全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(4): 539547 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31301394)和石河子大学优秀青年科技人才培育计划项目(2012ZRKXYQ-YD10)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘永昌, E-mail: liuyongchang2003@126.com, Tel: 18799292449
第一作者联系方式: E-mail: lyj20022002@sina.com.cn, Tel: 18999334674
Received(收稿日期): 2014-09-18; Accepted(接受日期): 2015-02-06; Published online(网络出版日期): 2015-03-02.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150302.0301.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00539
陆地棉 Ghkinesin13亚家族基因的克隆及表达特征分析
赵兰杰 1 薛 飞 2 朱守鸿 2 李艳军 2 刘永昌 2, 孙 杰 2
1石河子大学生命科学学院, 新疆石河子 832003; 2石河子大学农学院 / 新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室, 新疆石河子 832003
摘 要: Kinesin家族是一类马达蛋白, 它们能利用 ATP水解所释放的能量驱动自身携带物质分子沿着微管运动, 在
细胞形成、细胞伸长等方面起着关键作用。本研究以拟南芥 Atkinesin-13A 蛋白序列作为探针序列, 利用 Blast 比对
从二倍体雷蒙德氏棉的基因组数据库中发现 7 个具有较高同源关系的基因。根据基因序列设计引物, 利用 RT-PCR
技术从陆地棉纤维中分离出 7个基因。依据 7个基因与 Atkinesin-13A和 Atkinesin-13B的同源性高低, 依次将其命名
为 GhKIS13A1、GhKIS13A2、GhKIS13A3、GhKIS13B1、GhKIS13B2、GhKIS13B3和 GhKIS13B4。生物信息学分析表
明, 7个 Ghkinesin13均含有典型的 KISC马达区域、ATP结合位点和微管结合位点, 其马达区域属于中央马达。多重
序列比对和进化树分析发现, 这 7 个蛋白可被分为 2 个(Kinesin13A 和 Kinesin13B)亚类。实时荧光定量 PCR 结果表
明, 7 个 Ghkinesin13 亚家族基因在棉花各组织中均有表达, 但表达模式各不相同, 其中 GhKIS13B4 在纤维中优势表
达, 表明其在纤维发育过程中可能发挥着重要作用。
关键词: 棉花; 纤维; 驱动蛋白; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Ghkinesin13 Subfamily Genes in Gossy-
pium hirsutum
ZHAO Lan-Jie1, XUE Fei2, ZHU Shou-Hong2, LI Yan-Jun2, LIU Yong-Chang2,*, and SUN Jie2
1 College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, China; 2 Agricultural College of Shihezi University / The Key Laboratory of Oasis
Eco-agriculture Xinjiang Production and Construction Group, Shihezi 832003, China
Abstract: Kinesin family belongs to a class of motor proteins. Kinesins can move along microtubule filaments by using the en-
ergy released from ATP hydrolysis, and play key roles during cell formation and cell elongation. Using the protein sequence of
Atkinesin-13A as a probe, seven genes with high sequence homology were obtained from a genome database of Gossypium rai-
mondii diploid cotton with Blast alignment. These sequences were used to design primers, and then seven genes were isolated
from upland cotton fiber using RT-PCR. Based on the homology level of the seven genes with Atkinesin-13A and Atkinesin-13B,
we designated them as GhKIS13A1, GhKIS13A2, GhKIS13A3, GhKIS13B1, GhKIS13B2, GhKIS13B3, and GhKIS13B4 respec-
tively. Bioinformatic analysis showed that seven proteins contained typical KISC domains including the central motor, ATP-
binding sites and microtubule binding sites. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis revealed that seven pro-
teins can be divided into Kinesin13A and Kinesin13B. The qPCR showed that the seven Ghkinesin13 subfamily genes expressed
in all tissues of cotton, but showed different expression patterns. Of the seven genes, only GhKIS13A4 was preferentially ex-
pressed in fibers, suggesting that it may play an important role in cotton fiber development.
