全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(10): 1739−1745 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2011CB1093), 国家自然科学基金项目(31071442), 农业部大豆生物学与遗传育种
创新团队, 国家公益性行业(农业)科研专项(200803060), 江苏省优势学科建设工程专项和国家重点实验室自主课题和国家现代农业
产业技术体系建设专项(CARS-04)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 李艳, E-mail: yanli1@njau.edu.cn; 盖钧镒, E-mail: sir@njau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: 18675827077@126.com
Received(收稿日期): 2013-01-18; Accepted(接受日期): 2013-05-24; Published online(网络出版日期): 2013-07-31.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130731.1820.009.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01739
大豆腺苷酸激酶基因 GmADK的克隆与表达分析
盖江涛 赵团结 李 艳* 盖钧镒*
南京农业大学大豆研究所 / 国家大豆改良中心 / 农业部大豆生物学与遗传育种重点实验室 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室,
江苏南京 210095
摘 要: 腺苷酸激酶(adenylate kinase, ADK)催化 ATP+AMP 2ADP的可逆反应, 是维持细胞能量动态平衡的关键酶,
在植物中参与调节生长发育和逆境应答等过程。目前有关大豆 ADK的研究还未见报道。本文通过 RT-PCR方法, 从
耐盐大豆品种南农 1138-2 的叶中克隆到一个腺苷酸激酶基因, 命名为 GmADK。GmADK 的编码区序列(coding DNA
sequence, CDS)长 804 bp, 编码 267个氨基酸。预测其蛋白结构含有典型的腺苷酸激酶功能域 ATP-AMP(Ap5A)结合
位点和 AMP 结合位点。蛋白序列比对和进化树分析表明, 大豆与菜豆(Phaseolus vulgaris)和蒺藜苜蓿(Medicago
truncatula)中的 ADK 序列相似性最高, 亲缘关系最近。组织表达显示 GmADK 基因的表达量在大豆叶和根中高于茎
中。荧光定量 PCR分析表明 GmADK的表达受盐胁迫的调节, 且在耐盐(南农 1138-2)和盐敏感(科丰 1号)品种间存在
差异。在叶和根中, 200 mmol L–1 NaCl处理 6、12和 24 h后, GmADK的表达量在盐敏感品种中比未处理对照有所降
低, 但在耐盐品种中却比未处理对照升高, 因此推测 GmADK可能参与大豆对盐胁迫的响应。
关键词: 大豆 (Glycine max [L.] Merr.); 腺苷酸激酶; 基因克隆; 盐胁迫
Cloning and Expression Analysis of an Adenylate Kinase Gene GmADK in
Soybean
GAI Jiang-Tao, ZHAO Tuan-Jie, LI Yan*, and GAI Jun-Yi*
Soybean Research Institute / National Center for Soybean Improvement / MOA Key Laboratory for Biology and Genetic Improvement of Soybean
(General) / National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Adenylate kinase (ADK) is an important enzyme in cellular energy homeostasis, which catalyzes the interconversion of
adenine nucleotides, ATP+AMP 2ADP, and is involved in many processes including plant growth, development and response to
abiotic stresses. To date, there has no report on cloning and expression analysis of soybean ADK gene yet. In this study, a soybean
ADK gene was cloned from the leaves of a salt tolerant cultivar NN1138-2 using RT-PCR, and was designated as GmADK. The
coding sequence (CDS) of this cloned ADK gene is 804 bp in length, encoding a polypeptide of 267 amino acids. Its protein was
predicted to be located in plastids, containing a typical ATP-AMP (Ap5A) binding site and an AMP binding site. Multiple se-
quence alignments and phytogenetic analysis of ADK proteins showed GmADK is most similar with ADK from Phaseolus vul-
garis and Medicago truncatula. Tissue expression pattern of GmADK showed its mRNA was more abundant in soybean roots and
leaves than in stems. Quantitative RT-PCR showed a differential expression pattern of GmADK in response to salt between salt
tolerant (NN1138-2) and sensitive (Kefeng-1) soybean genotypes. Compared with untreated plants, the expression of GmADK in
both leaves and roots was repressed after 6, 12, and 24 hours of 200 mmol L–1 NaCl treatment in the salt sensitive cultivar, but
induced in the salt tolerant cultivar, indicating that GmADK might be involved in soybean response to salt stress.
