全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(9): 1530−1537 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-02-01), 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项和北京市自然科学基金项
目(6112003)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 李明顺, E-mail: mshunli@aliyun.com
第一作者联系方式: E-mail: chenyhj@126.com
Received(收稿日期): 2012-12-18; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-07-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130709.1600.014.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01530
opaque-2 玉米近等基因系的构建与赖氨酸含量快速检测
陈 岩 1 宋丽雅 2 周志强 1 张德贵 1 颜 娜 1 张世煌 1 李新海 1
郝转芳 1 翁建峰 1 白 丽 1 李明顺 1,*
1中国农业科学院作物科学研究所 / 农业部遗传育种重点实验室, 北京 100081; 2北京工商大学 / 北京市植物资源研究开发重点实验
室, 北京 100048
摘 要: 我国高赖氨酸玉米种质资源狭窄, opaque-2 (o2)突变基因能大幅提高玉米赖氨酸含量, 通过分子标记辅助选
择构建 o2玉米近等基因系并检测其赖氨酸含量具有重要意义。其中, 要解决的两个关键问题是如何准确地将不同供
体的 o2突变基因导入受体系和如何快速地检测导入系的赖氨酸含量。本研究利用 O2基因内紧密连锁的 SSR共显性
标记引物 phi057 检测玉米供体和受体自交系的多态性, 利用其特异性和共显性构建 o2 近等基因系; 参考已有研究,
改进染料结合(DBL)法, 测定 18 组构建成功的 o2 近等基因系的赖氨酸含量。结果表明, 不仅在不同供体(CA339 和
山东 2548)之间存在多态性, 而且在不同受体系间也存在多态性, 利用 phi057 能够成功地将不同供体的 o2 突变基因
导入受体系, 构建 o2近等基因系; 改进的 DBL法分析表明, 不同受体系赖氨酸含量变化较大, 不同背景的受体系导
入 o2 突变基因后赖氨酸含量增加的幅度差异也较大; 普通玉米自交系间赖氨酸含量为 0.223%~0.368%, 构建成功的
不同 o2近等基因系间, 赖氨酸含量为 0.373%~0.527%, 与受体亲本相比, 赖氨酸增加幅度最低为 13%, 最高为 74%。
分析表明, phi057能准确筛选导入 o2突变基因的受体系, 结合改进的 DBL法能快速地选择赖氨酸含量高的玉米。
关键词: 高赖氨酸玉米; 分子标记辅助选择(MAS); o2近等基因系; 染料结合法(DBL); 赖氨酸
Construction of Maize opaque-2 Near-isogenic Lines and Rapid Detection of
Lysine Content
CHEN Yan1, SONG Li-Ya2, ZHOU Zhi-Qiang1, ZHANG De-Gui1, YAN Na1, ZHANG Shi-Huang1, LI
Xin-Hai1, HAO Zhuan-Fang1, WENG Jian-Feng1, BAI Li1, and LI Ming-Shun1,*
1 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture,
Beijing 100081, China; 2 Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development / Beijing Technology and Business University, Bei-
jing 100048, China
Abstract: The germplasm of high lysine maize in China is narrow, while the opaque-2 (o2) mutant gene can largely increase the
lysine level in maize, so it is important to create opaque-2 near-isogenic lines (o2-NILs) by molecular marker assisted selection
(MAS). There are two key problems in creating such lines, one is how to introgress the o2 gene into normal receptor lines cor-
rectly, and the other is the fast and convenient way to monitor the lysine content. In our study, the closely linked co-dominant SSR
marker phi057 was used to detect the polymorphism between the maize donor and receptor lines, and the specific and
co-dominant marker was used to construct o2-NILs. Meanwhile, we tested the lysine content of 18th group of o2-NILs by our
own improved dye binding lysine (DBL) method. The results demonstrated that the normal maize inbred lines existed polymor-
phism, moreover, polymorphism also existed among QPM donors CA339 and Shandong 2548, the marker phi057 was effective to
construct o2-NILs, using different QPM donors. The lysine content varied in different genetic backgrounds, which was from
0.223% to 0.368% among normal maize inbred lines, and from 0.373% to 0.527% among o2-NILs. The increment of lysine con-
tent in o2-NILs ranged from 13% to 74%. We included that the SSR marker phi057 can select the mutant genotype of o2 gene
第 9期 陈 岩等: opaque-2玉米近等基因系的构建与赖氨酸含量快速检测 1531


correctly, and the improved DBL method is effective to be used in high lysine maize breeding.
