全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(6): 979−991 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由北京市自然科学基金项目(6103025), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-09)和国家公益性行业(农业)科研专项
(nyhyzx07-017)资助。
∗ 通讯作者(Corresponding author): 程须珍, E-mail: chengxz@caas.net.cn, Tel: 010-62180535
第一作者联系方式: E-mail: liuyan9611@163.com
Received(收稿日期): 2012-11-16; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期): 2013-04-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130409.1437.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00979
基于叶绿体 DNA序列的 Ceratotropis亚属遗传进化研究
刘 岩 程须珍* 王丽侠 王素华 白 鹏
中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 作为 Ceratotropis 亚属起源中心之一, 中国有丰富的 Ceratotropis 亚属种质资源, 但种间遗传进化研究相对
落后。为探索该亚属各种间的亲缘关系及遗传演化规律, 对 Ceratotropis 亚属 18 个种及亚种共 110 份材料的叶绿体
基因组 2 个内含子(rpl16、rps16)和 3 个基因(psbA-trnH、rpoB-trnC 和 trnL-trnF)的间隔区序列进行了研究。结果表
明, 各序列的信息位点百分率在 3.63%~24.28%之间, 其中 rps16最高, rpoB-trnC最低。序列拼接的 Kimura进化距离
分析发现, 各种间进化距离介于 0~0.057 之间, V. minima 复合体(V. minima、V. riukinensis 和 V. nakashime)和 V.
subramaniana 的进化距离最大。基于单个序列, 利用 MEGA5.1 和 PAUP4.0 软件构建的邻接树和最大简约树的结果
均将 Ceratotropis 亚属 18 个种及亚种划分为 2 个大支, 其中第 I 类包含 9 个种和亚种, 为 3 个组(Angulares、
Ceratotropis和 Aconitifoliae)的混合体, 第 II类也包含 9个种和亚种, 全部属于 Angulares组。系统发育树的分化同质
性检验表明其拓扑一致性较高(P=0.87)。psbA-trnH 等 5 个序列的分子系统进化研究对阐明 Ceratotropis 亚属种间亲
缘关系和系统演化具有重要的理论和现实意义。
关键词: Ceratotropis亚属; 叶绿体 DNA; 序列差异; 遗传进化
Genetic Evolution for Vigna Subgenus Ceratotropis Based on Chloroplast DNA
Sequences
LIU Yan, CHENG Xu-Zhen∗, WANG Li-Xia, WANG Su-Hua, and BAI Peng
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: China has abundant germplasm resources of subgenus Ceratotropis, but the related study of species within this subge-
nus is much lagged. In order to investigate genetic relationship and evolution process among different species, 110 entries of
Ceratotropis were analyzed by using intron rpl16, rps16 and intergenic regions psbA-trnH, rpoB-trnC, and trnL-trnF of chloro-
plast genome. The results revealed that parsim-info site percentage was from 3.63% to 24.28%, with the highest for rps16 and the
lowest for rpoB-trnC. A higher level conservation of sequence was observed within species than inter-species. Kimura-2-parameter
distance was between 0 and 0.057 calculated based on five chloroplastassembling sequences. V. minima complex (including V.
minima, V. riukinensis, and V. nakashime) and V. subramaniana had the longest distance. Phylogenetic trees constructed by
neighbor-joining (NJ) and maximum parsimony (MP) methods in MEGA 5.1 and PAUP 4.0 revealed that eighteen species and
subspecies were divided into two branches. The groupIcontained nine species and subspecies grouped into three sections complex,
including Angulares, Ceratotropis and Aconitifoliae. The group II contained nine species and subspecies which completely be-
longed to section Angulares. Partition homogeneity test of phylogenetic trees of the five sequences showed that their topology was
highly consistent (P=0.87). The present study provides the important information for clarifying genetic relationship among differ-
ent species within Ceratotropis.
Keywords: Subgenus Ceratotropis; Chloroplas DNA; Sequence difference; Genetic evolution
豇豆属是广泛分布于热带和亚热带地区的豆类
家族 , 属于豆科 (Leguminosae)菜豆族 (Phaseoleae),
共包括 7个亚属[1], 其中只有 Ceratotropis亚属起源
于亚洲, 故又称其为亚洲豇豆亚属。根据形态特征,
980 作 物 学 报 第 39卷