Keywords: Cotton; Fiber; Kinesin; Expression analysis
我国是世界上最大的棉花生产和消费国, 棉纤
维是纺织工业的主要原料, 其品质优劣直接决定纺
织品的质量和效益。因此, 提高棉纤维的品质一直
是棉花育种的主要目标。棉纤维是由胚珠表皮细胞
分化、发育而形成的单细胞, 其形成和发育过程可
分为纤维原始细胞分化和突起、纤维伸长、次生壁
增厚和脱水成熟4个时期[1]。在纤维发育的各个时期
都有大量基因对其发育起调控作用, 了解棉纤维发
540 作 物 学 报 第 41卷
育的调控机制对提高棉纤维品质具有十分重要的理
论意义。到目前为止, 已从棉纤维中筛选并克隆了
多个棉纤维发育相关基因, 这些基因在棉纤维发育
过程中特异或优势表达, 其中少数基因已被证实对
纤维发育起一定的调控作用, 如GhRGP1、GhBIN2、
E6、KATANIN、WRINKLED12-5等。但是, 更多的调
控纤维发育的关键基因有待分离鉴定。驱动蛋白
(Kinesin)是一类蛋白质超级家族, 属于分子马达的
一种。驱动蛋白能够利用ATP水解所释放的能量驱
动自身所携带的分子, 将微管作为运动轨道定向移
动, 并能对微管的动态变化产生影响[6]。它们在胞内
运输、有丝分裂、信号转导、细胞形成等方面起着
至关重要的作用[7-10]。驱动蛋白家族包含14个亚家族,
不同种类的驱动蛋白对应着不同的工作机制、结构
和物质束缚力[11]。对植物Kinesin基因的功能研究大
多来自模式植物, 水稻和拟南芥基因组中分别发现
41个和61个Kinesin基因[12-15]。目前, 棉花中仅克隆
了4个Kinesin基因。GhKCBP呈串珠状模式点缀于周
质微管, 可能在棉纤维发育过程中微管陈列动态重
组时发挥作用[16]; GhKCH1含有与微丝结合的结构
域, 在体外能与微丝结合, 在棉纤维细胞中表现为
与微管共定位, 在某些部位也与微丝共分布, 可能
在微丝、微管的动态分布中起重要调节作用 [ 1 7 ] ;
GhKCH2具有与微管和微丝的双重结合能力, 可能
作为动态桥梁在2种细胞骨架系统同时参与的细胞
活动中发挥重要作用[18]; Ghkinesin-13A定位于高尔
基体上[19], 没有进一步的研究报道。近期的功能研
究发现Kinesin13亚家族成员在细胞形成过程中发挥
着重要作用。邓祝云等[20]通过诱变筛选获得一个籽
粒变圆的水稻突变体sar1, 进一步的缺失和互补分
析显示Kinesin13亚家族成员SAR1基因的变异是导
致sar1表型的直接原因。水稻OsSRS3基因编码一个
Kinesin13驱动蛋白, 其突变体srs3籽粒长度变短。
电镜扫描发现突变体srs3种子细胞的数目与野生型
无明显差异, 但细胞的轴向长度明显短于野生型[21]。
拟南芥Atkinesin-13A功能缺失突变导致其叶表皮毛
分叉增多, 由原来的三分支变成四分支[19]。拟南芥
表皮毛和棉纤维发育机制相似, 因此Kinesin-13A在
2种植物中可能具有相同的生物学功能。棉花纤维
细胞形状为直线形、无分支 , 棉花中的Kinesin13
基因在纤维发育中又会有什么样的作用有待研究。
目前棉花中仅分离出 1个K in e s in 1 3亚家族基因
(Ghkinesin13), 为了获得更多该亚家族基因 , 本研
究利用拟南芥Atkinesin-13A蛋白为查询序列, 查询
雷蒙德氏棉基因组数据库, 找到棉花中的Kinesin13
亚家族基因, 并对其序列及在棉纤维中的表达模式
进行分析, 为进一步探索Ghkinesin13亚家族基因在
棉纤维发育中的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及处理
陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种新陆早 33
由石河子大学棉花研究所提供。PCR 反应中所用高
保真 Pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限
公司; pGEM-T Easy Vector试剂盒购自普洛麦格(北
京)生物技术有限公司; 各种限制性内切酶、DNase
I、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)反转录酶
等购自宝生物工程(大连)有限公司 ; SYBR Premix
Ex Taq试剂盒购于TaKaRa公司, 其他试剂均为国产
分析纯。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 TOP10为本
实验室保存。
将棉花种植在石河子大学试验站, 在盛花期挂
