 h 黑暗,
短日照为 10 h光照/14 h黑暗, 室温度设置为 18℃。
第 1期 苏瑞波等: 用核基质结合区(SAR)序列提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性 67


1.4 转 GUS基因小麦的验证
取转GUS基因的小麦单株叶片约 0.1 g, 采用植
物基因组 DNA 提取试剂盒(TIANGEN, 北京)提取
基因组 DNA, 并进行 GUS 基因的 PCR 检测。所用
检测引物为 t-GUS-F/R (表 1), 反应条件为 94℃
5 min; 94 30 s,℃ 57 30 s, 72 30 s, ℃ ℃ 循环 35次;
72 10 min℃ 。取 PCR检测为阳性的转基因植株的根、
胚乳、小花置于 GUS染色液, 在 37℃恒温箱中静置
8 h后用 75%酒精漂洗 5次, 用 VHX-600 (Japan)和
Nikon8700 (Japan)显微镜观察并照相。
1.5 转 GmDREB3 基因小麦的验证及插入片段
拷贝数分析
取 T0代转 GmDREB3 基因的小麦单株叶片(约
0.1 g)的基因组 DNA进行 GmDREB3基因 PCR检测,
检测引物为 GmDREB3-F2/R2 (表 1), PCR反应条件
为 94 5 min; 94 30 s, 56 30 s, 72 25 s, ℃ ℃ ℃ ℃ 循环
35次; 72 10 min℃ 。从 PCR检测为阳性的植株中随
机选取 6 株 , 按照植物总 RNA 提取试剂盒
(TIANGEN, 北京)的操作说明, 提取转基因阳性小
麦单株的总 RNA, 取 5 μg总 RNA反转录 cDNA第
一链。利用 RT-PCR的方法检测目的基因 GmDREB3
能否正常转录, 引物为 GmDREB3-F1/R1 (表 1), 反
应条件为 94 4 min; 94 30 s, 54 30 s, 72 ℃ ℃ ℃ ℃
50 s, 循环 35次; 72 10 min℃ 。为确认含 SAR序列
的 GmDREB3 基因最小表达框在小麦基因组中的插
入完整性, 将全长片段(5.3 kb)分为两段, 即 5′端-
SAR1+启动子(ubi)+GmDREB3和 3′端-GmDREB3基
因+NOS+SAR2, 对这两段分别进行扩增分析。用
A1/C1或 A2/C1引物(表 1和图 2-B)进行最小表达框
5′端完整性检测, 用 B1/D1 引物(表 1 和图 2-B)进行
最小表达框 3′端完整性检测。PCR反应条件为 94 ℃
8 min; 94 45 s, 55 30 s, 7℃ ℃ 2 3 min, ℃ 循环 35次;
72 10 min℃ 。
以小麦 puroindoline-b基因为内源参照基因, 利
用 real-time PCR方法[11]确定转基因阳性植株中外源
基因 GmDREB3 的拷贝数。目的基因检测用引物为
t3-GmDREB3 (表 1), 内标基因检测用引物为 puroin-
doline-b (表 1)。反应体系包括正反向引物各 0.5 μL、
10 μL 2×SuperReal PreMix Plus、1 μL 50×Rox Ref-
erence Dye (TIANGEN, 北京)、2 μL cDNA模板和 6
μL 无 RNase ddH2O。将配置好的 PCR 体系置 ABI
7500荧光定量 PCR仪上, PCR反应程序为 95 ℃ 15
min, 95 15 s, 60 20 s, 72 32 s, ℃ ℃ ℃ 共 40个循环。
2 结果与分析
2.1 pSGUS和 pSHGmDREB3载体构建
用 Kpn I和 Spe I双酶切 pSGUS表达载体, 可得
到 3.0 kb载体骨架片段和 6.6 kb目的片段(图 3-A),
结果表明 pSGUS 表达载体构建正确。用 Sac I 和
BamH I双酶切 pSGUS表达载体, 可得到 2.0 kb的
GUS基因片段和 7.6 kb载体骨架片段(图 3-B), 表明
pSGUS 表达载体结构正确 , 且可以通过 Sac I 和
BamH I 双酶切位点将 GUS 基因替换为 GmDREB3,
构建 pSHGmDREB3 表达载体。对 pSGUS 和
pSHGmDREB3 载体进行测序(结果未显示)验证, 比
对分析表明序列完全正确。
2.2 转 GUS基因小麦 PCR检测
将含 SAR序列的 GUS基因线性片段(pSGUS片
段)与不含 SAR 序列的 GUS 基因线性片段分别与
Bar基因线性片段共转化受体小麦科农 199, 经过筛
选后获得再生植株(图 4-A), 再经壮苗培养(图 4-B)
和移栽(图 3-C), 最终分别获得 40 株含 SAR 和 31
株不含 SAR 的再生植株。对 T0的转基因植株进行
PCR检测, 结果 31株不含 SAR的转 GUS再生植株
中, 5株为阳性, 进一步对来自这 5个 PCR阳性株系
的 10个 T1代单株进行 PCR检测, 未获得阳性植株;
而含 SAR的 40株 T0代再生植株中, PCR检测有 16
株阳性植株, 从来自其中 4 个随机植株的 18 个 T1
代单株中检测出 15株 PCR阳性植株(图 5和表 2)。
2.3 GUS基因表达稳定性
对 T0代 5株 PCR检测为阳性的 GUS基因(不含
SAR序列)植株进行 GUS染色, 2株呈阳性; 对来自
T0代 5个 PCR阳性株系的 10个 T1代单株进行 GUS

