全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(6): 972978 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家重点基础研究发展计划(973 计划)项目(2012CB113900), 国家自然科学基金项目(30900986), 中央高校基本科研业务费
专项资金项目(XDJK2010B010)和重庆市自然基金重点项目(cstc2012jjB80010)资助。
第一作者联系方式: E-mail: gaoqg2004031@163.com, Tel: 023-68251974 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2014-11-12; Accepted(接受日期): 2015-03-19; Published online(网络出版日期): 2015-04-07.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150407.1041.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00972
甘蓝 BoExo70A1与 BoSEC3、BoExo84蛋白相互作用的
酵母双杂交检测
高启国 1, 刘豫东 1, 蒲全明 1 张林成 1 朱利泉 2 王小佳 1
1 西南大学园艺园林学院 / 南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆 400716; 2 西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400716
摘 要: Exo70A1是芸薹属作物柱头接受亲和花粉的必需因子, 可能参与了干性柱头水分分泌和花粉水合过程。本文从
自交不亲和甘蓝 A1 柱头 cDNA 中获取了 BoExo70A1、BoSEC3、BoSEC10、BoSEC15 和 BoExo84 基因的编码序列, 序
列分析表明, BoExo70A1、BoSEC3、BoSEC10、BoSEC15和 BoExo84基因分别与 AtExo70A1、AtSEC3A、AtSEC10、AtSEC15B
和 AtExo84B基因的 cDNA序列高度同源, 其编码的 5个蛋白均没有信号肽, BoSEC3蛋白含有一个典型的 EF-hand钙离
子结合结构域。将 BoExo84蛋白拆分为 2个片段(BoExo84-N和 BoExo84-C), 并与 BoSEC3、BoSEC10和 BoSEC15蛋
白编码序列一起分别亚克隆至 pGADT7 质粒, BoExo70A1 蛋白编码序列亚克隆至 pGBKT7 质粒, 酵母双杂交检测结果
表明, BoExo70A1 蛋白能与 BoSEC3、BoExo84-N 蛋白互作, 但不能与 BoSEC10、BoSEC15 蛋白互作, 这为深入探讨
BoExo70A1蛋白乃至整个胞泌复合体在甘蓝干性柱头接受自花花粉排斥异花花粉过程中的作用机制提供了依据。
关键词: 甘蓝自交不亲和; BoExo70A1; 胞泌复合体; 相互作用
Interaction Analysis of Brassica oleracea L. BoExo70A1 with BoSEC3 and Bo-
Exo84 Proteins by Using Yeast Two-hybird System
GAO Qi-Guo1,, LIU Yu-Dong1,, PU Quan-Ming1, ZHANG Lin-Cheng1, ZHU Li-Quan2, and WANG
Xiao-Jia1
1 College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University / Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous
Regions, Ministry of Education, Chongqing 400716, China; 2 College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716,
China
Abstract: Exo70A1 is necessary for Brassica stigma accepting the compatible pollen, and may play an important role in regulat-
ing the movement of water from the dry stigma to the pollen grain and compatible pollen hydration. Here, the coding sequences of
BoExo70A1, BoSEC3, BoSEC10, BoSEC15, and BoExo84 genes were amplified from the stigma cDNA of the highly
self-incompatible Brassica oleracea L. line A1. Sequence analysis showed that the cDNA sequences of BoExo70A1, BoSEC3,
BoSEC10, BoSEC15, and BoExo84 genes were highly homologous to those of AtExo70A1, AtSEC3A, AtSEC10, AtSEC15B, and
AtExo84B genes respectively. No signal peptide was found in their deduced protein sequences. BoSEC3 protein contained an
EF-hand calcium-binding domain. The BoExo84 protein was divided into two fragments, BoExo84-N and BoExo84-C, and then
their encoding sequences were subcloned into pGADT7 vector together with those of BoSEC3, BoSEC10, and BoSEC15 proteins
respectively, whereas the encoding sequence of BoExo70A1 protein was subcloned into pGBKT7 vector for analysis of the pro-
teins interaction by yeast two-hybid system. The results showed that BoExo70A1 protein interacted with BoSEC3 or BoExo84-N
protein, but not with BoSEC10 or BoSEC15 protein.