Keywords: Soybean (Glycine max [L.] Merr.); Adenylate kinase (ADK); Gene cloning; Salt stress
1740 作 物 学 报 第 39卷
腺苷酸激酶(adenylate kinase, ADK, EC.2.7.4.3)
是一种磷酸转移酶 , 广泛存在于真核与原核生物
中 [1], 是细胞中一种重要的核苷酸激酶 , 与其他的
磷酸转移酶共同维持细胞中核苷酸的正常含量, 在
能量代谢活动中起着十分重要的作用[2]。目前已知
的 ADK的生化功能主要是催化可逆反应 ATP+AMP
⇔2ADP, 实现 ATP、ADP以及 AMP之间的转化, 从
而调节细胞中能量的动态平衡[3]。这是活细胞的许
多代谢过程中一个重要反应[4], ATP是生物能量代谢
中通用的高能化合物, 为生命的生存和进化提供高
效的细胞能量, 在生命过程中发挥着重要作用。因
此, ADK被认为是一种能量代谢的关键酶[5]。
腺苷酸代谢是初级代谢的重要组成部分, 腺苷
酸类化合物的含量变化被认为是影响细胞代谢的主
要因素之一[6], ADK 作为平衡腺苷酸代谢库的关键
酶, 其表达量直接影响腺苷酸在核酸代谢库和细胞
能量代谢库中的分配[7]。已有证据表明, 腺苷酸水平
及能荷与植物生长、发育有关[8]。在缺氧、能量不
足等逆境条件下, 它们与细胞功能及代谢活性的调
节关系密切[9]。目前在菠菜、小麦、大麦[10]、烟草[11]、
玉米[12]、马铃薯[13]、豌豆[14]、水稻[15] 等很多植物
中都发现了 ADK, 它们存在于细胞液、线粒体、质
体等不同细胞结构中。
越来越多的研究表明, 通过调节ADK在细胞中
的表达量, 可以影响细胞的能量水平。将 ADK基因
表达量控制在较低水平可以破坏腺苷酸代谢库平衡,
使腺苷酸代谢向 ATP 合成的方向进行。国内从 20
世纪 70 年代开始用酿酒酵母发酵生产 ATP [16]。在
植物中的研究表明, 降低ADK酶的活性有利于腺苷
酸库容的增加和 ATP 的积累, 提供生命代谢过程所
需的能量 , 从而增加碳水化合物等物质的积累。
Regierer 等 [13]将来源于马铃薯质体的 ADK 基因
(GenBank 登录号为 AF411937)构建反义表达载体,
利用农杆菌介导法转化马铃薯, 导致转基因马铃薯
块茎中 ADK 的活性降低, 腺苷酸含量增加, 与非转
基因马铃薯对照相比 , 块茎中淀粉含量增加 60%,
块茎产量增加 39%, 增产效果极其显著。将拟南芥
质体中的 ADK基因缺失后, 植株表现出根系生长增
强的特点[17]。Peterson 等[18]用 Ca2+/Na+的两种不同
比率的盐溶液处理玉蜀黍的根与茎, 结果表明调节
腺苷酸代谢的ADK与植物的盐胁迫有重要但较复杂
的关系。Gong 等[19]研究发现在耐旱番茄中 ADK 基
因的表达受干旱胁迫的诱导, 推测番茄 ADK基因与
抗干旱胁迫有关。
大豆是重要的油料作物和植物蛋白来源, 在我
国具有悠久的栽培历史。目前我国面临对大豆需求
的日益增加和全球气候变化而带来的干旱、盐碱地
面积扩大等问题, 如何提高大豆的耐逆性(耐旱、耐
盐等)对提高我国大豆单产具有重要意义。研究表明
腺苷酸激酶ADK与作物的产量和耐逆性相关, 但目
前在大豆中还未见有关 ADK基因的研究报道。本文
通过 RT-PCR法从耐盐大豆品种南农 1138-2 [20]中克
隆大豆的腺苷酸激酶基因 GmADK, 并利用 NaCl 胁
迫和 qRT-PCR 研究 GmADK基因的表达, 为揭示大
豆 ADK 的功能和利用耐盐候选基因进行大豆的分
子育种提供基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
挑取饱满的大豆品种南农 1138-2和科丰 1号的
种子, 接种于MS固体培养基中, 在温度和湿度分别
为 28℃和 60%的人工气候箱中萌发, 当幼苗长出 2
片真叶后移入 Hoagland营养液中。当幼苗长出第一
片三出复叶时, 将幼苗移入含 200 mmol L–1 NaCl的
Hoagland营养液中, 处理 0、6、12、24和 36 h后, 分