Keywords: High lysine maize; Molecular marker assisted selection (MAS); o2-NILs; Dye binding lysine (DBL); Lysine
玉米(Zea mays L.)是世界上重要的粮食作物。赖
氨酸是重要的氨基酸, 对于人和单胃动物来说, 玉
米赖氨酸等必需氨基酸含量的高低决定了其营养价
值的高低[1-2]。20世纪初发现了 opaque-2(o2)突变玉
米, 1964 年 Mertz 等证明这种突变玉米胚乳赖氨酸
含量比普通玉米胚乳赖氨酸含量高 69% [3]。利用 o2
突变基因提高玉米赖氨酸等必需氨基酸含量, 对玉
米品质改良具有重要意义[4]。
通过分子标记辅助选择把普通玉米自交系转育
为含 o2突变基因的高赖氨酸玉米自交系, 不仅能提
高玉米的营养价值, 而且能扩充优质蛋白玉米种质
资源[5]。1987 年 Schmidt 等利用转座子标签克隆了
O2基因[6], 1989年公布了 O2基因的序列[7], Pioneer
公司[8]和 Missouri 大学[9]开发了 3 对 O2 基因内的
SSR 标记引物, 分别是 phi112、umc1066 和 phi057,
其中 phi057 是共显性标记, 在材料间多态性较好,
适合用于筛选 3 种基因型的植株(O2O2、O2o2 和
o2o2)。phi057扩增片段位于 O2基因第 6外显子上,
已测序玉米自交系 B73 扩增的目的片段大小为 154
bp, 其简单重复序列为 GCC, GCC 重复单元数目的
不同是材料间存在多态性的原因。目前中国农业科
学院在利用分子标记辅助选择将 o2 突变基因导入
普通玉米自交系方面具有成熟的方法[10-14]。在成功
转育的含有 o2 突变基因玉米自交系中, 某些 o2 近
等基因系(辽 2345o2、丹 598o2 等)的赖氨酸含量并
未大幅提高[15]。同时, 也有研究表明 o2突变基因在
不同遗传背景中的作用具有很大的差异, α-醇溶蛋
白变化幅度从降低几倍到基本没有变化[16], 赖氨酸
含量从最高增加 3 倍到增加很少[17-18]。分子标记辅
助选择虽然能够准确地筛选导入纯合 o2o2 基因型
的植株, 但是转育后的不同材料间赖氨酸含量的增
加幅度变化较大, 且不确定, 这给选育赖氨酸含量
高的玉米增加了盲目性。因此, 成功构建 o2近等基
因系后还需要一种快速的方法检测赖氨酸含量, 以
减少高赖氨酸玉米育种的盲目性。
本研究分析玉米分子标记辅助选择构建 o2 近
等基因系的选择流程; 使用本实验室改进的 DBL法
测定 18 组构建成功的 o2 基因近等基因系的赖氨酸
含量。说明不同类型的 o2 供体能成功构建 o2 近等
基因系, 改进的 DBL法能快速有效地衡量材料赖氨
酸含量。
1 材料与方法
1.1 试验材料
两种类型的 o2 基因供体(CA339 与山东 2548),
30 份普通玉米自交系材料, 玉米自交系 K12 (黄早
四改良系 , 属于普通玉米 )构建过程的回交穗子
[(CA339×K12) BC5]F1 和自交穗子 [(CA339× K12)
BC5] F2, 18组分子标记辅助选择构建的 o2近等基因
系均由中国农业科学院作物科学研究所玉米优质抗
逆课题组提供(表 1)。
1.2 试验方法
1.2.1 田间试验 2010 年至 2012 年在北京顺义
和云南元江试验基地种植试验材料。供体材料各种
植 5行, 其余材料种植 1至 2个穗行, 行长 4 m, 株
距 25 cm, 行距 60 cm。
1.2.2 分子标记过程 苗期六叶一心的单株挂牌,
取第 6叶的部分叶片提取 DNA。CTAB法提取 DNA
参考卢振宇等 [19]的方法, 稍加改进, 不进行纯化直
接用于扩增。Taq DNA聚合酶、dNTP等由天根生化