牌标记当日花, 随后摘取发育3、6、9、12、15、18、
21、24、27和30 DPA (days post anthesis)棉铃, 室内
剥取纤维 ; 取新陆早33种子 , 剥去种皮后用0.1%
HgCl2浸泡10 min, 灭菌水冲洗3~4次 , 播种于1/2
MS 培养基上, 28℃暗培养4 d, 水培2周后取幼苗的
根、茎、叶; 从田间植株摘取花。将上述材料液氮
速冻后保存于–80℃冰箱, 用于 RNA的提取。
1.2 棉花总 RNA的提取及 cDNA第 1链的合成
采用 CTAB 法提取棉花样品总 RNA[22], 用
DNase I处理后, 利用 ND1000紫外分光光度计测定
OD260和OD280值, 计算 RNA的浓度与纯度。用 1.2%
琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性, 保存于–80℃
备用。cDNA 第 1 链按照大连宝生物工程有限公司
Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)的说明书合成。
1.3 棉花 Ghkinesin13亚家族基因的克隆
利用 http://www.phytozome.net/网站, 以拟南芥
A t k i n e s i n 1 3 A 蛋白序列 ( G e n B a n k 登录号为
AAL07208)作为探针序列, 与二倍体雷蒙德氏棉的
基因组序列进行 Blast比对, 获得 7个具有较高同源
关系的基因(其序列号分别为 Gorai.006G076100.1、
Gorai.006G262200.1、Gorai.011G190700.1、Gorai.
002G059900.1、Gorai.011G075200.1、Gorai.009G
024600.1、Gorai.004G280000.1)。根据 7 个基因与
第 4期 赵兰杰等: 陆地棉 Ghkinesin13亚家族基因的克隆及表达特征分析 541
Atkinesin-13A 和 Atkinesin-13B 的同源性高低, 将它
们分别命名为 GrKIS13A1、GrKIS13A2、GrKIS13A3、
GrKIS13B1、GrKIS13B2、GrKIS13B3和 GrKIS13B4。
根据 7个基因的电子序列, 设计扩增开放阅读框的
引物(表 1), 以陆地棉新陆早 33 棉纤维 cDNA 为模
板进行 PCR扩增, 反应体系含: 10×buffer 2 μL、2.5
mmol L–1 dNTPs 1.6 μL、5 U μL–1 Pfu Taq DNA聚合
酶 0.2 μL、10 μmol L–1上下游引物各 1 μL, 补 ddH2O
至 20 μL。反应程序为 94℃ 5 min; 94℃ 45 s,
52~56℃ 45 s, 72℃ 2.5 min; 重复 30个循环; 72℃延
伸 10 min。PCR产物经 1%琼脂糖电泳检测, 回收目
的片段, 连接至 pGEM-T Easy 载体, 转化大肠杆菌
Top10感受态细胞, 挑取单菌落, 提取质粒进行 PCR
和酶切鉴定, 鉴定正确的质粒送至北京华大基因公
司测序。根据测序结果, 将从陆地棉中克隆得到的 7
个基因与雷蒙德氏棉中的命名相对应 , 分别为
GhKIS13A1、GhKIS13A2、GhKIS13A3、GhKIS13B1、
GhKIS13B2、GhKIS13B3 和 GhKIS13B4。将这些基
因的序列登录至 GenBank, GenBank 序列号为
KP036626至 KP036632。
1.4 棉花 Ghkinesin13亚家族基因生物信息学分析
采用 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)
和 NCBI 中 BlastP 对氨基酸序列进行蛋白质保守区
分析; 采用 WOLF PSORT (http://psort.hgc.jp/)进行
信号肽及亚细胞定位分析; 采用 DOG 2.0软件绘制
蛋白结构域图; 采用 Clustal X和 TreeView软件比对
序列和构建进化树。
1.5 棉花 Ghkinesin13 亚家族基因的实时荧光定
量 PCR分析(quantitative real-time PCR, qPCR)
为了研究棉花 Ghkinesin13 亚家族基因在棉花
不同组织中的表达模式, 根据 7 个基因的 cDNA 序
列, 分别设计 7 对特异性实时荧光定量引物(表 1),
以棉花根、茎、叶、花和不同发育时期的棉纤维 cDNA
为模板进行 qPCR扩增。在罗氏 LightCycler480实时
荧光定量 PCR 仪上进行 qPCR, 反应程序为: 94℃
1 min; 95℃ 15 s, 52~56℃ 20 s, 72℃ 30 s, 45个循环。