别取其根、茎、叶组织, 置液氮速冻后于–80℃保存,
备用。
1.2 cDNA第一链的合成
用 TIANGEN TRIzol 试剂盒提取叶片的总
RNA, 用TaKaRa生物公司的 cDNA第一链合成试剂
盒合成 cDNA。
1.3 GmADK的克隆和半定量 RT-PCR
在大豆数据库 (http://phytozome.net/soybean)中
下载腺苷酸激酶 (ADK)基因的序列 (Glyma03
g33390.1), 用 Primer Premier 5.0软件设计引物从南
农 1138-2的叶中扩增包含 GmADK基因的全长 CDS
序列。GmADK 上游引物为 5′-TTGTTGTGCTGTGC
CTCTCC-3′; 下游为 5′-TCAGATTCCAACACCTCA
TG-3′。以反转录合成的 cDNA 为模板进行 PCR 反
应 , 程序为 : 95℃预变性 5 min, 94℃变性 30 s,
53.4℃复性 50 s, 72℃延伸 1 min, 共 35个循环, 72℃
保温 5 min, 12℃恒温。反应结束后, PCR产物经 1.0%
琼脂糖凝胶电泳, 用凝胶成像系统(Bio-Rad)检测和
记录结果。将 PCR 产物回收后与 T-vector 连接, 转
化大肠杆菌感受态细胞 , 筛选阳性克隆测序
(Invitrogen)。
第 10期 盖江涛等: 大豆腺苷酸激酶基因 GmADK的克隆与表达分析 1741
半定量 RT-PCR 以大豆 β-actin 作为内参基因,
其上游引物为 5′-GTTCTCTCCTTGTATGCAAGT
G-3′; 下游为 5′-CCAGACTCATCATATTCACCTTT
AG-3′。分别提取南农 1138-2 的根、茎、叶组织的
RNA, 用 RT-PCR分析 GmADK的组织表达情况, 从
200 mmol L–1 NaCl处理 0、6、12、24和 36 h后的
组织提取 RNA 进行盐胁迫处理下的半定量表达分
析, PCR反应程序为: 95℃预变性 5 min; 94℃变性 50
s, 60℃退火 50 s, 72℃延伸 40 s, 30个循环; 72℃反应
10 min, 12℃恒温。PCR产物经 1.0%琼脂糖凝胶电
泳, 用凝胶成像系统(Bio-Rad)检测和记录结果。
1.4 GmADK基因序列的分析
用 ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)
分析腺苷酸激酶基因 GmADK 所编码氨基酸序列的
物理性质; TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/
TMHMM-2.0/)预测蛋白质跨膜区结构 ; 应用
SoftBerry 的 ProtComp 9.0 进行亚细胞定位预测 ;
BlastP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和 Phytozome
(http://www.phytozome.net/)进行蛋白 序列比对 ;
ClustalX 1.81和 Genedoc作序列相似性比较; MEGA
5.1进行进化树分析。
1.5 GmADK基因在盐胁迫处理下的表达分析
分别以 200 mmol L–1 NaCl溶液处理南农 1138-2
和科丰 1号 0、6、12、24和 36 h后的样品提取 RNA,
反转录成 cDNA。以反转录的 cDNA为模板, 以大豆
18S rRNA为内参, 进行荧光定量 PCR。GmADK的
上游引物为 5′-AAAGAGTCAGCCTGTGG-3′; 下游
引物为 5′-GCAGATTGCTTCTCCTCATAA-3′。18S
rRNA 的上游引物为 5′-CGGCTACCACATCCAAG
GAA-3′; 下游引物为 5′-GCTGGAATTACCGCGG
CT-3′。PCR反应程序为: 95℃ 5 min; 95℃ 3 s, 60℃ 30
s, 72℃ 30 s, 40个循环。用 2–ΔΔCT法得到 GmADK基
因的相对表达量。通过 SAS软件分析数据。
2 结果与分析