Ceratotropis亚属分为 3个组(Angulares、Ceratotropis
和 Aconitifoliae)[2], 共包括 5 个栽培种和 16 个野生
种, 其中有 8 种具有食用、饲料和绿肥的用途[3-4]。
Ceratotropis亚属的各豆种除 Vigna reflexo-pilosa是
四倍体(2n=44, 4x)外, 其他都是二倍体(2n=22, 2x),
是一个形态同类和高度特化的分类组群[5]。
近年来, 日本、泰国和印度等国家对 Ceratotropis
亚属进行了相关系统学研究, 从最初的形态学分类[6]
到后来 RFLP[7]、RAPD[8]和 AFLP[9-10]等分子标记技术
的运用, 初步探讨了 Ceratotropis 亚属的亲缘关系。
Tomooka 等[10]利用 AFLP 方法研究指出 Ceratotropis
亚属 Angulares组内的大部分种具有较低的遗传变异
水平。Doi等[11]利用 ITS序列所得系统分类学结果与
基于形态学所分 3 个组结论相一致。中国作为
Ceratotropis 亚属的起源中心之一 , 有着丰富的
Ceratotropis 亚属种质资源, 但在遗传进化方面的研
究还比较落后, 仅仅局限于几个栽培种, 如绿豆种[12]
(V. radiata), 小豆种[13](V. angularis), 还未系统进行
亚属野生近缘种亲缘关系和起源演化方向研究。
DNA 序列分析是在 DNA 一级结构水平上检测
遗传多样性的分子标记技术, 以研究和揭示植物系
统与进化的分子规律[14]。DNA序列分析是区分个体
间遗传差异的最直接方法, 可提供基因组特异区的
完全遗传信息。叶绿体 DNA属母性遗传, 与核基因
组相比, 具有分子量小、结构简单、突变率较低、
遗传稳定等特点[15-17]。叶绿体 DNA序列片段的非编
码区 , 由于受环境选择压力小 , 进化速率快 , 具有
相对较高的核苷酸替换率, 常被用于探讨种间或种
内的亲缘关系和鉴定的研究[18]。
随着大量适用于各级分类阶元的叶绿体通用引
物的发现, 叶绿体基因组序列研究在梨属[19]、锦鸡
儿属[20]、石蒜属[21]以及水稻[22]和柑橘[23]等各类植物
中都得到了广泛的应用。本研究选取适用于种间或
属内组间分类阶元的 5 个叶绿体非编码区, 包括叶
绿体内含子 rpl16、rps16以及基因间隔区 psbA-trnH、
rpoB-trnC和 trnL-trnF序列, 对 Ceratotropis亚属各
近缘种进行序列分析, 旨在从分子进化层面了解该
亚属各近缘种间的亲缘关系, 为进一步探讨其遗传
演化机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
从国家种质库按照省份随机选取 20 份, 从河
北、山东、辽宁、北京等省(直辖市)野外采集 43 份
以及从印度、泰国、俄罗斯和澳大利亚等国引进 47
份, 共计 110 份材料(见附表), 包含 Ceratotropis 亚
属的 15个种和 3个亚种。
1.2 DNA提取
从每份材料各取 3 粒于温室内种植 , 出苗后
10~15 d 取其幼嫩叶片, 采用改良的 CTAB 法提取
DNA[24]。用 NanoDrop2000/2000C 微量分光光度计
检测 DNA 质量和浓度, 并根据检测结果将 DNA 样
品的浓度调至 25 ng μL–1。
1.3 PCR扩增及测序
通用引物的名称、序列及文献来源见表 1。引
物均由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR 扩增
体系为 25 μL, 其中含基因组 DNA 稀释液 2.5 μL,
1×Taq buffer (20 mmol L–1 Tris-HCl, pH 8.8, 10 mmol
L–1 KCl, 10 mmol L–1 (NH4)2SO4, 1.5 mmol L–1 MgCl2,
0.1%Triton X-100), 4 mmol L–1 dNTPs, 上下游引物
各 4 μmol L–1和 0.75 U Taq DNA聚合酶。反应程序
为 94℃预变性 5 min, 94℃变性 1 min, 54℃退火 45 s,
72℃延伸 1 min, 进行 35个循环, 最后 72℃延伸 10
min。整个反应在东胜 EDC-810 PCR扩增仪上进行。
PCR 产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳及 OMEGA 试剂
盒纯化后送于中国农业科学院作物科学研究所重大
科学工程楼测序部, 用ABI公司的全自动DNA测序
仪(3730XL)测序。

表1 引物名称、序列及文献来源
Table 1 Code and sequences of primers and the related references
扩增序列
Amplified sequence
引物名称
Primer name
引物序列
Primers (5′–3′)
文献来源
Reference source
F: GTTATGCATGAACGTAATGCTC McKenzie et al., 2006[25] psbA-trnH psbA-F
trnH-R R: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC McKenzie et al., 2006[25]
F: CKACAAAAYCCYTCRAATTG Shaw et al., 2005[26] rpoB-trnC rpoB-F
trnC-R R: CACCCRGATTYGAAGTGGGG Shaw et al., 2005[26]
F: CGAAATCGGTAGACGCTACG Taberlet et al., 1991[27] trnL-trnF c
f R: ATTTGAACTGGTGACACGAG Taberlet et al., 1991[27]
rpl16 rpl16-F71
rpl16-R1516
F: GCTATGCTTAGTGTGTGACTCGTTG
R: CCCTTCATTCTTCCTCTATGTTG
Jordan et al., 1996[28]
Jordan et al., 1996[28]
rps16 rps16-F
rps16-2R
F: GTGGTAGAAAGCAACGTGCGACTT
R: TCGGGATCGAACATCAATTGCAAC
Mckenzie et al., 2006[25]
Mckenzie et al., 2006[25]
第 6期 刘 岩等: 基于叶绿体 DNA序列的 Ceratotropis亚属遗传进化研究 981