Keywords: Brassica oleracea L. self-incompatibility; BoExo70A1; Exocyst complex; Interaction
甘蓝等芸薹属作物具有特异的干性柱头 , 能识别自
花或异花花粉 , 只有当异花或不同单倍型的花粉落到柱
头上后, 才能使柱头释放出水分和一些小分子物质, 完成
授粉授精过程; 而自花或相同单倍型花粉落到柱头上后,
花粉与柱头蛋白互作后引发了柱头内自交不亲和信号传
导过程, 最终导致花粉萌发受阻[1-3]。至今人们已对自花
第 6期 高启国等: 甘蓝 BoExo70A1与 BoSEC3、BoExo84蛋白相互作用的酵母双杂交检测 973
花粉与柱头互作早期事件分子机制研究较为清楚[3-5]。当
自花花粉落到柱头上后, 花粉中 S-位点半胱氨酸富集蛋
白(S-locus cysteine-rich protein, SCR)与柱头 S-位点受体激
酶(S-locus receptor kinase, SRK)胞外域结合[6], 引起 SRK
构像的变化, 使其释放原本结合在 SRK 激酶结构域的类
硫氧还蛋白 1/2 (thioredoxin-h-like 1/2, THL1/2)[7]激发
SRK 激酶活性, 之后 SRK 与臂重复蛋白 1 (arm repeat
containing, ARC1)作用并使其磷酸化[8], 进而经过一系列
目前尚未知晓的途径继续传递来自于细胞外信号 , 最终
导致花粉萌发受阻。
Samuel 等 [9]研究表明 ARC1 与 Exo70A1 作用 ,
Exo70A1 是柱头接受亲和花粉的必需因子 , 过量表达
Exo70A1在一定程度上降低材料的自交不亲和性。进一步
研究表明 Exo70A1 参与亲和授粉后拟南芥和油菜柱头乳
突细胞中可分泌型囊泡和多泡体向质膜花粉结合位点运
输的调控[10], 高湿环境可部分恢复拟南芥 AtExo70A1 突
变体柱头接受亲和花粉能力, 表明 Exo70A1 参与干性柱
头水分分泌和花粉水合过程调控 [11]。然而目前对于
Exo70A1参与上述过程的分子机制尚未研究清楚。在真核
生物中 , 胞泌复合体是一个进化上高度保守的八聚体 ,
Exo70A1 是该复合体中一个亚基, 胞泌复合体可以将分
泌型囊泡运输并束缚在细胞质膜的特定位点上[12-13]。Hála
等 [14]研究表明拟南芥胞泌复合体亚基 AtExo70A1 与
AtSCE3 相互作用。本试验以高度自交不亲和甘蓝 A1 自
交系开花前 1~2 d的柱头 cDNA为模板, 成功克隆了甘蓝
胞泌复合体亚基 BoExo70A1、BoSEC3、BoSEC10、
BoSEC15 和 BoExo84 的编码序列, 进行了生物信息学分
析 , 并利用酵母双杂交技术证明 BoExo70A1 可与
BoSEC3 和 BoExo84-N 相互作用 , 以期为进一步探讨
BoExo70A1 在芸薹属作物柱头接受异花花粉和排斥自花
花粉过程中作用的分子机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选取高度自交不亲和甘蓝 A1 高代自交系开花前 1~2
d长势一致的花蕾, 取其柱头, 置–80℃冰箱备用, 用于提
取柱头总 RNA。
参照 RNARep Pure 植物总 RNA 试剂盒(TIANGEN,
北京)说明书提取柱头总 RNA。依 Primescript RT Reagent
Kit RR047A (TaKaRa, 大连 )操作说明书反转录合成
cDNA的第 1条链, 置–20℃冰箱保存, 用于基因编码序列
的克隆。
1.2 引物设计及基因编码序列扩增
依 Samuel等[9]公布的油菜 BnExo70A1的 cDNA序列
(GenBank 登录号为 GQ503256), 在芸薹属基因组数据库
(http://brassicadb.org/brad/index.php)进行 BlastN 检索, 获
取其同源基因序列 Bol010046, 同样利用拟南芥 AtSEC3
(AT1G47550)、AtSEC10 (AT5G12370)、AtSEC15 (AT4G