2.1 GmADK基因全长 CDS序列的克隆和分析
2.1.1 GmADK 基因全长 CDS 的克隆 将
RT-PCR 扩增的 GmADK 基因产物用 1%琼脂糖凝胶
电泳, 检测含 GmADK的条带(图 1)。将 PCR产物回
收后与 T-vector连接, 转化大肠杆菌感受态细胞, 筛
选阳性克隆进行测序。序列分析结果表明, 克隆得
到含 804 bp的 GmADK基因全长 CDS, 其核苷酸序
列与大豆数据库 (http://phytozome.net/soybean)公布
的大豆品种Williams 82中 3号染色体上的腺苷酸激
酶等位基因(Glyma03g33390.1)的序列一致。
图 1 大豆 GmADK基因扩增产物
Fig. 1 RT-PCR products of GmADK
2.1.2 GmADK编码的蛋白特性预测 GmADK基
因的全长 CDS编码 267个氨基酸(图 2-A), 其蛋白分
子量为 29.01 kD, 理论等电点 pI为 7.8。该基因产物
在细胞中的高尔基体、线粒体、叶绿体、细胞核、
细胞质、质膜中均有分布, 其中在叶绿体上的分布
最多。TMHMM 预测发现 1 个跨膜区的存在, 推测
GmADK编码的蛋白为跨膜类蛋白。结构预测分析发
现其属于磷-环核苷酸酶超家族(图 2-B), 包含 1 个
ATP-AMP(Ap5A)结合位点和 1 个 AMP 结合位点,
具有典型的 ADK蛋白分子特征[21]。
2.1.3 不同物种的 ADK蛋白序列比较与进化分析
在 NCBI 和 Phytozome 中对 GmADK 编码的蛋
白全序列进行 Blastp 分析, 发现除了来自大豆的 4
条序列外 , 还有多个物种的 ADK 蛋白序列与
GmADK 基因编码的蛋白序列具有较高的相似性 ,
应用生物信息学软件 ClustalX 1.81对与 GmADK蛋
白全序列相似性高的序列进行多重序列比对(图 3),
发现 GmADK 与豆科植物菜豆(Phaseolus vulgaris)
和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的 ADK 序列相
似性最高,分别为 84%和 85%, 与黄瓜(Cucumis sa-
tivus)、苹果(Malus domestica)、蓖麻(Ricinus com-
munis)、木薯 (Manihot esculenta)、杨树 (Populus
trichocarpa)、亚麻(Linum usitatissimum)、葡萄(Vitis
vinifera)的相似性均在 80%或以上, 说明 ADK 基因
在进化中具有一定保守性。为进一步研究腺苷酸激
酶 ADK在不同物种中的进化关系, 用 MEGA 5.1对
与 GmADK 蛋白全序列相似性高的序列绘制了系统
进化树(图 4), 运用最大简约法, 采用 Bootstrap法产
生随机种子自检验 1000次以验证进化树的可靠性。
结果表明 GmADK 与豆科植物菜豆(P. vulgaris)和
蒺藜苜蓿(M. truncatula)中的 ADK蛋白亲缘关系最
近。
1742 作 物 学 报 第 39卷
图 2 GmADK的氨基酸序列(A)及其蛋白功能域预测(B, 引自 NCBI)
Fig. 2 Amino acid sequence of GmADK (A) and its predicted functional domains (B, from NCBI)
2.2 GmADK基因表达的半定量分析
分别以南农 1138-2 的根、茎、叶 RNA 反转录
的 cDNA 为模板, 以 β-actin 为内参基因, 通过半定
量 RT-PCR 进行 GmADK 的组织表达分析。电泳结
果表明, GmADK在根与叶中均有较明亮的扩增条带,
而在茎中的表达量较弱(图 5-A)。用 200 mmol L−1
的 NaCl 溶液处理大豆幼苗 6、12 和 24 h 后, 南农
1138-2根中 GmADK的表达量有所增加(图 5-B), 其
中 12 h达到最大, 盐处理 36 h后 GmADK的表达量
又减弱。
2.3 GmADK 基因在盐胁迫下的实时荧光定量
分析