1.4 序列及系统发育分析
以 Seqman软件(http://www.dnastar.com/)拼接测
序获得的两段 5′至 3′碱基序列, 手工校对个别位点。
将 110 份材料的 5 段序列测序、拼接完后, 再将每
份材料按照 psbA-trnH、rpoB-trnC、trnL-trnF、rpl16
和 rps16的顺序连接成一段序列。用 BioEdit[29]软件
中的 ClustalW多重比对功能对其进行序列比对。用
MEGA 5.1[30]软件基于 Kimura-2 参数计算序列间进
化距离, 并构建 5个序列的 NJ (Neighbor-joining)分
子系统树。对于由序列长度多态性所造成的空位
(gap), 在运算中处理为缺失 (missing)状态 , 以
BootStrap (1000次重复)检验各分支置信度[31]。同时,
利用 PAUP 4.0 版 beta 10[32], 通过最简约法
(maximum parsimony)及启发式搜索(heuristic search)
策略, 100次重复的随机加入(random addition of 100
replicates), ACCTRAN 优化构建 5 个序列的最大简
约树。通过一致性指数(CI)和保持性指数(RI)评价最
简约分支图的可靠性, CI值和 RI值越大, 分支图的
可靠性越大[33]。而后, 通过分化同质性检验(partition
homogeneity test)对依据 psbA-trnH等 5个序列所构
建的简约树的拓扑一致性进行评价 [34], 检测进行
1000 次重复, 在系统发育树间无显著冲突的前提下
对五序列拼接数据再进行系统发育分析。
2 结果与分析
2.1 序列特征
psbA-trnH等 5序列在各材料间显示了一定的长
度差异, rps16序列长度差异最大(436~580 bp), 相差
144 个碱基序列; rpl16 的序列长度差异最小(654~
675 bp), 相差 21个碱基序列。5种序列的 GC含量
都不超过 30%, 这与叶绿体 GC 含量低的特点相吻
合。rps16内含子序列提供的信息(24.28%)以及转换
颠换数远高于其他 4个序列, rpoB-trnC基因间隔序
列提供的信息(3.63%)最少(表 2)。
2.2 种内碱基序列变异位点分析
对取样数大于 1 的 Ceratotropis亚属 17 个种及
亚种进行种内碱基序列变异位点的比较分析发现 ,
大多数种及亚种在 5 个叶绿体序列内都显示了较高
的种内序列保守性, 种内碱基序列变异位点数均为
0, 少部分种内差异表现为在某个序列处有 1 个或 2
个碱基突变, 只有 V. nipponensis和 V. sublobata在 5
个叶绿体序列内存在较多的变异位点(表 3)。同时, 5
个叶绿体序列比较发现, psbA-trnH 序列在 V. nip-
ponensis、V. umbellata 等 6 个种内存在变异位点,
rpoB-trnC和 rps16序列分别在 5个种内存在变异位
点, rpl16序列在 V. nipponensis、V. umbellata等 4个
种内存在变异位点, 而 trnL-trnF 序列仅在 V. nip-
ponensis 种内存在变异位点, 显示了该序列高度的
种内序列保守性。
2.3 种内种间序列长度差异
2.3.1 种内序列长度差异 对 Ceratotropis 亚属
18 个种及亚种的种内序列长度比较分析发现, 大多
数种及亚种在 psbA-trnH 等 5 个叶绿体序列内的种
内序列长度基本一致(表 4)。有些物种在某个叶绿体
序列处可能会有 1~2 个的序列长度差异, 但是比较
特别的是, 6 份 V. nipponensis 种材料在序列 psbA-
trnH 处存在 7 个碱基的长度差异, 来自中国的 3 份
材料在该序列 304~310 bp之间存在 AATTTAA7个
碱基, 来自日本和澳大利亚的 3 份材料在该位置处
存在缺失现象(图 1-A)。
2.3.2 种间序列长度差异 对于叶绿体 psbA-
trnH 序列, 各种间的序列长度有较大差异, 且主要
集中在序列 228~255 bp 之间(图 1-B), 4 个种(V.
minima、V. hirtella、V. nakashime和V. dalzelliana) 存
在该段碱基序列; 5个种[V. angularis、V. angularis
(weedy)、V. nipponensis、V. umbellata和 V. hirtella]
及亚种缺失该段序列 7个碱基 TATAAAG; 8个种(V.
reflexo-pilosa、V. trinervia、V. radiata、V. sublobata、

表 2 DNA序列特征
Table 2 DNA sequence characteristics
序列名称
Sequence
name
长度范围
Length
rage (bp)
排列序列
长度
Sequence
length (bp)
G+C含量
G+C con-
tent (%)
变异位点数
No. of vari-
able site
信息位点数
No. of in-
formative
site
变异位点
百分率
Variable site
content (%)
信息位点
百分率
Informative site
content (%)
转换数
No. of
transitions
颠换数
No. of tran-
versions
psbA-trnH 340–378 423 29.0 28 19 6.62 4.49 2 3
rpoB-trnC 1022–1053 1074 26.7 48 39 4.47 3.63 1 7
trnL-trnF 895–970 973 28.1 55 46 5.65 4.73 2 10
rpl16 654–675 677 26.9 35 29 5.17 4.28 0 7
rps16 436-580 593 29.6 151 144 25.46 24.28 24 28
982 作 物 学 报 第 39卷