图 3 pSGUS重组质粒的酶切
Fig. 3 Digested vector of recombinant plasmid pSGUS
A: Kpn I和 Spe I双酶切 pSGUS表达载体。M1: marker DL10000;
1: pSGUS质粒经 Kpn I和 Spe I酶切; 2: pSGUS质粒; M2: marker
III。B: Sac I和 BamH I双酶切 pSGUS表达载体。M: marker III;
1~2: pSGUS质粒经 Sac I和 BamH I酶切; 3: pSGUS质粒。
A: Vector pSGUS digested by Kpn I and Spe I. M1: marker
DL10000; 1: pSGUS digested by Kpn I and Spe I; 2: pSGUS; M2:
marker III. B: Vector pSGUS digested by Sac I and BamH I. M:
marker III; 1–2: pSGUS digested by Sac I and BamH I; 3: pSGUS.
68 作 物 学 报 第 40卷



图 4 GUS和 pSGUS线性片段小麦转化过程
Fig. 4 The transformation process of pSGUS and GUS linear fragments
A: 培养; B: 壮苗; C: 移栽。A: regeneration seedlings; B: enhancing seedlings; C: transplanted seedlings.

图 5 T0代转 GUS和 pSGUS线性片段小麦 PCR检测结果
Fig. 5 Results of PCR detection of transgenic wheat plants transformed with GUS and pSGUS fragments
A: 转 GUS小麦 PCR检测结果。1~2: 阳性植株; 3: 阴性对照; 4: 受体; 5: 质粒对照; M: DL2000。B: 转 pSGUS小麦 PCR检测结果;
M: DL2000; 1~9阳性植株; 10: 阴性对照; 11: 受体; 12: 质粒对照。
A: PCR detection of GUS transgenic plants. 1–2: positive plants; 3: negative plant; 4: wild type; 5: plasmid control; M: DL2000. B: PCR
detection of pSGUS transgenic plants. M: DL2000; 1–9: positive plants; 10: negative plant; 11: wild type; 12: plasmid control.

表 2 T0代和 T1代转 GUS片段和 pSGUS片段小麦植株 PCR检测结果
Table 2 Testing results of T0 and T1 generation transgenic wheat plants transformed with GUS and pSGUS fragments
T0代 T0 generation T1代 T1 generation
片段
Fragment
轰击胚数
Embryo
bombarded
成活株
Survived
PCR阳性株
PCR positive
GUS阳性株
GUS positive
转化效率
Transformation
efficiency (%)
检测株数
Plants tested
PCR阳性株
PCR positive
GUS阳性株
GUS positive
阳性率
Positive
ratio (%)
GUS 1012 31 5 2 0.49 10 0 0 0
pSGUS 857 40 16 15 1.86 18 15 15 83.33
受体为科农 199。The recipient is Kenong 199.

