全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18( 2) : 123～126
Journal of Wuhan Botanical Research
水稻幼苗寒害产生的生化机制研究

董彩华　李　松　王志强　王延枝


(武汉大学生命科学学院武汉 430072)
提　要　诱导性冷失活是 V 型 ATPase 的一种共同特性。用荧光光谱技术以水稻液泡膜H+ -
ATPase 为研究对象,深入探讨了水稻幼苗冷失活现象的机制。研究表明,能引起较大程度冷
失活现象的物质,往往先对膜脂有序性产生影响,通过对多种阳离子、阴离子、离子螯合剂导
致冷失活能力和导致膜脂有序性变化能力间的比较,都能说明这一点。可以认为膜脂状态变
化是冷失活机制发生的一个重要方面, 也是植物早期寒害产生的原因之一。
关键词　V 型 H+ -ATPase,冷失活, 液泡膜
STUDY ON MECHANISM OF COLD INACTIVATION OF
VACUOLAR H
+ -ATPase ON RICE TONOPLAST
Dong Caihua　Li Song　Wang Zhiqiang　Wang Yanzhi
( Col leg e of L if e S ciences, Wuhan Univ ersity　Wuhan　430072)
Abstract　I nduced cold inact iva tion is a gener al char acteristic of V-type H+ -ATPase . In this
paper , fluor escence spectrum technique has been used to thor oughly st udy the mechanism of
cold inactivat ion o f H+ -AT Pase on r ice tonoplast. I t show s t hat the chem icals that can cause
the cold inactivat ion considerably usually cause the dest ruction o f the o rder o f tonoplast lipid
fir st. T he capability o f inducing cold inact ivat ion and chang ing t he o rder of membrane-lipid in
cations, anions and chelation agents has been t estified and compared. T he r esult pr o ved the
conclusion above . We consider t ha t the changing o f membrane-lipid in tonoplast plays an
impor tant r ole in cold inact ivat ion and is one of t he r easons of ear ly cold pet o f plants.
Key words　V-T ype H+ -ATPase, Cold inactivation, T onoplast
液泡膜 H+ -AT Pase属于V 型质子泵AT Pase〔1〕,该酶产生的质子驱动力为各种离子
和分子的跨液泡膜转运提供动力,它还参与能量以及信息转运,近年来诱导性冷失活现象
已成为 H+ -AT Pase的研究热点之一〔2, 3〕。我们对水稻 H+ -AT Pase冷失活现象进行了研
究,这有助于了解 V 型 H + -AT Pase 的生化性质, 为防治植物早期寒害提供理论依据, 对
于防止早稻烂秧的机制研究也有实际意义。




通讯联系人
收稿日: 1999-03-21,修回日: 1999-05-31。第一作者:女, 1976年出生,硕士研究生,从事水稻逆境生理研究。
国家自然科学基金资助项目( 39570434)。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　材料与试剂　
植物材料:水稻(中花 7号,由中国农业科学院粮食作物所提供)
萌发后置于生化培养箱 30℃闭光培养, 5 d 后取黄化苗,称重后用预冷的无离子水漂洗;
 试剂: Merocyanine 540 为 Sigma 公司产品, ATP、DTT (二硫苏糖醇)为 IN C 公司产
品, Hepes、T ris均为西德进口分装产品,其余试剂均为国产分析纯试剂。
1. 2　方法
1. 2. 1　膜微囊的分离纯化　参看文献〔1〕和〔4〕。
1. 2. 2　ATPase 活力测定　
采用 Fiske 和 Subbarw 方法〔5〕;  利用偶联反应连续测定
NADH 因氧化而在 366 nm 和 550 nm 差光谱变化测定酶水解 A TPase 的活力〔AT Pase
活力
mol pi ( mg pro tein) - 1· min- 1〕〔6〕。
1. 2. 3　冷失活的处理条件与酶活力的测定　参看文献〔7〕。
1. 2. 4　蛋白含量测定　利用 Lowr y 法〔9〕,以牛血清白蛋白为标准品。
1. 2. 5　MC540荧光发射的测定　将适当比例的 MC540与膜微囊制剂混合标记 30 s,在
2. 5 mmol/ L 的 Tr is-Hepes( pH7. 5)介质中测定。日立 F-4010型荧光分光光度计在激发