表 3 种内碱基序列变异位点数
Table 3 Number of variable sites of intra-species sequence
种内碱基序列变异位点数 No. of variable sites of intra-species sequence 种名
Species
材料数
No. of materials psbA-trnH rpoB-trnC trnL-trnF rpl16 rps16
V. angularis 16 0 0 0 0 0
V. angularis(weedy) 12 0 0 0 1 0
V. nipponensis 6 6 5 6 4 7
V. umbellata 12 2 0 0 0 1
V. minima 10 1 1 0 0 0
V. hirtella 2 0 0 0 0 0
V. riukinensis 2 0 0 0 0 0
V. nakashime 2 2 0 0 0 0
V. reflexo-pilosa 2 0 0 0 0 0
V. trinervia 2 0 1 0 0 1
V. radiata 14 0 2 0 0 0
V. sublobata 10 0 4 0 3 5
V. mungo 3 1 0 0 0 1
V. subramaniana 2 1 0 0 0 0
V. aconitifolia 8 0 0 0 0 0
V. trilobata 4 0 0 0 1 0
V. stipulaticea 2 0 0 0 0 0

表4 扩增片段序列长度
Table 4 Amplified sequences length
扩增片段序列长度 Amplified sequences length (bp) 种名
Species
取样数
No.of materials psbA-trnH rpoB-trnC trnL-trnF rpl16 rps16
V. angularis 16 370 1024–1025 895 654 580
V. angularis(weedy) 12 370 1023–1025 895 654 580
V. nipponensis 6 370–377 1023–1024 895 654 580
V. umbellata 12 370 1023 946 654 579
V. minima 10 378 1022–1023 947 654 580
V. hirtella 2 370 1030 946 654 569
V. riukinensis 2 377 1022 946–947 654 580
V. nakashime 2 378 1023 947 654 580
V. reflexo-pilosa 2 349 1027 970 654 436
V. trinervia 2 349 1027 951–952 654 436
V. dalzelliana 1 369 1022 947 654 569
V. radiata 14 348 1052 931 670 569
V. sublobata 10 348 1052 931 670 569
V. mungo 3 351 1027–1028 931 675 437
V. subramaniana 2 354 1027 952 672 436
V. aconitifolia 8 349 1032–1033 952 670 437
V. trilobata 4 369 1033–1034 952 670 440
V. stipulacea 2 350 1027 952 670 438–440
第 6期 刘 岩等: 基于叶绿体 DNA序列的 Ceratotropis亚属遗传进化研究 983



图1 种间序列片段长度差异图
Fig. 1 Sequence length difference of inter-species
A: 3份中国V. nipponensis 种 psbA-trnH序列长度差异区; B: psbA-trnH序列种间长度差异区; C: rpoB-trnC序列V. radiata、V. sublobata
种多出序列区; D: trnL-trnF序列V. angularis及其亚种缺失序列区; E: trnL-trnF序列V. radiata、V. sublobata和V. mungo缺失序列区;
F: rpl16序列种间长度差异区; G: rps16序列种间长度差异区。
A: Length difference region of 3 China V. nipponensis species in psbA-trnH; B: Sequence length difference region of inter-species in
psbA-trnH; C: Sequence exceed region of V. radiata and V. sublobata in rpoB-trnC; D: Sequence deletion region of V. angularis and its
subspecies in trnL-trnF; E: Sequence deletion region of V. radiata, V. sublobata and V. mungo in trnL-trnF; F: Sequence length difference
region of inter-species in rpl16; G: Sequence length difference region of inter-species in rps16.

V. mungo、V. subramaniana、V. aconitifolia 和 V.
trilobata)及亚种全部缺失该段碱基序列。
对于叶绿体 rpoB-trnC序列, V. radiata及其亚种
V. sublobata在该区段的序列最长(1052 bp), 主要是
它们在该区段 850~874 bp之间存在一段 25个碱基的
序列而其他种呈现缺失现象(图 1-C)。其他种的种间
序列长度差异不是很大, 介于 1022~1034 bp之间。
对于叶绿体 trnL-trnF 序列, 部分种在该区段的
984 作 物 学 报 第 39卷