染色, 未获得阳性植株。对含 SAR 序列的 T0代 16
株阳性植株进行GUS染色, 获得 15株阳性植株, 根
部染色结果表明染色部位主要集中在根的幼嫩组织
(图 6-A)。随机选取来自 T0代 4个 PCR阳性株系的
18个 T1代单株进行 GUS染色, 其中 15株为阳性植
株。小麦胚乳和小花的染色结果表明胚乳全部染成
蓝色 (图 6-B), 小花和颖壳基部均被染成蓝色 (图
6-C)。结果表明含 SAR序列的 GUS片段比不含 SAR
序列的 GUS 片段转化效率高, 而且含 SAR 序列的
GUS转基因小麦的遗传更加稳定。
2.4 转 GmDREB3 基因小麦 PCR 检测及插入片
段完整性检测
含 SAR 序列的 GmDREB3基因线性片段共轰
击6045个幼胚(济麦22), 获得130株再生植株 , PCR
检测获得30株阳性植株(图7-A), 转化率0.50%。随机
选取6株阳性植株进行 RT-PCR 分析 , 其中5株为
RT-PCR 阳性 (图7-B)。进一步分析 RT-PCR 呈阳
性的5个株系插入片段的完整性 , 引物 A1/C1未
检测到 5′端全长序列 , 引物 A2/C1 (A2引物距
SAR 序列起始位点200 bp)检测出4株中扩增出
3.6 kb 的线性片段 (图7-C)。用引物 B1/D1对这4
株扩增插入片段的3′端 , 均检测到2.1 kb 的线性
片段 (图7-D)。对5′端和3′端扩增出的线性片段测
序验证 , 结果经比对分析后均正确 , 表明插入
小麦基因组中的最小表达框的线性片段完整性
良好。插入片段完整性检测结果 (表3)显示 , 5′末
端 SAR 序列外侧有200 bp 的缺失 , 但不影响目
的基因的稳定表达。
第 1期 苏瑞波等: 用核基质结合区(SAR)序列提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性 69



图 6 转 pSGUS片段小麦不同部位不同时期 GUS报告基因表达检测结果
Fig. 6 Staining results of GUS reporter gene in different parts or at different stages of pSGUS transgenic wheat plants
A: T0代转基因小麦根部染色; B: T1代转基因小麦胚乳染色; C: T1代转基因小麦小花染色。
A: root staining of T0 plants; B: endosperm staining of T1 plants; C: flowers staining of T1 plants.

图 7 转 GmDREB3基因小麦分子检测结果
Fig. 7 Molecular detection results of GmDREB3 transgenic wheat
A: PCR检测。M: DL2000; 1~6: 阳性株系; 7: 水对照; 8: 受体对照; 9: 质粒对照。B: RT-PCR检测。M: DL2000; 1~5: 阳性株系; 6: 水
对照; 7: 受体对照; 8: 质粒对照。C: 插入片段 5′端完整性检测。M: marker III; 1~4: 阳性株系; 5: 水对照; 6: 受体对照; 7: 质粒对照。
D: 插入片段 3′端完整性检测。M: marker III; 1~4: 阳性株系; 5: 水对照; 6: 受体对照; 7: 质粒对照。
A: PCR result. M: DL2000; 1–6: positive lines; 7: water control; 8: Jimai 22; 9: plasmid control. B: RT-PCR result. M: DL2000; 1–5: positive
lines; 6: water control; 7: Jimai 22; 8: plasmid control. C: PCR result of 5′ terminal 5′ insertion fragment. M: Marker III; 1–4: positive lines;
5: water control; 6: Jimai 22; 7: plasmid control. D: PCR result of 3′ terminal of insertion fragment. M: marker III; 1–4: positive lines;
5: water control; 6: Jimai 22; 7: plasmid control.