02350)和 AtExo84 (AT5G49830)的 CDS序列在芸薹属基因
组数据库进行检索 , 获取各自甘蓝同源基因的序列
Bol044898、Bol043500、Bol006050和 Bol035257, 然后依
据 Bol010046、Bol044898、Bol043500、Bol006050 和
Bol035257 编码序列以及 AtExo84 的同源基因 Bra037951
序列, 利用 Primer Primer 5软件设计引物(表 1), 分别用于
扩增甘蓝 A1 材料中胞泌复合体亚基 BoExo70A1、
BoSEC3、BoSEC10、BoSEC15和 BoExo84的编码序列。
以反转录合成的柱头 cDNA 第 1 链为模板, 利用
PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TaKaRa, 大连)扩增各目的
基因, 反应体系为 25 μL, 其中 PrimerSTAR Max Premix
12.5 μL、正反引物各 1 μL、cDNA 1 μL、灭菌蒸馏水 9.5
μL。PCR循环参数为 98℃ 2 min; 98℃ 10 s; 退火 15 s; 72
℃ 30 s; 35个循环; 72℃ 10 min (表 1)。PCR产物经 1.5%
琼脂糖凝胶电泳后回收目的产物, 与 pEASY-Blunt Simple
克隆载体(TRANSGEN, 北京)连接后转入大肠杆菌DH5α,
将 PCR鉴定的阳性克隆送华大基因公司测序。
1.3 基因序列分析
利用 DNAStar 软件分析基因编码框及其推导编码氨
基酸 , 在美国国家生物技术信息中心(NCBI, http://blast.
ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、芸薹属基因组数据库(BRAD,
http://brassicadb.org/brad/blastPage.php)和拟南芥信息资源
数据库 (TAIR, 网址 : http://www.arabidopsis.org/wublast/
index2.jsp)利用 BlastN在线软件分析基因序列相似性。用
NCBI 网站 BlastP 软件和 PROSITE (http://prosite.expasy.
org/)在线软件分析基因编码蛋白保守的结构域和功能位
点 , 利用 SignalP (网址 : http://www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP/)在线软件分析蛋白信号肽序列 , 通过 Predict
Protein (http://www.predictprotein.org/)在线软件预测蛋白
亚细胞定位。
表 1 基因扩增引物
Table 1 Primers for genes amplification
基因名称
Gene name
引物名称及序列 Primer sequence (5–3) 退火温度
Tm (℃)
BoEo70A1 70S: ATGGCCGTCGATAGCCGAATG 70AS: TTTACCGTCGTGGTTCGTTCATAG 59
BoSEC3 3S: ATGGCGAAATCAAGCGCGGAC 3AS: AACCCCAGGAACGTTTTCACTAGG 58.5
BoSEC10 10S: ATGACAGAAGGAATGAGAGGAGCAAG 10AS: CAGTTGAATAAACCTTTGCGCGTC 57.5
BoSEC15 15S: GAGGTCTGCAAAGCTCACTACCAGG 15AS: ATCTCTCAATCTCTTTATCAACGTGTC 57
BoSEC84 84S: TAGGGAAGATGGCGGCGAAGA 84 AS: TTAATAGCTGCCATGAGATCTCG 58
974 作 物 学 报 第 41卷
1.4 酵母载体的构建和酶切鉴定
依据获取的基因序列, 重新设计 PCR引物并在各引物
上引入相应的酶切位点(表 2), 参照 1.2中的 PCR体系和循
环参数扩增各目的基因片段, 其后对产物直接进行双酶切,