种间序列长度差异较大, 其中片段最长的是 V. re-
flexo-pilosa (970 bp), 最短的是 V. angularis及其 2
个亚种 V. angularis (weedy), V. nipponensis (895 bp),
片段最短的主要原因是其序列 159~209 bp之间存在
40 个碱基的缺失(图 1-D), V. radiata、V. sublobata
和V. mungo长度也较短(931 bp), 其序列 251~270 bp
之间存在缺失 20 个碱基(图 1-E), 剩余其他种的序
列长度都在 950 bp左右。
对于叶绿体 rpl16序列, 其序列存在 PolyA结构
导致长度变短, 从 V. angularis 到 V. dalzelliana 11
个种及亚种序列长度都为 654 bp, 而从 V. radiata到
V. stipulacea 7个种及亚种序列长度在 670 bp左右,
高于前者, 主要因其 330~345 bp处多出一段 16个碱
基的序列(图 1-F)。
对于叶绿体 rps16 序列, 部分种之间序列长度
存在较大差异, V. angularis及其 2个亚种 V. angu-
laris (weedy)、V. nipponensis以及 V. umbellata、V.
minima、V. riukinensis和 V. nakashime序列长度达到
580 bp, V. hirtella、V. dalzelliana、V. radiata和 V.
sublobata序列长度为 569 bp, 而其余种的序列长度
较短, 在 440 bp 左右, 比较发现这些种在该区段存
在较多的碱基缺失现象(图 1-G)。
2.4 种间进化距离分析
从 Ceratotropis 亚属 18 个种及亚种中各选取 1
份材料, 同时将叶绿体 psbA-trnH等 5个序列拼接比
对, 基于Kimura-2参数计算 18份材料的种间进化距
离(表 5)。结果发现, 各种间的遗传距离介于 0~0.057
之间, V. minima、V. riukinensis和 V. nakashime的种
间进化距离非常小, 在 0~0.001范围内, 而它们与 V.
subramaniana显示了种间进化距离的最大值(0.057);
V. trinervia 和 V. reflexo-pilosa、V. trilobata 和 V.
stipulacea 进化距离也非常小, 都为 0.001。对于 V.
angularis 及其 2 个亚种 V. angularis (weedy)、V.
nipponensis, 其种间进化距离为 0; V. radiata和其亚
种 V. sublobata的种间进化距离为 0.001。
2.5 系统发育分析
选取 Ceratotropis亚属 18个种及亚种共 35份材
料, 采用邻接法(NJ法)对 psbA-trnH等 5个序列分别
进行系统发育分析(图 2~图 6)。5个序列所得到的聚
类结果基本一致, 均可分为两大支, 第 I 支包括 V.
radiata、V. sublobata、V. mungo、V. trilobata、V.
stipulacea、V. aconitifolia、V. subramaniana、V.
trinervia和 V. reflexo-pilosa, 共 9个种和亚种; 第 II
支包括 V. minima、V. riukinensis、V. nakashime、V.
umbellata、V. angularis、V. angularis (weedy)、V.
nipponensis、V. dalzelliana和 V. hirtella, 共 9个种
和亚种。当然也存在个别例外之处, 如 rpl16序列系
统发育树中, V. mungo被聚为第 II分支, rps16序列
系统发育树中, V. dalzelliana和 V. hirtella被聚为第
I 分支。第 I 支中 , V. radiata 及其野生亚种 V.
sublobata、V. trilobata和 V. stipulacea、V. trinervia
和 V. reflexo-pilosa 3个组合各自以较高的自展支持
率聚在一起; 第 II支中, V. angularis及其 2个野生亚
种 V. angularis (weedy)和 V. nipponensis以较高自展
支持率聚在一起, V. minima、V. riukinensis 和 V.
nakashime也以较高自展支持率聚在同一分支上, 而
除 rps16序列系统发育树外, V. dalzelliana跟三者的
亲缘关系较近, 都以较高的自展支持率与它们聚在
一起。
PAUP 软件所构建的 5 个序列最简约树信息见
表 6, 其一致性指数(CI)和保持性指数(RI)值都较高,
聚类结果与邻接树结果基本一致(MP图未列出)。对
来自 psbA-trnH 等 5 个序列数据的分化同质性检验
表明, 依据 5 个序列所构建的基因树不存在显著冲
突(P=0.87)。5 组数据合并 , 得到唯一最大简约树
(CI=0.85, RI=0.98), 与基于单个序列构建的基因树
基本相同(图 7)。Ceratotropis亚属 18个种及亚种 35


图 2 基于 psbA-trnH序列构建的邻接树
Fig. 2 Neighbor-joining tree based on sequences of psbA-trnH





表5 基于五序列拼接的Kimura进化距离
Table 5 Pairwise divergence of five assembling sequences using Kimura-2-parameter distance
Species 1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
V. angularis
V. nipponensis 0
V. angularis (weedy) 0 0
V. umbellata 0.007 0.007 0.007
V. minima 0.011 0.010 0.011 0.007
V. nakashime 0.010 0.010 0.010 0.006 0
V. riukinensis 0.011 0.010 0.011 0.007 0.001 0
V. trinervia 0.050 0.050 0.050 0.051 0.055 0.054 0.055
V. dalzelliana 0.031 0.031 0.031 0.028 0.027 0.027 0.027 0.033
V. hirtella 0.026 0.025 0.026 0.029 0.033 0.032 0.033 0.031 0.009
V. reflexo-pilosa 0.051 0.050 0.051 0.052 0.055 0.055 0.055 0.001 0.034 0.032
V. radiata 0.037 0.037 0.037 0.039 0.042 0.042 0.042 0.024 0.017 0.015 0.025
V. sublobata 0.036 0.036 0.036 0.038 0.041 0.041 0.041 0.024 0.017 0.015 0.025 0.001
V. subramaniana 0.052 0.052 0.052 0.054 0.057 0.057 0.057 0.006 0.035 0.032 0.005 0.026 0.026
V. mungo 0.052 0.052 0.052 0.052 0.056 0.056 0.056 0.011 0.035 0.033 0.011 0.027 0.027 0.012
V. aconitifolia 0.050 0.050 0.050 0.052 0.055 0.055 0.055 0.008 0.034 0.031 0.008 0.023 0.023 0.009 0.011
V. trilobata 0.050 0.050 0.050 0.052 0.056 0.055 0.056 0.008 0.034 0.031 0.008 0.025 0.025 0.010 0.011 0.009
V. stipulacea 0.050 0.050 0.050 0.052 0.055 0.055 0.055 0.008 0.033 0.031 0.008 0.025 0.024 0.009 0.011 0.009 0.001
a: 横排编号1~18分别代表竖排从V. angularis到V. stipulacea的18个种和亚种。
a: 1–18 in the first row represent 18 species and subspecies in the first column from V. angularis to V. stipulacea.