表 3 转 GmDREB3小麦插入片段完整性检测结果
Table 3 Test of inserting fragments in GmDREB3 transgenic plants
检测插入片段位置
Location identified of
insertion fragment
引物对
Primer pair
片段大小
Length of fragment
(bp)
检测植株
Plants identified
阳性植株
Number of
positive plants
阳性率
Positive ratio
(%)
5′ end A1/C1 3800 5 0 0
5′ end A2/C1 3600 5 4 80
3′ end B1/D1 2100 5 4 80

2.5 Real-time PCR确定转 GmDREB3基因小麦
的拷贝数
利用定量 PCR 的方法确定转 GmDREB3基因小
麦的拷贝数, 目的基因 GmDREB3的标准曲线相关
性较高(图8), 起始模板数的对数值(lg C0,GmDREB3)与
Ct值之间的相关方程为 Ct = −3.35 × lg C0,GmDREB3
70 作 物 学 报 第 40卷


31.60。内标基因 puroindoline-b 的标准曲线(图8)R2
高达0.9879, 起始模板数的对数值(lg C0,pur)与 Ct 值
之间的相关方程为 Ct = −3.15 × log C0,pur + 32.09。选
取6株阳性植株提取基因组 DNA, 进行定量 PCR 分
析。将获得的 GmDREB3和 puroindoline-b的 Ct值(表
5)及各自标准曲线的斜率(S)和截距(I)代入方程
GmDREB3 GmDREB3 GmDREB3 pur pur pur[( t )/ ] [( t )/ ]
0,GmDREB3 0,pur/ 10
C I S C I SC C − − −=
计算出样品起始模板数的比值 [11]。由于小麦中
puroindoline-b 基因为 2 拷贝, 用 GmDREB3 起始模
板数与 puroindoline-b 起始模板数的比值乘以 2, 得
到转基因植株中目的基因 GmDREB3 的拷贝数。结
果显示, 转 GmDREB3基因的 6个株系中, 目的基因
的拷贝数为 1~3 (表 4)。

图 8 GmDREB3基因和 puroindoline-b基因的标准曲线
Fig. 8 Standard curves of GmDREB3 and puroindoline-b genes
Ct: 阈值循环数; lg C0: 起始模板浓度对数。
Ct: Threshold value of cycle number; lg C0: Logarithm value of
initial template concentration.

表 4 GmDREB3和 puroindoline-b基因的 Ct值及 GmDREB3 基因拷贝数估算
Table 4 Ct values of GmDREB3 and puroindoline-b genes and estimation of copy number of GmDREB3 gene in transgenic lines
Ct值 Ct value 转基因株系
Transgenic line GmDREB3 puroindoline-b
2× GmC0/ PurC0
目的基因拷贝数
Copy number of GmDREB3
M6-1 21.06±0.43 22.40±0.12 2.34±0.14 2
M6-2 20.57±0.31 21.36±0.14 1.53±0.16 1–2
M6-3 20.80±0.23 21.31±0.25 1.26±0.14 1
M6-4 22.37±0.49 23.97±0.45 3.00±0.18 3
M6-5 20.58±0.50 21.74±0.28 2.03±0.15 2
M6-6 17.29±0.58 16.63±0.29 0.46±0.19 0–1
表中数据为 3次生物学重复的统计值。The copy number assay of transformed genes in transgenic wheat was completed by three times repeats.