3 次重复, 每次实验设置 3 个技术重复, 按照 2–∆∆Ct
法分析结果。
表 1 实验中所用的引物
Table 1 The primers used in the experiment
基因名称
Gene name
扩增 ORF引物名称及序列
Primer name and sequence for PCR (5–3)
qPCR引物名称及序列
Primer name and sequence for qPCR (5–3)
067F CTCCGCCCTGTTGGTAAATA 067QF CTGGTCGAAGGGTAGCAGAG
GhKIS13A1
067R TAGGATCGGGATCTTTGCAC 067QR GGCTCGAAGAACCACCATAA
062F GATCTTCAATCGCCGTCTTC 062QF GGACCAGGCTGTAACTTC
GhKIS13A2
062R CCTTCGTCACCATTAAACAACA 062QR AGAGTAACCTGACGGAAA
019F GAGGCACCGTACGTTGAAAT 019QF TAATGCGACAACTAACTG
GhKIS13A3
019R TGAAGGAGGAGGTGCTTTTG 019QR TACCACAACTTTAATCTTG
020F TAATTGAAGGAAAGCGAGGGGGG 020QF CATCAGATGTGGAGACTATTAAGGAC
GhKIS13B1
020R CGGAAAATCATCCAGCACACAGCTA 020QR CGTAGTATCAGCACCTCGTTCACTTCCG
017F GGGACTGAACAAGGAAAGCGTTG 017QF GACCACAGGTGCAAATGAGGAATCATCCCGA
GhKIS13B2
017R GAATCTGAATCATCCAGCAAACTGCTGCC 017QR GGCTCTTATGCACTCCTTCAAAGCGAGC
092F AACACACCAACCACCACTTACCGGCC 092QF AACAAGAAGCACTGGCACTACT
GhKIS13B3
092R TGGAGTCACAACAGTAAACTAACC 092QR ACGCTCACTTCCAGCAAGATCTATG
042F GATTCTTTTTACGACCGGCGAGTGAG 042QF TAGAGCTCTTGATAATGATCACGGA
GhKIS13B4
042R GGTTCCAGTTGAGCTCCACAAATGCATCAG 042QR GTCCCGAAGATTCGAAGATGAAGATAGCGA
UBIQF CAGATCTTCGTAAAACCCT
UBI —
UBIQR GACTCCTTCTGGATGTTGTA
2 结果与分析
2.1 Ghkinesin13 亚家族基因全长 cDNA 序列的
克隆
利用拟南芥Atkinesin-13A蛋白序列作为查询序
列, 从雷蒙德氏棉中得到 7 个 Kinesin13 亚家族基
因。雷蒙德氏棉基因组中 7 个基因的基因组序列长
度为 5328~7192 bp, 编码区(coding sequence, CDS)
长度为 2115~2727 bp, 编码蛋白序列长度为 704~
908 氨基酸(表 2)。根据 7 个基因的电子序列, 设计
542 作 物 学 报 第 41卷
表 2 Grkinesin13亚家族基因在雷蒙德氏棉基因组数据库中的序列信息
Table 2 Sequence information of Ghkinesin13 subfamily genes in genome database of Gossypium raimondii
序列号
Sequence number
基因名称
Gene name
基因组序列
Genomic
sequence (bp)
转录序列
Transcript
sequence (bp)
CDS序列
CDS sequence
(bp)
蛋白编码序列
Protein sequence
数据库中注释
Annotation in database
Gorai.006G076100.1 GrKIS13A1 7192 3885 2727 908 Kinesin-like protein
Gorai.006G262200.1 GrKIS13A2 5807 3278 2436 811 Kinesin-like protein
Gorai.011G190700.1 GrKIS13A3 6679 3498 2424 807 Kinesin-like protein
Gorai.002G059900.1 GrKIS13B1 5583 2724 2133 710 Kinesin-like protein