986 作 物 学 报 第 39卷


图 3 基于 rpoB-trnC构建的邻接树
Fig. 3 Neighbor-joining tree based on sequences of rpoB-trnC


图 4 基于 trnL-trnF序列构建的邻接树
Fig. 4 Neighbor-joining tree based on sequences of trnL-trnF

图 5 基于 rpll6构建的邻接树
Fig. 5 Neighbor-joining tree based on sequences of rpl16


图 6 基于 rps16序列构建的邻接树
Fig. 6 Neighbor-joining tree based on sequences of rps16
第 6期 刘 岩等: 基于叶绿体 DNA序列的 Ceratotropis亚属遗传进化研究 987


份材料可分为两大支, 第 I支中, V. radiata及其亚种
V. sublobata 以 100%的自展支持率聚在一起, 单独
构成 1 个分支, 而第 2 个分支又由自展支持率达
100%的 3 个小支构成, 其中 V. reflexo-pilosa 和 V.
trinervia 以 94%的自展支持率聚在一起, 而后又以
98%的自展支持率与 V. subramaniana聚在一起, 最
终与 V. aconitifolia以 66%的自展支持率聚为第一小
支, V. trilobata和 V. stipulacea以 100%的自展支持
率聚为第 2小支, V. mungo单独聚为第 3小支; 第 II
支由 3个分支构成, V. hirtella跟其他种的亲缘关系
较远, 单独构成第一分支, V. dalzelliana构成第 2分
支, 而第 3分支又由 3个小支组成, 其中 V. angularis,
V. angularis (weedy)以及来自中国的 V. nipponensis
以 100%的自展支持率聚为第 1小支, V. umbellata和
来自日本的 V. nipponensis聚为第 2小支, V. minima、
V. riukinensis和 V. nakashime 3个种以 100%的自展
支持率聚在一起, 构成第 3小支。

表 6 各序列简约树信息参数
Table 6 Information parameters of parsimony tree for each
DNA sequence
DNA序列
DNA sequence
树长
Tree length
一致性指数
Consistency
index
保持性指数
Retentivity
index
psbA-trnH 33 0.94 0.98
rpoB-trnC 43 1.00 1.00
trnL-trnF 59 0.88 0.98
rpl16 41 0.90 0.98
rps16 156 0.98 0.99
3 讨论
植物 DNA 序列由于进化速率上的差异而适用
于不同分类阶元的系统发育研究, 因此, 针对某一
特定的系统学问题选择相应合适的分子片段是分子
系统学研究中最为关键的一步[35]。本研究选择了对
较近分类群系统发育研究有重要价值的 5 个非编码
区。Downie等[36]认为, rpl16内含子进化速率快, 适
用于较低分类阶元或近缘类群间(如种间、近缘属间)
的系统发育研究。大多数被子植物 rpl16内含子序列
长度在 1 kb左右[37], 本实验凝胶检测结果亦是如此,
但测序时因存在 PolyA 结构, 导致其序列长度变短
(677 bp), 因此变异位点百分率(5.17%)和信息位点
百分率(4.28%)都相对较低。Small 等[38]认为, rps16
内含子一般适用于较高分类阶元的系统发育研究 ,
其变异的大小还不足以解决属下, 特别是近代分化
类群的系统关系。但本实验中, rps16内含子的变异
位点百分率(25.46%)和信息位点百分率(24.28%)都

图 7 基于五序列拼接构建的最大简约树
Fig. 7 Maximum parsimony tree based on five assembling
sequences

非常高, 因此 Small等[38]的结论在 Ceratotropis亚属
中有一定的局限性。另外, Ceratotropis 亚属种内碱
基序列变异位点比较表明, 叶绿体 psbA-trnH 等 5
个序列都显示了高度的种内序列保守性, 表明它们
在 Ceratotropis 亚属不适用于种内以及各亚种间的
分子系统发育研究。
单基因片段提供的系统发育信息是有限的, 以
单基因片段为依据所构建的系统树往往只是该片
段的基因树 , 并不能真实地反映分类群的系统发
育[39]。另外, 不同叶绿体基因可能存在进化速度的
不同, 利用单个基因研究系统进化关系可能导致一
些偏差[40]。因此本研究以叶绿体内含子 rpl16、rps16
以及基因间隔区 psbA-trnH、rpoB-trnC和 trnL-trnF
共 5 个序列拼接组合进行系统发育分析。在种间进
化距离研究中, V. minima、V. riukinensis 和 V. na-
kashime的种间进化距离非常小(0~0.001), 在系统发
育树中, 它们更是以 100%的自展支持率聚在一起,
说明它们的亲缘关系非常近, 可能具有共同的野生
祖先, 这与 Tomooka等[10]利用 AFLP 研究的结果相
一致。另外, 马燕玲等[41]利用 ITS 序列研究指出 V.
988 作 物 学 报 第 39卷