以大豆基因 18S rRNA 作为内参, 以未处理叶
中 GmADK 基因的表达量作为对照, 进行荧光定量
PCR, 得到 GmADK 基因在盐胁迫下南农 1138-2 和
科丰 1号叶中的相对表达量(图 6-A)。结果表明, 200
mmol L–1的 NaCl溶液胁迫处理下, GmADK基因在
盐敏感品种(科丰 1号)的叶中的表达量在处理的 6、
12、24和 36 h都显著下降(LSD, P < 0.05)。但耐盐
品种(南农1138-2)的叶中 GmADK基因的表达量在处
理的 6、12和 24 h有所增加, 36 h后又降低, 其中盐
胁迫 12 h 后 GmADK 的相对表达量最高(LSD, P <
0.05)。
同样对 GmADK 基因在 2 个品种根中的相对表
达量进行了分析(图 6-B)。200 mmol L–1的 NaCl溶
液胁迫处理下, GmADK基因在盐敏感品种(科丰 1号)
根中的表达量在处理的 6、12、24和 36 h都有所下
降, 其中 6 h和 36 h呈显著性下降(LSD, P < 0.05)。
但耐盐品种(南农1138-2)根中 GmADK基因的表达量
在 6、12和 24 h都比对照增加, 其中 12 h GmADK
的相对表达量最高(LSD, P < 0.05)。
3 讨论
ADK 作为平衡腺苷酸代谢库的关键酶, 其表达
量直接影响腺苷酸在核酸代谢库和细胞能量代谢库
中的分配, 从而影响植物的生长发育及耐逆性。虽
然在多种植物中发现了 ADK [10-15], 但对腺苷酸激
酶在植物中的功能研究却很少, 目前大豆中腺苷酸
激酶的功能研究尚为空白。
本研究克隆的 GmADK 核苷酸序列与公布的大
豆品种Williams 82中第 3染色体上的腺苷酸激酶等
位基因(Glyma03g33390.1)的序列一致。通过大豆数
据库(http://phytozome.net/soybean)同源序列查找,
发现在大豆基因组上有 4 条序列与 GmADK 的相似
性大于 80% (全蛋白序列比对), 包括 1 条 GmADK
的可变剪接序列(Glyma03g33390.2)和 3 条分别位于
第 19、第 13和第 10染色体的序列(Glyma19g36120.1、
Glyma13g19880.1 和 Glyma10g05530.1), 其中
第 10期 盖江涛等: 大豆腺苷酸激酶基因 GmADK的克隆与表达分析 1743
图 3 不同物种 ADK蛋白的多重序列比对(ClustalX 1.81)
Fig. 3 Amino acid sequence alignments of the ADK proteins from different species (ClustalX 1.81)
Glyma: 大豆; Mtr: (XP_003625563.1)蒺藜苜蓿; Pvu: (Phvul.001G173800.1)菜豆; Csa: (Cucsa.065700.1)黄瓜; Mdo: (MDP0000918737)苹
果; Rco: (XP_002525046.1)蓖麻; Mes: (cassava 4.1_013232m)木薯; Ptr: (XP_002316334.1)杨树; Lus: (Lus10040358)亚麻; Vvi:
(CBI25330.3)葡萄。
Glyma: Glycine max; Mtr: Medicago truncatula (XP_003625563.1); Pvu: Phaseolus vulgaris (Phvul.001G173800.1); Csa: Cucumis sativus
(Cucsa.065700.1); Mdo: Malus domestica (MDP0000918737); Rco: Ricinus communis (XP_002525046.1); Mes: Manihot esculenta
(cassava4.1_013232m); Ptr: Populus trichocarpa (XP_002316334.1); Lus: Linum usitatissimum (Lus10040358); Vvi: Vitis vinifera
(CBI25330.3).