Gorai.011G075200.1 GrKIS13B2 6332 2920 2136 711 Kinesin-like protein
Gorai.009G024600.1 GrKIS13B3 5705 2689 2130 709 Kinesin-like protein
Gorai.004G280000.1 GrKIS13B4 5328 2656 2115 704 Kinesin-like protein
扩增 ORF 的引物, 以陆地棉纤维 cDNA 为模板, 分
别进行 PCR 扩增, 克隆获得7个基因的 cDNA 全长
序列(图1)。测序后发现7个基因 cDNA 序列与雷蒙
德氏棉基因组数据库中的序列存在一些碱基差异 ,
这可能是由于这7个基因是以四倍体陆地棉纤维
cDNA 为模板扩增的, 表明雷蒙德氏棉和陆地棉2个
不同的种间核酸序列存在一些差异。将从陆地棉中
克隆得到的 7个基因分别命名为 GhKIS13A1、
GhKIS13A2、GhKIS13A3、GhKIS13B1、GhKIS13B2、
GhKIS13B3和 GhKIS13B4。
图 1 Ghkinesin13亚家族基因 PCR扩增电泳图
Fig. 1 PCR results of Ghkinesin13 subfamily genes
M: marker III; 1~7: GhKIS13B1、GhKIS13B4、GhKIS13B3、
GhKIS13B2、GhKIS13A2、GhKIS13A3和 GhKIS13A1的 PCR
扩增结果。
M: marker III; 1–7: PCR results of GhKIS13B1, GhKIS13B4,
GhKIS13B3, GhKIS13B2, GhKIS13A2, GhKIS13A3, and
GhKIS13A1, respectively.
2.2 Ghkinesin13 亚家族基因编码蛋白的生物信
息学分析
为了进一步确定 7个基因是否属于 Kinesin基因
家族, 利用 SMART在线分析, 结合 NCBI中 BlastP
比对, 对 7个 Ghkinesin13亚家族基因编码产物的氨
基酸序列进行蛋白质保守区分析, 发现 7 个蛋白均
具有 Kinesin 家族典型的 KISC 结构域(马达区), 且
均位于蛋白的中央部位 , 为中央马达蛋白 , 属于
Kinesin13 亚家族成员; 7 个蛋白中 GhKIS13A1、
GhKIS13A2、GhKIS13A3、GhKIS13B1、GhKIS13B2
具有 coiled coil, 其位置如图 2 所示。由 WOLF
PSORT 软件在线预测 7 个 Ghkinesin13 亚家族蛋白
的信号肽及亚细胞定位情况, 表明 GhKIS13A2 和
GhKIS13B1 定 位 在 质 膜 上 , GhKIS13A1 、
GhKIS13A3、GhKIS13B2、GhKIS13B3和GhKIS13B4
定位在内质网上。
2.3 Ghkinesin13 蛋白多重序列比对和蛋白进化
树分析
利用 http://www.phytozome.net/网站进行 Blast
比对发现 GhKIS13A1、GhKIS13A2 和 GhKIS13A3
与 Atkinesin-13A 蛋白序列一致性较高 , 分别为
88%、87.1%、86.9%; GhKIS13B1、GhKIS13B2、
GhKIS13B3 和 GhKIS13B4 与 Atkinesin-13B蛋白序
列一致性较高 , 分别为 90.6%、90.4%、86.1%和
84.3% (表 3)。分析结果表明 GhKIS13A1、GhKIS13A2
和 GhKIS13A3可能属于 Kinesin13A亚家族基因, 因
此命名中含有“A”字母, 而 GhKIS13B1、GhKIS13B2、
GhKIS13B3和 GhKIS13B4可能属于 Kinesin13B亚家
族基因, 因此命名中含有“B”字母。
利用 Clustal X软件将 Ghkinesin13亚家族蛋白
的 KISC 结构域与拟南芥 Atkinesin-13A/B 的 KISC
结构域进行多重序列比较。如图 3 所示 , 7 个
Ghkinesin13 蛋白的 KISC 结构域中均具有微管结合
位点(三角符号所示)和 ATP结合域(星号所示)。
为了明确 7个 Ghkinesin13蛋白与 Kinesin家族
其他蛋白的进化关系, 选取发现的部分植物 kinesin
蛋白, 利用 Tree View软件构建系统进化树。分析发
现 7个蛋白均与已报道的Kinesin13亚家族蛋白聚为
一类。Kinesin13 亚家族的 KISC 属于中央马达, 包
第 4期 赵兰杰等: 陆地棉 Ghkinesin13亚家族基因的克隆及表达特征分析 543