酶切产物后经 1.5%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段, 与同
样酶切的载体片段经 Ligation high T4 DNA连接酶连接后
转化大肠杆菌 DH5α。其中 BoExo70A1 亚克隆至酵母载体
pGBKT7, BoSEC3、BoSEC10、BoSEC15亚克隆至酵母载体
pGADT7。Hála等[14]将 AtExo84亚克隆至载体 pGBKT7, 转
化酵母菌株后有极强的自激活活性, 为避免 BoExo84 自激
活对蛋白质相互作用的影响, 本试验将 BoExo84 拆分为 C
端和 N端 2个片段, 分别亚克隆至载体 pGADT7。获取的
大肠杆菌 DH5α 转化菌株, 经 PCR 鉴定后, 提取质粒进行
双酶切鉴定, 将鉴定正确的菌株送华大公司测序。
表 2 酵母重组质粒构建引物
Table 2 Primers for construction of yeast recombinant plasmid
基因名称
Genes name
引物名称及序列
Primers name and sequences (5–3)
限制性内切酶
Restriction enzyme
酵母载体
Yeast expression vector
BoExo70A1 JM70S: CTGCATATGGATAATGTCGTCTCCATCCTCG JM70AS: AGGTCGACGTTACCGTCGTGGTTCATTCATAG
Nde I
Sal I pGBKT7
BoSEC3 JM3S: CACCCGGGTATGGCGAAATCAAGCGCGGAC JM3AS: ATGGATCCCTCAAACCCCAGGAACGTTTTCACTAGG
Sma I
BamH I pGADT7
BoSEC10 JM10S: CATCGATACATGACAGAAGGAATGAGAGGAGCAAG JM10AS: ATGGATCCCTCACAGTTGAATAAACCTTTGCGCGTC
Cla I
BamH I pGADT7
BoSEC15 JM15S: GCTCATATGGAGGTCTGCAAAGCTCACTACCAGG JM15AS: TGGAATTCTCAATCTCTCAATCTCTTTATCAACGTGTC
Nde I
EcoR I pGADT7
BoSEC84N JM84NS: AGTGAATTCGCGAAGACGGCCAGATCAAAAAGC SEC84NAS: AGCTCGAGCTCAGTTAACTCCATTCGCTAAGCCATG
EcoR I
Xho I pGADT7
BoSEC84C JM84CS: AGTGAATTCCGCATTGAAGAAAACACTGCAGC JM84CAS: AGCTCGAGCTCAATAGCTGCCATGAGATCTCG
EcoR I
Xho I pGADT7
下画线为酶切位点。The restriction enzyme site indicate with underline.
1.5 甘蓝 Exo70A1与 SEC3、SEC10、SEC15、Exo84-N
和 Exo84-C相互作用的酵母双杂交验证
酵母宿主菌 AH109感受态的制备和重组质粒 pGBKT7-
Exo70A1、pGADT7-SCE3、pGADT7-SEC10、pGADT7-
SEC15、pGADT7-Exo84-N以及 pGADT7-Exo84-C的毒性
与自激活检测参照 Matchmaker gal4 two-hybrid system3
(TaKaRa, 大连)操作说明书的步骤进行, pGBKT7-Exo70A1/
pGADT7-SEC3 、 pGBKT7-Exo70A1/pGADT7-SEC10 、
pGBKT7-Exo70A1/pGADT7-SEC15、 pGBKT7-Exo70A1/
pGADT7-Exo84-N 以及 pGBKT7-Exo70A1/pGADT7-Exo84-
C质粒组合转化感受态酵母 AH109参照 Matchmaker gal4
Two-hybrid System3操作说明书中小规模共转化的方法进
行。相互作用的检测方法依据操作说明书调整如下, 将转
化 后 的 AH109 菌 株 分 别 涂 布 在 SD/–Leu/–Trp 、