1744 作 物 学 报 第 39卷
图 4 GmADK与植物中其他 ADK氨基酸序列的进化树分析
(MEGA 5.1)
Fig. 4 Phylogenetic analysis of GmADK and other plant ADK
amino acid sequences (MEGA 5.1)
Ricinus communis (XP_002525046.1): 蓖麻; Manihot esculenta
(cassava 4.1_013232m): 木薯; Populus trichocarpa
(XP_002316334.1): 杨树; Linum usitatissimum (Lus10040358):
亚麻; Vitis vinifera (CBI25330.3): 葡萄; Eucalyptus grandis
(Eucgr.G02788.1): 巨桉; Malus domestica (MDP0000918737): 苹
果; Cucumis sativus (Cucsa.065700.1): 黄瓜; Medicago truncatula
(XP_003625563.1): 蒺藜苜蓿; Phaseolus vulgaris
(Phvul.001G173800.1): 菜豆; Glyma: Glycine max: 大豆。
图 5 GmADK在南农 1138-2根、茎、叶中的表达(A)及盐胁迫
下南农 1138-2根中的表达(B)
Fig. 5 Expression of GmADK in roots, stems and leaves of
Nannong 1138-2 (A) and in its roots under salt stress (B)
Glyma19g36120.1与 GmADK的相似性最高(93.3%),
这 3 条位于大豆不同染色体的 GmADK 同源序列可
能来自大豆基因组重复事件。此外, GmADK蛋白与
其他物种的ADK具有较高的相似性, 蛋白序列比对
和进化树分析表明 , 大豆与豆科植物菜豆 (Pha-
seolus vulgaris)和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的
ADK 序列相似性最高, 分别为 84%和 85%, 相似性
高于大豆中的 2 条同源序列 Glyma13g19880.1 和
Glyma10g05530.1, 推测大豆中的 GmADK在进化中
可能来源于不同祖先。
对 GmADK 编码的蛋白进行结构预测发现
GmADK包含 1个 ATP-AMP(Ap5A)结合位点和 1个
AMP结合位点, 具有典型的ADK蛋白分子特征, 并
具有典型的ADK活性位点, 因此属于腺苷酸激酶家
族成员。预测还显示 GmADK 具有 1 个跨膜结构区
域, 因此推测该蛋白可能参与细胞膜内外信号传递
等过程。亚细胞定位预测表明 GmADK 在细胞中的
线粒体、叶绿体等质体中均有分布, 其中在叶绿体
上的分布最多。这与前期报道的植物中的 ADK 活
性主要分布于叶绿体基质和线粒体膜间隙中相一
致[22-24]。
迄今关于腺苷酸激酶在植物中的功能报道很
少, 只有 3篇文章研究了 ADK在植物生长发育中的
功能[13,17,25], 另外 3个研究[18,19,26]发现ADK基因的表
达水平受干旱和盐胁迫的调节, 推测 ADK基因与植
物抗逆境胁迫相关。本研究的荧光定量分析表明
GmADK 的相对表达量受盐胁迫的调节, 并在耐盐
和盐敏感品种间存在差异, 初步推测 GmADK 可能
通过调节细胞中的 ATP等能量代谢平衡来参与大豆
的耐盐过程。因此, GmADK可作为一个耐盐的候选
基因进一步验证其功能。GmADK基因内部和附近分
子标记(如 SNP/InDel)的多态性与耐盐性的关联程
图 6 盐胁迫下南农 1138-2、科丰 1号幼苗叶片(A)和根(B)中 GmADK基因的相对表达量
Fig. 6 Relative expression of GmADK in leaves (A) and roots (B) of Nannong 1138-2 and Kefeng-1 under salt stress
误差线表示 3次重复的标准误。分别对 2个品种(南农 1138-2、科丰 1号)作 LSD多重比较分析, 根据 α=0.05对每个品种在盐胁迫不
同时间后的相对表达量分等级, 南农 1138-2的等级用大写字母表示, 科丰 1号的等级用小写字母表示。
Error bars represent the standard error of three replicates. Least Significant Difference (LSD) tests were performed for each cultivar (α=0.05),
the groups were labeled using letters in capital case for Nannong 1138-2 and lower case for Kefeng-1.