括 Kinesin13A 和 Kinesin13B 两类, GhKIS13A1、
GhKIS13A2和 GhKIS13A3与 Atkinesin-13A蛋白关
系较近, 聚为一类, 而 GhKIS13B1、GhKIS13B2、
GhKIS13B3 和 GhKIS13B4 与 Atkinesin-13B蛋白关
系较近 , 聚为一类 , 进一步明确了 7 个蛋白在
Kinesin家族中的类别。
图 2 Ghkinesin13亚家族蛋白的结构
Fig. 2 Structure of Ghkinesin13 subfamily proteins
黑色和斜线区域分别表示蛋白的 KISC结构域和 coiled coil结构。
Black areas and that filled with oblique lines respectively represent the KISC and coiled coil domain of protein.
表 3 Ghkinesin13与拟南芥 Atkinesin-13A/B氨基酸序列一致性分析
Table 3 Identity analysis of amino acid sequence of Ghkinesin13 and Atkinesin-13A/B
Atkinesin-13A Atkinesin-13B 蛋白名称
Protein name 一致性 Identity (%) E值 E-value 一致性 Identity (%) E值 E-value
GhKIS13A1 88.0 0 78.3 0
GhKIS13A2 87.1 0 77.4 2.9E–179
GhKIS13A3 86.9 0 77.2 2.4E–178
GhKIS13B1 77.7 0 90.6 0
GhKIS13B2 76.9 0 90.4 0
GhKIS13B3 74.6 0 86.1 0
GhKIS13B4 73.8 0 84.3 0
2.4 Ghkinesin13 亚家族基因在棉花不同组织中
的表达特征分析
为研究 7个Ghkinesin13亚家族基因在棉花中表
达模式, 对棉花根、茎、叶、花以及不同发育时期
纤维中的表达模式进行了实时荧光定量 PCR 分析,
如图 5所示, 7个 GhKinesin13亚家族基因在根、茎、
叶、花和纤维中均有表达, 但表达模式各不相同。
GhKIS13A1、GhKIS13A3、GhKIS13B1、GhKIS13B2
和 GhKIS13B3在叶中优势表达, 其中 GhKIS13A1、
GhKIS13A3、GhKIS13B1 在花中表达量也较高 ,
GhKIS13B3 在茎中表达量也较高。GhKIS13A2、
GhKIS13A3、GhKIS13B2和 GhKIS13B3在纤维中的
表达量呈现先升高再降低的趋势 , GhKIS13A1、
GhKIS13B1和 GhKIS13B4在纤维中的表达呈现上升
趋势。GhKIS13A2、GhKIS13B3在 27 DPA纤维中表
达量明显较高, GhKIS13A1和 GhKIS13B1在 30 DPA
纤维中表达量明显较高, 但在其他时期表达量均较
低; GhKIS13A3和GhKIS13B2在纤维中的表达量明显
低于在其他器官中, 因此 GhKIS13A1、GhKIS13A2、
GhKIS13A3、GhKIS13B1、GhKIS13B2和 GhKIS13B3
在纤维中均没有表达优势。7个基因中仅有 GhKIS13B4
在纤维中优势表达, 在纤维中的表达量明显高于在
其他器官中, 其表达量随着纤维的发育逐渐升高, 暗
示其在纤维发育过程中可能发挥着重要作用。
544 作 物 学 报 第 41卷
图 3 Ghkinesin13与拟南芥 Atkinesin-13A/B蛋白的 KISC结构域多重序列比对
Fig. 3 Amino acid sequences alignment of Ghkinesin13 and Atkinesin-13A/B protein
星号表示 ATP结合位点; 三角符号表示微管结合位点, 所用序列包括 Atkinesin-13A (拟南芥, AAL07208)和 Atkinesin-13B (拟南芥,
AAK96543)。
The letters marked with asterisks represent the ATP-binding sites; the letters marked with triangle represent the microtubule binding sites. The
sequences used are Atkinesin-13A (Arabidopsis thaliana, AAL07208) and Atkinesin-13B (Arabidopsis thaliana, AAK96543).