波长 540 nm 时测 555 nm～615 nm 的发射光谱。
图 1　二价阳离子对冷失活时膜脂状态的影响
Fig. 1　Th e inf luence of divalent cation on
th e st ructu re of membrane lipid
in cold in activat ion
2　结果与讨论
2. 1　冷失活过程中各种阳离子的影响
2. 1. 1　二价阳离子的影响　图1是MC540发射光
谱,各样品中均含AT P、NaCl及2 mmol·L - 1不同
的金属阳离子(均为氯化物)或螯合剂,数据见表1。
表 1 中的数据表明: 4 种二价阳离子相比,
M g
2+ 对膜脂有序性有较大的影响, 膜脂有序性的
改变,在一定程度上降低酶活性。但由于 Mg 2+是液
泡膜H + -AT Pase 活性所必须的离子,因此, 反应体
系中需要加入 Mg 2+。
2. 1. 2　一价阳离子的作用　通常一价阳离子对冷
失活无明显影响。用含 ATPase( 2 mmol / L )的缓冲
液加上各种一价阳离子(氯化物) 0. 1 mmol/ L 来处
理液泡膜微囊,所得实验结果见表 2。表 2表明各种
一价阳离子对膜脂状态的影响很小,这是由于它们
所带电荷少的缘故。
2. 2　冷失活过程中各种阴离子的影响
2. 2. 1　阴离子对冷失活时酶活力的影响　 较有代
表性的 6种阴离子单独作用时和与 Mg 2+、ATP 共同使用时对冷失活的影响见表 3。
植物液泡膜H + -AT Pase 受阴离子激活, NO -3 抑制〔1〕。从表 3中可以看出:阴离子对
124 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　第 18卷　　
Mg2+ -AT P 诱导的酶冷失活有较大增强作用,激活作用越大,增强作用越强。其原因尚不
清楚。但这些结果可为研究液泡膜 H+ -AT Pase冷失活的机制提供参考。
2. 2. 2　阴离子对冷失活时膜脂状态的影响　6种阴离子对膜脂状态影响结果如表 4。
表 1　二价阳离子及螯合剂的存在对冷失活的影响
Table 1　The influence o f divalent ca tion and
chelat ing to the cold inact ivat ion
组名
T eams
MC5发射峰值
The emis sion
peak of M C540
相对强度
Relat ive
intensity
相对酶活
Relat ive act ivity
of enzym e
对照Con trol 158. 2 1. 00 1. 00
EDTA 156. 7 0. 99 1. 03
EGTA 157. 9 1. 00 1. 03
C o2+ 163. 1 1. 03 0. 85
M n2+ 169. 9 1. 07 0. 87
M g2+ 180. 2 1. 14 0. 73
Ba2+ 194. 8 1. 23 0. 82
　　注:空白液为含 2 mmol / L AT Pase、0. 2 mmol / L NaCl
的缓冲液。
Note: T he cont rol is a b uf fer w ith 2 mmol/ L AT Pase
and 0. 2 mmol / L NaCl
表 2　一价阳离子对冷失活的影响
Table 2　T he influence of monovalent cation
on t he co ld inactiv ation
组名
T eams
MC540发射峰值
The emis sion
peak of M C540
相对酶活
Relat ive act ivity
of en zyme
对照C on trol 135. 6 1. 00
Li+ 130. 4 0. 96
Na+ 144. 3 1. 06
K+ 147. 6 1. 08
NH+4 139. 9 1. 03
　　注:空白液为含 AT P 2 mmol /L 的缓冲液。
Note: Th e cont rol is a bu ffer w ith 2 mmol/ L ATP.
表 3　阴离子对冷失活时酶活力的影响
Table 3　T he influence o f anion on the act ivity o f
enzyme in cold inactivat ion
阴离子
(均为 Na 盐)
Anion
( al l Na+ salt )
相对酶活 Relat ive activity of en zyme
w ithout Mg2+、
AT P
with Mg 2+ 、
AT P
对照 Cont rol 1. 00 1. 00
F- 0. 99 0. 94
Cl- 0. 95 0. 63
Br- 0. 93 0. 44
NO 3- 0. 68 0. 26
SCN- 0. 91 0. 31
注: 空白液在“无 Mg2+、ATP”栏内,代表只含 DT T 的
缓冲液,在“有 Mg 2+ 、ATP”栏内代表含 M g2+ 、AT P 各
2 mmol/ L 的缓冲液。
Note: T he cont rol in th e column of “w ithout M g2+ ,
AT P”m eans a bu ffer on ly w ith DT T w hile the con tr ol
in the colum n of “with M g2+ , AT P”mean s a b uffer
w ith 2 mmol/ L Mg2+ , AT P( Th e same as follow s) .