SD/–Leu/–Trp/–His 固体筛选培养基上 30℃倒置培养; 挑
取 SD/–Leu/–Trp/–His 培养基上的单菌落进行 PCR 鉴定
(表 2); 阳性克隆悬浮于 0.5×YPDA (2 μL)液体培养基中,
混匀后将悬浮液滴在 SD/–Leu/–Trp/– His/–Ade/X-α-gal/25
mmol L–1 3-AT的固体筛选培养基上; 30℃倒置培养 3~5 d,
观察菌落生长情况和颜色变化情况。
2 结果与分析
2.1 基因序列分析
测序结果说明扩增的 BoExo70A1 编码序列为 1917
bp、编码 638个氨基酸, BoSEC3为 2625 bp、编码 875个
氨基酸, BoSEC10为 2430 bp、编码 810个氨基酸, BoSEC15
为 2127 bp、编码 709个氨基酸, BoExo84为 2250 bp, 编
码 749个氨基酸。BlastN结果显示, BoExo70A1包含其从
起始密码子 ATG到终止密码子 TAA的全部序列, 该基因
与 BnExo70A1 (GQ503256)、BoExo70A1 (Bra009523)、
BrExo70A1 (Bra009523)及 AtExo70A1 (AT5G03540.1)的相
似性分别为 99%、99%、97%和 91%; 与 BoSEC3 (Bol044898)
比对, BoSEC3的 3端少了 33个碱基, BoSEC3与 BrSEC3A
(XM009120683) 、 BoSEC3A (Bol044898) 和 AtSEC3A
(AR1G47550.1)相似性分别为 99%、 99%和 93%; 与
BoSEC10 (Bol043500)比对, BoSEC10在 1845 bp处存在 24
个碱基的缺失 , 其 3端少了 66 个碱基 , 与 BraSEC10
(Bra008893)、BoSEC10 (Bol043500)和 AtSEC10 (AT5G12370.1)
相似性分别为 97%、99%和 91%。与 BoSEC15 (Bol006050)
比对, BoSEC15少了 5端的 210个碱基和 3端的 9个碱基,
BoSEC15与 BrSEC15B (Bra036274)、BoSEC15B (Bol006050)、
AtSEC15B (AT4G02350.1)和 AtSEC15A (AT3G56640.1)的
相似应分别为 95%、98%、84%和 61%。BoExo84包含了
其从起始密码子 ATG到终止密码子 TAA的全部序列, 该
基因与 BraExo84B(Bra037951)、BoSEC84B (Bol035257)
和 AtExo84B(AT5G49830.3)的相似性分别为 98%、100%
和 92%。
BlastP 结果表明 BoExo70A1 蛋白第 271 至第 627 位
间氨基酸为 Exo70家族保守结构域, BoSEC3蛋白第 48至
第 144位间氨基酸为 SEC3氮端 PIP2结合 PH结构域, 其
第 6期 高启国等: 甘蓝 BoExo70A1与 BoSEC3、BoExo84蛋白相互作用的酵母双杂交检测 975
第 224至第 868位间氨基酸是 SEC3家族碳端保守结构域,
BoSEC10蛋白第 142至第 810位间氨基酸是 SEC10家族
保守的结构域, BoSEC15蛋白第 368至第 645位间氨基酸
为 SEC15家族蛋白保守的结构域, BoExo84蛋白第 27至
第 110 位氨基酸为 Vps51 家族保守结构域。通过在线
PROSITE 软件分析 BoSEC3 的第 553 至第 565 位氨基酸
为 EF-hand钙离子结合结构域。经过 SignalP 4.1在线软件
分析表明 BoExo70A1、BoSEC3、BoSEC10、BoSEC15和
BoExo84蛋白均没有信号肽, 经 Predict Protein在线软件
预测, BoSEC3、BoSEC15 和 BoExo84 被定位于细胞核,
BoExo70A1和 BoSEC10被定位于细胞质。
2.2 酵母重组质粒的构建与鉴定
将 BoExo70A1编码序列经 Nde I/Sal I双酶切后亚克