trinervia 和 V. reflexo-pilosa 的亲缘关系比较近, 推
测其为四倍体 V. reflexo-pilosa 的二倍体供体种之
一。本研究中, 通过进化距离值(0.001)和系统发育树
中的自展支持率(94%)也可作此推断。又因为叶绿体
DNA 属母性遗传, 故可推测 V. trinervia 为 V. re-
flexo-pilosa 的母本供体种, 而同时 V. subramaniana
又以 98%的自展支持率与它们聚在一起, 说明这三
者的亲缘关系也很近。对于 V. angularis 和其亚种
V. angularis (weedy)以及 V. radiata 和其亚种 V.
sublobata, 各亚种之间的进化距离值低 (0, 0.001),
自展支持率高(都为 100%), 在表明亚种之间亲缘关
系近的同时, 也再次证明 psbA-trnH等 5个序列不适
用于种以下分子系统学研究。
另外, 来自中国和日本的两份 V. nipponensis未
聚在一起, 发现其叶绿体 rpoB-trnC 序列存在较大
差异, 亲缘关系较远, 而在其余 4 个叶绿体序列中,
两者都是以 100%的自展支持率聚在一起的。同样,
对于 V. dalzelliana, 除在叶绿体 rps16序列系统发育
树中, 它与 V. minima、V. riukinensis和 V. nakashime
3 个种在其余 4 个序列中都具有较高的自展支持率,
表现了较近的亲缘关系。
比较发现, 本研究对 Ceratotropis 亚属 18 个种
和亚种的聚类结果与传统的形态学分类以及 ITS 序
列分类结果不相一致。根据形态特征, Ceratotropis
亚属被分为 Angulares、Ceratotropis和 Aconitifoliae 3
个组。而根据 5 个叶绿体序列, Ceratotropis 亚属被
分为 2 个大支。第 II 支中的 9 个种及亚种同属于
Angulares 组, 第 I 支中的 9 个种及亚种则为 3 个组
的混合体, 其中的 V. trinervia和 V. reflexo-pilosa种
属于 Angulares组。从中可推测出, 一是 Ceratotropis
组和 Aconitifoliae 组的亲缘关系比较近, 而它们与
Angulares 组中的大部分种的亲缘关系较远, 二是本
研究中的 5个叶绿体序列不是外部形态学性状的编
码基因, 三是跟 ITS 序列相比, 叶绿体序列的进化
速度比较慢, 序列较为保守。
4 结论
Ceratotropis 亚属 18个种和亚种的种内及亚种
间表现了具高度序列保守性, 而种间存在一定比率
的变异位点; 不同叶绿体序列中, 种间片段长度差
异较大; 基于单个序列与基于5个序列拼接数据所得
到的分子系统进化树基本一致, 18 个种和亚种被分
为两大支。psbA-trnH等 5个序列的变异特征对阐明
Ceratotropis亚属种间亲缘关系和系统演化具有重要
的理论和现实意义。
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990 作 物 学 报 第 39卷

附表 参试材料来源及所属种
Appenix Species and origin of accessions used in this study
序号
No.
来源
Origin
原产地
Producing area
类型
Type
所属种
Species
1 国家种质库 National Genebank of China 中国天津 Tianjin, China Landrace V. angularis
2 国家种质库 National Genebank of China 中国山西 Shanxi, China Landrace V. angularis
3 国家种质库 National Genebank of China 中国内蒙古 Inner Mongolia, China Landrace V. angularis
4 国家种质库 National Genebank of China 中国吉林 Jilin, China Landrace V. angularis
5 国家种质库 National Genebank of China 中国黑龙江 Heilongjiang, China Landrace V. angularis
6 国家种质库 National Genebank of China 中国辽宁 Liaoning, China Landrace V. angularis
7 国家种质库 National Genebank of China 中国湖北 Hubei, China Landrace V. angularis
8 国家种质库 National Genebank of China 中国江苏 Jiangsu, China Landrace V. angularis
9 国家种质库 National Genebank of China 日本 Japan Landrace V. angularis
10 国家种质库 National Genebank of China 中国云南 Yunnan, China Landrace V. angularis
11 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Cultivar V. angularis
12 国外引种 Introduced from abroad 日本 Japan Cultivar V. angularis
13 国外引种 Introduced from abroad 古巴 Cuba Cultivar V. angularis
14 国外引种 Introduced from abroad 朝鲜 Korea Cultivar V. angularis
15 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Cultivar V. angularis
16 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Cultivar V. angularis
17 野外采集 Field collection 中国云南 Yunnan, China Wild V. nipponensis
18 野外采集 Field collection 中国云南 Yunnan, China Wild V. nipponensis
19 国外引种 Introduced from abroad 日本 Japan Wild V. nipponensis
20 国外引种 Introduced from abroad 日本 Japan Wild V. nipponensis
21 野外采集 Field collection 中国云南 Yunnan, China Wild V. nipponensis
22 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Wild V. nipponensis
23 野外采集 Field collection 中国辽宁 Liaoning, China Wild V. angularis (weedy)
24 野外采集 Field collection 中国湖北 Hubei, China Wild V. angularis (weedy)
25 野外采集 Field collection 中国湖北 Hubei, China Wild V. angularis (weedy)
26 野外采集 Field collection 中国湖北 Hubei, China Wild V. angularis (weedy)
27 野外采集 Field collection 中国湖北 Hubei, China Wild V. angularis (weedy)
28 野外采集 Field collection 中国安徽 Anhui, China Wild V. angularis (weedy)
29 野外采集 Field collection 中国安徽 Anhui, China Wild V. angularis (weedy)
30 野外采集 Field collection 中国安徽 Anhui, China Wild V. angularis (weedy)
31 野外采集 Field collection 中国辽宁 Liaoning, China Wild V. angularis (weedy)
32 野外采集 Field collection 中国辽宁 Liaoning, China Wild V. angularis (weedy)
33 野外采集 Field collection 中国河北 Hebei , China Wild V. angularis (weedy)
34 野外采集 Field collection 中国河北 Hebei, China Wild V. angularis (weedy)
35 野外采集 Field collection 中国云南 Yunnan, China Wild V. umbellata
36 野外采集 Field collection 中国云南 Yunnan, China Wild V. umbellata
37 野外采集 Field collection 中国北京 Beijing, China Wild V. umbellata
38 野外采集 Field collection 中国河北 Hebei, China Wild V. umbellata
39 野外采集 Field collection 中国江西 Jiangxi, China Wild V. umbellata
40 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. umbellata
41 国外引种 Introduced from abroad 美国 America Wild V. umbellata
42 国外引种 Introduced from abroad 葡萄牙 Portugal Wild V. umbellata
43 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. umbellata
44 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. umbellata
45 国外引种 Introduced from abroad 古巴 Cuba Wild V. umbellata
46 国外引种 Introduced from abroad 朝鲜 Korea Wild V. umbellata
47 野外采集 Field collection 中国北京 Beijing, China Wild V. minima
48 野外采集 Field collection 中国北京 Beijing, China Wild V. minima
49 野外采集 Field collection 中国辽宁 Liaoning, China Wild V. minima
50 野外采集 Field collection 中国河北 Hebei, China Wild V. minima
51 野外采集 Field collection 中国山东 Shandong, China Wild V. minima
52 野外采集 Field collection 中国辽宁 Liaoning, China Wild V. minima
53 野外采集 Field collection 中国辽宁 Liaoning, China Wild V. minima
54 野外采集 Field collection 中国河北 Hebei, China Wild V. minima
55 野外采集 Field collection 中国江苏 Jiangsu, China Wild V. minima
第 6期 刘 岩等: 基于叶绿体 DNA序列的 Ceratotropis亚属遗传进化研究 991