3 讨论
Kinesin 是一类蛋白质超级家族, 是与微管结合
而起运输作用的马达蛋白。根据结构特征及氨基酸
序列同源性, 将 Kinesin 分为 14 大类, 即 Kinesin1
至 Kinesin14亚家族[23-24]。14个 Kinesin亚家族蛋白
中, Kinesin1至 Kinesin12亚家族的马达区位于肽链
的 N-末端, 为 N-末端马达蛋白; Kinesin14亚家族的
马达区位于肽链的 C-末端 , 为 C-末端马达蛋白 ;
Kinesin13 亚家族的马达区位于肽链的中央, 为中央
马达蛋白[23]。本研究利用拟南芥 Atkinesin-13A蛋白
序列作为探针序列, 从二倍体雷蒙德氏棉的基因组
数据库中发现 7个 Kinesin13基因, 并从陆地棉中分
离了相应的 7 个基因。序列分析发现 7 个基因编码
的蛋白长度各异, 均具有 Kinesin 家族典型的 KISC
结构域(马达区), 且均位于蛋白的中央部位, 本研究
使我们掌握了棉花中 Kinesin13 亚家族基因的存在
情况和结构特征。
qPCR分析发现, 7个 Kinesin基因在棉花各组织
中均有表达, 但表达模式各不相同。7个基因中仅有
GhKIS13B4 在纤维中优势表达, 可选作目标基因转
化棉花改良棉纤维的品质。研究中还发现 7 个
第 4期 赵兰杰等: 陆地棉 Ghkinesin13亚家族基因的克隆及表达特征分析 545
图 4 Ghkinesin13与其他 Kinesin蛋白的进化树分析
Fig. 4 Phylogenic relationship of Ghkinesin13 and other Kinesin proteins
所用序列包括: AtKCBP/Kinesin-14 (拟南芥, AAC37475), GhKCBP/Ghkinesin-14 (陆地棉, AAP41107), Ghkinesin-13A (陆地棉,
AAQ18797), Atkinesin-13A (拟南芥, AAL07208), Atkinesin-13B (拟南芥, AAK96543), Atkinesin-12A (拟南芥, AAF78893), Atkinesin-12B
(拟南芥, AEE76799), AtK1/Kinesin-1 (拟南芥, BAA01972), AtNACK1/Kinesin-7 (拟南芥, BAB88748), AtNACK2/Kinesin-7 (拟南芥,
BAC03248), OsNACK1/Kinesin-7 (水稻, BAB86283), GhKCH1/Kinesin-14 (陆地棉, AAW03152), GhKCH2/Kinesin-14 (陆地棉,
ABO28522), OsSRS3-13A (水稻, EEE62380), Zmkinesin-1 (玉米, DAA35856), OsKCH1/Kinesin-14 (水稻, NP_001066967), At-
FRA1/Kinesin-4 (拟南芥, AAN86114)。
The sequences used are AtKCBP/Kinesin-14 (Arabidopsis thaliana, AAC37475), GhKCBP/Ghkinesin-14 (Gossypium hirsutum, AAP41107);
Ghkinesin-13A (Gossypium hirsutum, AAQ18797), Atkinesin-13A (Arabidopsis thaliana, AAL07208), Atkinesin-13B (Arabidopsis thaliana,
AAK96543), Atkinesin-12A (Arabidopsis thaliana, AAF78893), Atkinesin-12B (Arabidopsis thaliana, AEE76799), AtK1/Kinesin-1 (Arabi-
dopsis thaliana, BAA01972), AtNACK1/Kinesin-7 (Arabidopsis thaliana, BAB88748), AtNACK2/Kinesin-7 (Arabidopsis thaliana,
BAC03248), OsNACK1/Kinesin-7 (Oryza sativa, BAB86283), GhKCH1/Kinesin-14 (Gossypium hirsutum, AAW03152),
GhKCH2/Kinesin-14 (Gossypium hirsutum, ABO28522), OsSRS3-13A (Oryza sativa, EEE62380), Zmkinesin-1 (Zea mays, DAA35856),
OsKCH1/Kinesin-14 (Oryza sativa, NP_001066967), AtFRA1/Kinesin-4 (Arabidopsis thaliana, AAN86114).