隆至 pGBKT7质粒, BoSEC3、BoSEC10和 BoSEC15编码
序列分别经 Sma I/ BamH I、Cla I/ BamH I和 Nde I/ EcoR I
双酶切后亚克隆至 pGADT7 质粒, 将 BoExo84 拆分成 N
端和 C 端连个部分, 其中 N 端包含了第 2 至第 114 位氨
基酸, C端包含了第 369至第 749位氨基酸。重组酵母质
粒双酶切结果(图 1)表明均可以切出载体和目的基因片段,
且片段大小与理论值一致。重组酵母质粒测序结果显示各
目的基因插入位点、插入方向以及编码框均正确, 说明可
以进行后续相互作用验证。
图 1 酵母重组质粒双酶切电泳图
Fig. 1 Double digestion patterns of recombinant plamids
M: Trans2K plus II DNA marker; 1: pGBKT7-BoExo70A1质粒 Nde I/Sal I双酶切; 2: pGADT7-SEC3质粒 Sma I/BamH I双酶切; 3:
pGADT7-BoSEC10质粒 Cla I/BamH I双酶切; 4: pGADT7-BoSEC15质粒 Nde I/ EcoR I双酶切; 5: pGADT7-BoExo84-N质粒 EcoR I/Xhol
I双酶切; 6: pGADT7-BoExo84-C质粒 EcoR I/Xhol I双酶切。
M: Trans2K plus II DNA marker; 1: plasmid pGBKT7-BoExo70A1 digested by Nde I/Sal I; 2: plasmid pGADT7-SEC3 digested by Sma
I/BamH I; 3: plasmid pGADT7-BoSEC10 digested by Cla I/BamH I; 4: plasmid pGADT7-BoSEC15 digested by Nde I/ EcoR I; 5: plasmid
pGADT7-BoExo84-N digested by EcoR I/Xho I; 6: plasmid pGADT7-BoExo84 digested by EcoR I/Xho I.
2.3 酵母重组质粒的自激活与毒性检测
参照酵母双杂交试剂盒说明书将构建的酵母重组质
粒 pGBKT7-Exo70A1、pGADT7-SEC3、pGADT7-SEC10、
pGADT7-SEC15、pGADT7-Exo84-N以及 pGADT7-Exo84-
C 分别转化酵母 AH109 感受态, 其中 pGBKT7-Exo70A1
转化的菌株涂在 SD/–Trp平板上, 其余 5个重组质粒转化
的菌株涂在 SD/–Leu 平板上, 30℃倒置培养 3~5 d, 以
pGBKT7 质粒转化的 AH109 在 SD/–Trp 平板上的菌落作
为对照, 分析重组蛋白对酵母菌落生长影响, 结果表明各
重组质粒转化的酵母菌株在相应的平板上均可以长出菌
落且大小基本一致, 表明表达的 BoExo70A1、BoSEC3、
BoSEC10、BoSEC15、BoExo84-N 和 BoExo84-N 蛋白均
没有毒性 (图 2)。参照酵母双杂交试剂盒说明书 , 将
pGBKT7-Exo70A1 与 pGADT7 空载体、其余 5 个酵母重
组质粒分别与 pGBKT7空载体组合共转化酵母 AH109感
受态, 转化后的菌液涂在 SD/–Trp/–Leu/X-α-Gal 平板上,
30℃倒置培养 3~5 d, 以酵母试剂盒附带的阳性和阴性对
照质粒组合转化平板为参照, 观察菌落的显色情况, 结果
(图 3)显示只有阳性对照质粒组合转化后的菌株显蓝色,
其余的全部为白色菌落 , 说明表达的 BoExo70A1、
BoSEC3、BoSEC10、BoSEC15、BoExo84-N和 BoExo84-N
蛋白均没有自激活活性。
2.4 甘蓝 Exo70A1与 SEC3、SEC10、SEC15、Exo84-N
和 Exo84-C相互作用检测
将酵母重组质粒 pGBKT7-Exo70A1分别与 pGADT7-
SEC3、pGADT7-SEC10、pGADT7-SEC15、pGADT7-