(续附表)
序号
No.
来源
Origin
原产地
Producing area
类型
Type
所属种
Species
56 野外采集 Field collection 中国山东 Shandong, China Wild V. minima
57 国外引种 Introduced from abroad 泰国 Thailand Wild V. riukinensis
58 国外引种 Introduced from abroad 日本 Japan Wild V. riukinensis
59 野外采集 Field collection 中国河北 Hebei, China Wild V. nakashime
60 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. nakashime
61 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. hirtella
62 国外引种 Introduced from abroad 泰国 Thailand Wild V. hirtella
63 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Wild V. reflexo-pilosa
64 国外引种 Introduced from abroad 泰国 Thailand Wild V. reflexo-pilosa
65 国外引种 Introduced from abroad 泰国 Thailand Wild V. trinervia
66 国外引种 Introduced from abroad 泰国 Thailand Wild V. trinervia
67 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Wild V. dalzelliana
68 国家种质库 National Genebank of China 中国内蒙古 Inner Mongolia, China Landrace V. radiata
69 国家种质库 National Genebank of China 中国内蒙古 Inner Mongolia, China Landrace V. radiata
70 国家种质库 National Genebank of China 中国内蒙古 Inner Mongolia, China Landrace V. radiata
71 国家种质库 National Genebank of China 中国吉林 Jilin, China Landrace V. radiata
72 国家种质库 National Genebank of China 中国吉林 Jilin, China Landrace V. radiata
73 国家种质库 National Genebank of China 中国山东 Shandong, China Landrace V. radiata
74 国家种质库 National Genebank of China 中国山东 Shandong, China Landrace V. radiata
75 国家种质库 National Genebank of China 中国河南 Henan, China Landrace V. radiata
76 国家种质库 National Genebank of China 中国河南 Henan, China Landrace V. radiata
77 国家种质库 National Genebank of China 中国贵州 Guizhou, China Landrace V. radiata
78 国家种质库 National Genebank of China 中国安徽 Anhui, China Landrace V. radiata
79 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Cultivar V. radiata
80 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Cultivar V. radiata
81 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Cultivar V. radiata
82 野外采集 Field collection 中国北京 Beijing, China Wild V. sublobata
83 野外采集 Field collection 中国河北 Hebei, China Wild V. sublobata
84 野外采集 Field collection 中国湖北 Hubei, China Wild V. sublobata
85 野外采集 Field collection 中国河南 Henan, China Wild V. sublobata
86 野外采集 Field collection 中国江西 Jiangxi, China Wild V. sublobata
87 国外引种 Introduced from abroad 中国澳大利亚 Australia Wild V. sublobata
88 野外采集 Field collection 中国山东 Shandong, China Wild V. sublobata
89 野外采集 Field collection 中国安徽 Anhui, China Wild V. sublobata
90 国外引种 Introduced from abroad 泰国 Thailand Wild V. sublobata
91 野外采集 Field collection 中国天津 Tianjin, China Wild V. sublobata
92 野外采集 Field collection 中国河北 Hebei, China Wild V. mungo
93 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. mungo
94 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Wild V. mungo
95 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Wild V. subramaniana
96 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Wild V. subramaniana
97 国外引种 Introduced from abroad 英国 England Wild V. aconitifolia
98 国外引种 Introduced from abroad 英国 England Wild V. aconitifolia
99 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. aconitifolia
100 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. aconitifolia
101 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Wild V. aconitifolia
102 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Wild V. aconitifolia
103 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. aconitifolia
104 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. aconitifolia
105 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Wild V. trilobata
106 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. trilobata
107 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. trilobata
108 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. trilobata
109 国外引种 Introduced from abroad 澳大利亚 Australia Wild V. stipulacea
110 国外引种 Introduced from abroad 印度 India Wild V. stipulacea