第 10期 盖江涛等: 大豆腺苷酸激酶基因 GmADK的克隆与表达分析 1745
度, 以及 GmADK 的表达量是否直接影响大豆的耐
盐性有待进一步研究。GmADK 的克隆和表达分析,
不仅丰富了腺苷酸激酶家族的基因信息, 同时为进
一步研究大豆腺苷酸激酶的功能与耐逆境胁迫之间
的关系奠定了基础。
4 结论
克隆了大豆腺苷酸激酶基因 GmADK。该基因具
有腺苷酸激酶共有的一些特征, 含有典型的腺苷酸
激酶蛋白功能域 ATP-AMP(Ap5A)结合位点和 AMP
结合位点; 大豆根和叶中 GmADK 基因的表达受盐
胁迫的调节 , 且在耐盐和盐敏感品种间存在差异 ,
推测 GmADK基因参与大豆盐胁迫应答过程。
References
[1] Tan Z-W(谭志文), Liu J(刘俊), Zhang X-F(张学芳), Meng
F-G(孟凡国), Zhang Y-Z(张耀洲). Expression, purification and
enzymatic characterization of adenylate kinase of Thermus ther-
mophilus HB27 in Escherichia coli. J Southern Med Univ (南方
医科大学学报), 2010, 30(1): 1–6 (in Chinese with English ab-
stract)
[2] Declerck P J, Muller M. Hydrogenosomal ATP: AMP phosp-
hotransferase of Trichomonas vaginalis. Comp Biochem Physiol
B, 1987, 88: 575–580
[3] Chen B, Sysoeva T A, Chowdhury S, Guo L, Nixon B T. ADPase
activity of recombinantly expressed thermotolerant ATPases may
be caused by copurification of adenylate kinase of Escherichia
coli. FEBS J, 2009, 276: 807–815
[4] Goldberg R N, Tewari Y B, Bhat T N. Thermodynamics of
enzyme-catalyzed reactions—a database for quantitative bioche-
mistry. Bioinformatics, 2004, 20: 2874–2877
[5] Pradet A, Raymond P. Adenine nucleotide ratios and adenylate
energy charge in energy metabolism. Annu Rev Plant Biol, 1983,
34: 199–224
[6] Atkinson D E. The energy charge of the adenylate pool as a
regulatory parameter. Interaction with feedback modifiers.
Biochemistry, 1968, 7: 4030–4034
[7] Schlattner U, Wagner E, Greppin H, Bonzon M. Chloroplast
adenylate kinase from tobacco: purification and partial
characterization. Phytochemistry, 1996, 42: 589–594
[8] Ching T M, Crane J M. Adenylate energy pool and energy charge
in maturing rape seeds. Plant Physiol, 1974, 54: 748–751
[9] Raymond P, Pradet A. Stabilization of adenine nucleotide ratios at
various values by an oxygen limitation of respiration in germinating
lettuce (Lactuca sativa) seeds. Biochem J, 1980, 190: 39–44
[10] Birkenhead K, Walker D, Foyer C. The intracellular distribution
of adenylate kinase in the leaves of spinach, wheat and barley.