Exo84-N 以及 pGADT7-Exo84-C 两两组合后转化酵母
AH109感受态, 涂在 SD/–Leu/–Trp培养基上, 30℃倒置培
养 3~5 d, 提取菌落用通用引物进行 PCR检测, 选取能扩
出 2个目的基因条带且直径大于 2 mm的菌落, 通过改良
的方法转接到 SD/–Leu/–Trp/–His/–Ade/X-α-gal/25 mmol
L–1 3-AT的固体筛选培养基上; 30℃倒置培养 3~5 d, 观察
菌落生长情况和颜色变化情况。结果表明阳性对照、
pGBKT7-Exo70A1/pGADT7-SEC3、pGBKT7-Exo70A1/
pGADT7-Exo84-N 组合转化的菌株在 SD/–Leu/–Trp/–His/–
Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT 平板上菌落能生长, 且菌
落呈现蓝色 (图 4) , 说明 BoExo70A1 与 BoSEC3、
BoExo70A1与 BoExo84-N之间能相互作用; 而 pGBKT7-
Exo70A1/pGADT7-SEC10、pGBKT7-Exo70A1/pGADT7-
SEC15 以及 pGBKT7-Exo70A1/pGADT7-Exo84-C 的 3 对
976 作 物 学 报 第 41卷
图 2 酵母重组质粒毒性检测
Fig. 2 Test of toxicity of yeast recombinant plasmids
1: pGBKT7酵母转化子在 SD/–Trp平板; 2: pGBKT7-BoExo70A1酵母转化子在 SD/–Trp平板; 3: pGADT7-BoSEC3酵母转化子在
SD/–Leu平板; 4: pGADT7-BoSEC10酵母转化子在 SD/–Leu平板; 5: pGADT7-BoSEC15酵母转化子在 SD/–Leu平板上;
6: pGADT7-BoExo84-N酵母转化子在 SD/–Leu平板; 7: pGADT7-BoExo84-C酵母转化子在 SD/–Leu平板。
1: pGBKT7 yeast transformants on SD/–Trp plate; 2: pGBKT7-BoExo70A1 on SD/–Trp plate; 3: pGBKT7-BoSEC3 on SD/–Leu plate;
4: pGBKT7-BoSEC10 on SD/–Leu plate; 5: pGBKT7-BoSEC15 on SD/–Leu plate; 6: pGBKT7-BoExo84-N on SD/–Leu plate;
7: pGBKT7-BoExo84-C on SD/–Leu plate.
图 3 酵母重组质粒自激活检测
Fig. 3 Test of autoactivation for yeast recombinant plasmids
1: pGBKT7-p53×pGADT7-T, 2: pGBKT7-Lam×pGADT7-T; 3: pGBKT7-BoExo70A1×pGADT7; 4: pGBKT7×pGADT7-BoSEC3;
5: pGBKT7×pGADT7-BoSEC10; 6: pGBKT7×pGADT7-BoSEC15; 7: pGBKT7×pGADT7-BoExo84-N; 8: pGBKT7×pGADT7-BoExo84-C.
图 4 酵母中 Exo70A1与其余 5个蛋白相互作用分析
Fig. 4 Analysis of the interaction of BoExo70A1 with the other
five proteins in yeast
1: negative control; 2: positive control;
3: pGBKT7-BoExo70A1×pGADT7-BoSEC3;
4: pGBKT7-BoExo70A1×pGADT7-BoSEC10;
5: pGBKT7-BoExo70A1×pGADT7-BoExo84-C;
6: pGBKT7-BoExo70A1×pGADT7-BoSEC15;
7: pGBKT7-BoExo70A1×pGADT7-BoExo84-N.