3 讨论
随着转基因植物产业化的发展, 人们对转基因
作物的安全性更加关注, Fu等[5]成功地用含目的基
因的线性表达框转化水稻, 获得了不含载体骨架序
列的转基因植株。Nguyen 等[12]共转化 CRY1AC 基
因、GNA 基因和标记基因 hpt 的线性表达框, 发现
与转化环状质粒对照的转基因植株相比, 转化线性
表达框的转基因植株可以积累更多的目标蛋白, 但
二者在效率上没有显著差异。Fu等[5]和 Nguyen等[12]
都发现 , 转化线性表达框的转基因植株都含有1~2
个目的基因拷贝 , 基因重排现象发生较少。Wang
等[8]利用电击法将含 SAR序列的 CAT基因环形质粒
转化到藻类细胞中, 阳性克隆中 CAT的表达水平比
不含 SAR 序列的克隆提高4.5倍, 且 CAT 表达水平
的提高并不依赖于 CAT 基因拷贝数的升高。Vain
等 [13]分析转 GUS 质粒 T0和 T1代阳性植株中 GUS
的表达活性, 发现含 SAR 序列的转基因水稻植株中,
GUS的表达更稳定, 这也说明 SAR序列可以提高环
形质粒转基因植株中目的基因的表达稳定性。本研
究发现, 含 SAR 序列的 GUS 基因线性表达框在 T0
代的转化率为1.86%, 高于0.49%的不含 SAR序列的
T0代转化率(表2)。跟踪检测 T1代 GUS 的表达活性,
发现不含 SAR 序列的阳性植株均检测不到 GUS 基
因的表达活性, 含 SAR 序列阳性植株在 T1代仍有
83.33%植株显示为 GUS 阳性(表2和图6)。这表明
SAR 序列不仅可以提高基因枪法的转化率, 也可以
提高最小表达框转基因阳性植株中目的基因的稳定
表达。前人研究认为2个 SAR 之间可以形成位置效
应, 提高目的基因表达的稳定性[7]。针对这个特性在
最小表达框两端分别加上 SAR序列, 可以阻止邻近
染色质区的顺式调控元件对环内基因影响, 而提高
目的基因的稳定。这种结构可以克服植物基因组对
外来基因的影响, 因为 SAR使外源基因形成独立的
转录单位, 使其不受周围基因的影响, 避免位置效
应引起的基因失活[14-15]。van der Geest 等[16]发现,
SAR能提高转基因烟草植株中目的基因的总表达水
平, 同时可以降低转基因系间的差异, 而基因枪转
化时, 转基因在受体中常以多拷贝形式存在, 整合
模式较为复杂 , 更易导致转基因同源依赖性沉默 ,
第 1期 苏瑞波等: 用核基质结合区(SAR)序列提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性 71