Kinesin13 基 因 中 GhKIS13A2 、 GhKIS13A3 、
GhKIS13B2和 GhKIS13B3在 27 DPA纤维中表达量
最高, GhKIS13A1、 GhKIS13B1和 GhKIS13B4在 30
DPA纤维中表达量最高。27、30 DPA为纤维发育次
生壁合成期, 7 个基因均在该时期表达量高, 表明
Kinesin13亚家族基因可能在纤维发育的次生壁合成
期发挥重要作用。
棉花中已报道 4个Kinesin基因, 其中GhKCBP、
GhKCH1 和 GhKCH2 属于 Kinesin14 亚家族成员,
Ghkinesin-13属于 Kinesin13亚家族成员。Kinesin14
亚家族基因常与微管或微丝共定位 , 棉纤维中的
Kinesin14 蛋白可能通过调控微管和微丝的排向和
动态分布 , 进而影响纤维的伸长和次生壁的合成 ,
改变纤维的品质[16-18]。与 Kinesin14的工作机制不同,
Kinesin13 亚家族蛋白常与高尔基体共定位, 可能参
与调控高尔基体的结构、功能和分布。免疫荧光和
免疫金标实验发现烟草 Ntkinesin-13 定位于高尔基
体的囊泡膜上[25]。Atkinesin-13A在拟南芥的各细胞
中与高尔基体共定位。Atkinesin-13A缺失突变后, 拟
南芥根冠分泌活动旺盛的细胞中高尔基体的囊泡变
得小而少[26]。Atkinesin-13A 突变体表皮毛中高尔基
体呈现聚集现象, 而高尔基体的分布对表皮毛的形
态发生具有调控作用[19]。因此, Atkinesin-13A 可能
是一个参与高尔基体结构、分布和功能调控的驱动
蛋白。棉花 Ghkinesin-13 也定位于相应的高尔基体
上[19], 它可能影响纤维中高尔基体的结构、功能或
546 作 物 学 报 第 41卷
图 5 Ghkinesin13亚家族基因的实时荧光定量 PCR分析
Fig. 5 Relative expression of Ghkinesin13 subfamily genes
R: 根, S: 茎; L: 叶; F: 花; 3~30: 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 DPA纤维细胞。
R: root; S: stem; L: leaf; F: flower; 3–30: fiber cells at 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, and 30 DPA, respectively.
分布 , 进而调控纤维的发育 , 但该基因在纤维发育
过程中的功能有待进一步研究。本研究从纤维中分
离了 7个 Ghkinesin13亚家族基因, 为今后进一步研
究 Ghkinesin13 亚家族基因在棉纤维发育过程中的
功能奠定了基础。
4 结论
从陆地棉中克隆到 7 个 Kinesin13 亚家族基因,
分别命名为 GhKIS13A1、GhKIS13A2、GhKIS13A3、
GhKIS13B1、GhKIS13B2、GhKIS13B3和 GhKIS13B4。
它们编码的蛋白在 704~908 氨基酸之间, 均含有典
型的 KISC 中央马达区域、ATP 结合位点和微管结
合位点, 分为 Kinesin13A 和 Kinesin13B 两个亚类。
它们均在棉花各组织中表达 , 表达模式各不相同 ,
其中 GhKIS13B4 在纤维中优势表达, 在纤维发育过
程中可能发挥着重要作用。
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