组合与阴性对照转化的酵母菌株一样在 SD/–Leu/–Trp/–
His/–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT 平板上均不能生长,
且由于不能激活下游 Ade 基因的表达导致菌落呈现微微
的红色(图 4), 表明 BoExo70A1 与 BoSEC10、BoSEC15
和 BoExo84-C蛋白均不能相互作用。
3 讨论
在自交不亲和信号传导分子机制的研究中 , Samuel
等[9]过量表达 ARC1 互作蛋白 Exo70A1 部分打破材料的
自交不亲和性, 反义干扰 Exo70A1 表达会降低柱头接受
亲和花粉的能力, 表明 Exo70A1 可能是自花和异花在柱
头内引发的 2种信号通路的交叉点。通过透视电镜观察结
果显示 Exo70A1 参与了拟南芥和琴叶拟南芥柱头乳突细
胞内可分泌型囊泡以及油菜柱头乳突细胞内多泡体向细
胞质膜的运输和富集过程调控 , 自交不亲和信号传导过
程可能通过 ARC1 泛素化降解 Exo70A1 蛋白, 进而使不
亲和授粉后柱头乳突细胞内可分泌型囊泡或者多泡体分
布在细胞质 , 而不能向花粉结合位点的细胞质膜运输和
第 6期 高启国等: 甘蓝 BoExo70A1与 BoSEC3、BoExo84蛋白相互作用的酵母双杂交检测 977
富集[10]。高湿环境能部分恢复拟南芥 Exo70A1 突变体接
受亲和花粉能力的研究结果 , 进一步表明该蛋白参与柱
头乳突细胞水分分泌和花粉水合过程的调控[11]。Iwano 等[15]
研究表明异花授粉将会引发自交不亲和芜菁柱头乳突细
胞内肌动蛋白聚合 , 而自花授粉将导致肌动蛋白的重组
和解聚, 肌动蛋白解聚药品细胞松弛素 D 处理后将会抑
制亲和花粉的水合和萌发 , 同时自花授粉将扰乱柱头乳
突细胞内液泡分布 , 而异花授粉后将引起液泡向花粉结
合位点重新排列 , 表明肌动蛋白的聚合与解聚可能直接
影响了柱头乳突细胞内囊泡的运输。本试验获取了甘蓝胞
泌复合体 BoExo70A1、BoSEC3、BoSEC10、BoSEC15和
BoExo84 亚基编码序列 , 并利用酵母双杂交技术证明
BoExo70A1与 BoSEC3、BoExo84-N相互作用。
在出芽酵母中, SEC3 可以作为细胞质膜上极性分泌
位点的标志[16], SEC3和 Exo70两个亚基通过非肌动蛋白
束依赖的方式定位在细胞质膜上 , 其余的胞泌复合体亚
基与可分泌型囊泡束缚在一起, 并在肌球蛋白 V 型蛋白
Myo2p 作用下沿着肌动蛋白束移动, 一旦可分泌型囊泡
被移动到肌动蛋白束末端 , 与囊泡束缚在一起的胞泌复
合体亚基与定位在细胞质膜上的 SEC3和 Exo70亚基作用,
进而将可分泌型囊泡束缚在细胞质膜上[17-18]。在裂殖酵母
中, SEC3 和 Exo70 均可以将其他胞泌复合体亚基定位在
细胞质膜上, 且两者具有功能冗余性[19]。但是与出芽酵母
中 SEC3和 Exo70亚基独立于胞泌复合体, 提前定位在细
胞质膜上不同的是, 裂殖酵母中包括 SEC3和 Exo70在内
的所有胞泌复体亚基与可分泌型囊泡束缚在一起 , 在肌
球蛋白 V 型蛋白作用沿着肌动蛋白束移动, 进而将可分
泌型囊泡定位在细胞质膜特定位点上[19]。上述两种类型
的酵母研究结果表明, SEC3 和 Exo70 亚基在可分泌型囊
泡束缚在细胞质膜特定位点过程中起了关键作用 , 且两
种酵母中胞泌复合体运输囊泡的过程都依赖于肌动蛋白
束。此外, 出芽酵母中 Exo84蛋白对于胞泌复合体的聚合
以及极性定位均起了关键作用[20]。
参照上述酵母中胞泌复合体运输可分泌型囊泡调控
机制的研究结果, 下一步研究的重点是利用透视电镜[11]、
罗丹明鬼笔环肽染色[15]和荧光蛋白标记[21]的方法分别观
察自交不亲和甘蓝自花和异花授粉后柱头乳突细胞内可
分泌型多泡体、肌动蛋白和胞泌复合体各亚基分布的动态
变化, 以便深入解析 BoExo70A1 乃至整个胞泌复合体各
亚基在柱头响应自花和异花授粉过程中的作用机制。
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