SAR有可能通过减弱基因沉默所造成的负影响来提
高转基因的表达效率, 促进目的基因的稳定遗传和
稳定表达。鉴于 SAR序列在植物遗传转化中的优点,
本研究将含 SAR序列的 GmDREB3基因转化到济麦
22中, 分析 T1代阳性植株中目的基因 GmDREB3的
转录水平和其线性表达框的完整性, 发现阳性植株
中 GmDREB3均可以正常转录, 且除线性表达框5′末
端的200 bp 丢失外, 其余序列均完整存在。分析转
GmDREB3基因阳性植株的拷贝数 , 发现阳性植株
均为1~3个拷贝(表4)。此结果证明如果采用不带有
SAR 序列的线性表达框进行基因枪转化, 线性表达
框两端的序列可能会在转化过程中受到损伤, 这种
损伤可能会影响转化片段的基因表达及遗传稳定性,
这可能就是我们转化不带有 SAR 序列的 GUS 表达
框比转化带有 SAR 序列的表达框的遗传稳定性差
的原因, 同时, 带有 SAR序列的 GUS最小表达框转
化效率高于不带有 SAR 序列的表达框转化效率可能
也与线性表达框的缺失相关, 具体的原因需要进一步
鉴定。Allen等[17]发现, 烟草的SAR序列与酵母的SAR
序列相比, 具有更强的结合核基质的亲和力。本研究
中选取的是烟草的 SAR 序列, 是否存在更好的 SAR
序列资源, 需进一步研究。
4 结论
以科农 199为受体, 与不带有 SAR序列的最小
表达框比较, 加 SAR序列的最小表达框 pSGUS转化
效率明显高, 并且所转化线性片段中 GUS基因可以
稳定遗传和表达。以大豆抗旱基因 GmDREB3 为目
的基因进行转化, 分子检测结果表明目的基因可以
稳定表达, 而且插入片段基本完整, 转 GmDREB3 基
因株系含有较低拷贝数(1~3 个)。因而认为改进的最
小表达框转化技术与原技术相比可以提高小麦基因
枪法转化效率, 减少目的基因的拷贝数, 提高目的基
因表达和遗传的稳定性, 增加插入片段的完整性。
References
[1] Barro F, Cannell M, Lazzeri P, Barcelo P. The influence of auxins
on transformation of wheat and Tritordeum and analysis of trans-
gene integration patterns in transformants. Theor Appl Genet,
1998, 97: 684–695
[2] Cannell M, Doherty A, Lazzeri P, Barcelo P. A population of
wheat and Tritordeum transformants showing a high degree of
marker gene stability and heritability. Theor Appl Genet, 1999,
99: 772–784
[3] Linden R M, Winocour E, Berns K I. The recombination signals
for adeno-associated virus site-specific integration. Proc Natl
Acad Sci USA, 1996, 93: 7966–7972
[4] Müller A E, Kamisugi Y, Grüneberg R, Niedenhof I, Hörold R J,
Meyer P. Palindromic sequences and A+T-rich DNA elements
promote illegitimate recombination in Nicotiana tabacum. J Mol
Biol, 1999, 291: 29–46
[5] Fu X, Duc L T, Fontana S, Bong B B, Tinjuangjun P, Sudhakar D,
Twyman R M, Christou P, Kohli A. Linear transgene constructs
lacking vector backbone sequences generate low-copy-number
transgenic plants with simple integration patterns. Transgenic Res,
2000, 9: 11–19
[6] 姚琴, 丛玲, 汪越胜, 陈明洁, 杨广笑, 何光源. 无载体框架
序列转基因小麦中外源基因表达框的遗传分析. 遗传, 2006,
28: 695–698
Yao Q, Cong L, Wang Y S, Chen M J, Yang G X, He G Y. Inheri-
tance of the foreign gene 1Ax 1 in transgenic wheat (Triticum
aestivum L.) with gene cassettes lacking vector backbone se-
quences. Hereditas (Beijing), 2006, 28: 695–698 (in Chinese
with English abstract)
[7] 王天云, 袁保梅, 薛乐勋. 核基质结合区与转基因沉默. 生物
学通报, 2004, 39(12): 15–17
Wang T Y, Yuan B M, Xue L X. Scaffold attachment region and
Transgene Silence. Bull Biol, 2004, 39(12): 15–17 (in Chinese)
[8] Wang T, Xue L, Hou W, Yang B, Chai Y, Ji X, Wang Y. Increased
expression of transgene in stably transformed cells of Dunaliella
salina by matrix attachment regions. Appl Microbiol Biotechnol,
2007, 76: 651–657
[9] Allen G C, Hall G E, Childs L C, Weissinger A K, Spiker S,
Thompson W F. Scaffold attachment regions increase reporter
gene expression in stably transformed plant cells. Plant Cell,
1993, 5: 603–613
[10] Breyne P, Van Montagu M, Depicker N, Gheysen G. Characteri-
zation of a plant scaffold attachment region in a DNA fragment
that normalizes transgene expression in tobacco. Plant Cell, 1992,
4: 463–471
[11] Weng H, Pan A, Yang L, Zhang C, Liu Z, Zhang D. Estimating
number of transgene copies in transgenic rapeseed by real-time
PCR assay with HMG I/Y as an endogenous reference gene.
Plant Mol Biol Rep, 2004, 22: 289–300
[12] Thi Loc N, Tinjuangjun P, Gatehouse A M, Christou P, Gatehouse
J A. Linear transgene constructs lacking vector backbone se-
quences generate transgenic rice plants which accumulate higher
levels of proteins conferring insect resistance. Mol Breed, 2002, 9:
231–244
[13] Vain P, Worland B, Kohli A, Snape J W, Christou P, Allen G C,
Thompson W F. Matrix attachment regions increase transgene
expression levels and stability in transgenic rice plants and their
progeny. Plant J, 1999, 18: 233–242
[14] Spiker S, Thompson W F. Nuclear matrix attachment regions and
transgene expression in plants. Plant Physiol, 1996, 110: 15–21
[15] Holmes-Davis R, Comai L. Nuclear matrix attachment regions
and plant gene expression. Trends Plant Sci, 1998, 3: 91–97
[16] van der Geest A H M, Hall G E Jr, Spiker S, Hall T C. The
β-phaseolin gene is flanked by matrix attachment regions. Plant J,
1994, 6: 413–423
[17] Allen G C, Hall G, Michalowski S, Newman W, Spiker S,
Weissinger A K, Thompson W F. High-level transgene expression
in plant cells: effects of a strong scaffold attachment region from
tobacco. Plant Cell, 1996, 8: 899–913