表 4　阴离子对冷失活时膜脂状态的影响
Table 4　The influence o f anion on t he
str ucture o f membrane lipid in co ld inactiv ation
阴离子
(均为 Na 盐)
Anion
( all Na+ salt )
M C540发射峰值相对强度
Relat ive intensity of
the emis sion peak of MC 540
with ou t Mg2+ 、
AT P
wi th M g2+ 、
AT P
对照 Cont rol 1. 00 1. 00
F- 1. 02 1. 09
C l- 1. 10 1. 12
Br- 1. 12 1. 04
NO 3- 1. 19 1. 08
SCN- 1. 20 1. 20
SO 2-4 1. 34 1. 11
　　阴离子对膜脂状态的影响虽有程度上的不同,但总的看来,其影响都不明显。分析它
们造成冷失活的原因有以下几种: NO -3 在有 Mg2+ 、ATP 时对膜脂影响很小, 造成酶的较
大程度失活是由于它对该酶的抑制作用。阴离子对酶的激活作用是通过改变酶蛋白构象
来实现的, Cl -既改变膜脂状态又是酶的强激活剂,改变了酶的构象。在冷失活过程中的
作用不是通过膜脂状态变化的影响所引起的。这表明,影响酶冷失活的因素有两方面。一
个是通过影响膜脂的有序性,而另一个是影响酶的构象。SCN - 作为外周蛋白的促溶剂,
在 Mg2+ 、AT P 存在时可促使 V1部分脱落〔10〕,从而产生类似冷失活的现象, 导致酶的失
活主要是其促溶作用。
125　第 2期　　　　　　　　　　　　董彩华等:水稻幼苗寒害产生的生化机制研究
2. 3　冷失活过程中各种因素的作用
根据已有的结果对冷失活过程中各种因素所起作用进行分析可知:
阳离子(除
Mg
2+ 外)因其带有大量正电荷对膜脂流动性和表面电荷密度产生影响, 进而影响冷失活
作用。但由于这些离子不能与酶蛋白结合,所以对酶蛋白构象的影响较小,故产生的冷失
活作用不如 Mg2+ 。一价阳离子所带电荷较少而对膜脂作用微弱, 也不能对酶构象产生影
响,因而对冷失活几乎无作用。 阴离子: Cl -、Br-对酶蛋白构象的影响在有 Mg2+ 、AT P
时比无 Mg2+ 、ATP 时要强,因而 Cl -、Br-对冷失活表现促进作用。
参　考　文　献
1　Wang Y Z, S ze H. Similarit ies an d differences betw een the ton op las t-typ e and mitoch on drial H+ -AT Pase of oat
r oot s . J Bio Chem, 1985. 260: 10 434～10440
2　王延枝,许献忠.空泡膜类型 H+ -AT Pase的研究进展.生物物理及生物化学进展, 1993( 20) : 19～25
3　Moriyama Y, Nelson N. Cold inact ivat ion of vacuolar proton-ATPase. J. B io Chem , 1989. 264: 3 577～3 582
4　王延枝,斯海文.燕麦细胞中液泡膜的初步研究。武汉大学学报(自然科学版) , 1987( 1) : 101～106
5　 Hodges T K, Leonard R T . Purif icat ion of a plasma m embr ane-band ATPase fr om plant roots . Me thod s in
Enzy me, 1997. 39: 392～399
6　屠亚平,徐红,杨福愉.跨膜 Ca2+梯度通过磷脂酰胆碱调节 Ca2+ -ATPase.中国科学( B辑) , 1994, 24( 11) : 1 171～
1 185
7　李如亮,李松,祝雄伟等.水稻液泡膜 H+ -AT Pase 诱导性冷失活过程中膜脂的结构变化.武汉大学学报(自然科
学版) , 1998( 4) : 489～492
8　Low ry O H. Protein measu rement with the folin phenol reagent . J Bio Chem. 1951, 193: 265～278
9　Wil liamson P. Membrane phase and rearrangement of hematopoiet is Ce su rface r eceptors. Mol Cel l B iol , 1981, 1:
128～136
10　祝雄伟,王欢,李如亮等.小麦根液泡膜 H+ -ATPase 的解离和重组.生物物理学报, 1998, 14( 1) : 44～50
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