Planta, 1982, 156: 171–175
[11] Schlattner U, Wagner E, Greppin H, Bonzon M. Adenylate kinase
in tobacco cell cultures: II. Variability and regulation of isoform
activity patterns in different cell lines. J Plant Physiol, 1994, 144:
400–409
[12] Kleczkowski L A, Randall D D. Equilibration of adenylates by
maize leaf adenylate kinase: effects of magnesium on apparent
and true equilibria. J Exp Bot, 1991, 42: 537–540
[13] Regierer B, Fernie A R, Springer F, Perez-Melis A, Leisse A,
Koehl K, Willmitzer L, Geigenberger P, Kossmann J. Starch
content and yield increase as a result of altering adenylate pools
in transgenic plants. Nat Biotechnol, 2002, 20: 1256–1260
[14] Zancani M, Casolo V, Vianello A, Francesco Macrı̀. Involvement
of apyrase in the regulation of the adenylate pool by adenylate
kinase in plant mitochondria. Plant Sci, 2001, 161: 927–933
[15] Kawai M, Uchimiya H. Biochemical properties of rice adenylate
kinase and subcellular location in plant cells. Plant Mol Biol,
1995, 27: 943–951
[16] Xu B-N(徐柏年), Zhang T-Y(张添元), Luo J-X(罗进贤), Wu
Q(吴青), Wu J-X(吴江雪). Expression of ADK Gene and ATP
Synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Acta Sci Nat Univ
Sunyatseni (中山大学学报⋅自然科学版), 2000, 39(5): 78–81 (in
Chinese with English abstract)
[17] Carrari F, Coll-Garcia D, Schauer N, Lytovchenko A, Palacios-
Rojas N, Balbo I, Rosso M, Fernie A R. Deficiency of a plastidial
adenylate kinase in Arabidopsis results in elevated photosynthetic
amino acid biosynthesis and enhanced growth. Plant Physiol,
2005, 137: 70–82
[18] Peterson T A, Nieman R H, Clark R A. Nucleotide metabolism in
salt-stressed Zea mays L. root tips: I. Adenine and uridine
Nucleotides. Plant Physiol, 1987, 85: 984–989
[19] Gong P, Zhang J, Li H, Yang C, Zhang C, Zhang X, Khurram Z,
Zhang Y, Wang T, Fei Z, Ye Z. Transcriptional profiles of
drought-responsive genes in modulating transcription signal
transduction, and biochemical pathways in tomato. J Exp Bot,
2010, 61: 3563–3575
[20] Chen H-T(陈华涛), Chen X(陈新), Yu D-Y(喻德跃). Inheritance
analysis and mapping quantitative trait loci (QTLs) associated
with salt tolerance during seedling growth in soybean. Chin J Oil
Crop Sci (中国油料作物学报), 2011, 33(3): 231–234 (in Chinese
with English abstract)
[21] Berry M B, Phillips G N Jr. Crystal structures of Bacillus
stearothermophilus adenylate kinase with bound Ap5A, Mg2+
Ap5A, and Mn2+ Ap5A reveal an intermediate lid position and six
coordinate octahedral geometry for bound Mg2+ and Mn2+.
Proteins, 1998, 32: 276–288
[22] Birkenhead K, Walker D, Foyer C H. The intracellular
distribution of adenylate kinase in the leaves of spinach, wheat
and barley. Planta, 1982, 156: 171–175
[23] Hampp R, Goller M, Ziegler H. Adenylate levels, energy charge,
and phosphorylation potential during dark-light and light-dark
transition in chloroplasts, mitochondria, and cytosol of mesophyll
protoplasts from Avena sativa L. Plant Physiol, 1982, 69: 448–
455
[24] Stitt M, Lilley R M, Heldt H W. Adenine nucleotide levels in the
cytosol, chloroplasts, and mitochondria of wheat leaf protoplasts.
Plant Physiol, 1982, 70: 971–977
[25] Lange P R, Geserick C, Tischendorf G, Zrenner R. Functions of
chloroplastic adenylate kinases in Arabidopsis. Plant Physiol,
2008, 146: 492–504
[26] Zhou S P, Wei S, Boone B, Levy S. Microarray analysis of genes
affected by salt stress in tomato. Afr J Environ Sci Technol, 2007,
1: 014–026