科技(北京)有限公司提供。SSR 标记 phi057 的序列
来自 MaizeGDB, 由北京奥科鼎盛生物科技有限公
司合成, 序列如下: phi057-F: 5′-CTCATCAGTGCC
GTCGTCCAT-3′; phi057-R: 5′-CAGTCGCAAGAAA
CCGTTGCC-3′。
反应体系 20 μL, 含 2 μL 10 × buffer (含 20
mmol L−1 Mg2+)、1 μL dNTP (25 mmol L−1)、引物各
0.3 μL (10 μmol L−1)、0.2 μL Taq DNA聚合酶(2 U
μL−1)、1.5 μL DNA模板和 14.7 μL ddH2O。
降落 PCR反应程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变
性 30 s, 65℃退火 30 s (每个循环−0.5℃), 72℃延伸
36 s, 循环 11个循环; 94℃变性 30 s, 59.2℃退火 30 s,
72℃延伸 36 s, 循环 26 个循环; 72℃延伸 10 min,
12℃保存。
将 PCR 产物加入终浓度为 1×的 loading buffer,
产物不变性, 参考 CIMMYT的 Laboratory Protocols
的实验方法加以改进进行 8%非变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳。
1.2.3 改良 DBL 法测定赖氨酸 主要参考国标
GB4801-84、赵铁男等[20]、郑云兰等[21]、杨文鹏等[22]、
张文龙等[23]的方法, 具体操作如下。
1532 作 物 学 报 第 39卷

表 1 18 组 o2 近等基因系名称和系谱
Table 1 Name and pedigree of 18 groups of o2-NILs
普通玉米自交系
Normal inbred lines
系谱
Pedigree
o2自交系
o2 inbred lines
系谱
Pedigree
SH15

78599选系
Derived from 78599
SH15o2 [(SH15×山东 2548)BC5]F4
[(SH15×Shandong 2548) BC5]F4
中自 01
Zhongzi 01
美国杂交种 78641选系
Derived from U.S. hybrid 78641
中自 01o2
Zhongzi 01o2
[(中自 01×山东 2548)BC5]F4
[(Zhongzi01×Shandong 2548)BC5]F4
辽 3162
Liao 3162
Reid种质
Germplasm of Reid
辽 3162o2
Liao 3162o2
[(辽 3162×山东 2548)BC5]F4
[(Liao 3162×Shandong 2548)BC5]F4
沈 136
Shen 136
美国 78599杂交种选系
Derived from U.S. hybrid 78599
沈 136o2
Shen 136o2
[(沈 136×R60)BC5]F4
[(Shen136×R60)BC5]F4
海 9-21
Hai 9-21
78599等 4个杂交种选系
Derived from 78599 and 4 hybrids
海 9-21o2
Hai 9-21o2
(海 9-21×R60)BC5F4
(Hai 9-21×R60)BC5F4
P138

美国 78599杂交种选系
Derived from U.S. hybrid 78599
P138o2 (P138×山东 2548)BC5F3
(P138×Shandong 2548)BC5F3
中 17
Zhong 17
Mo17改良系
Derived from Mo17
中 17o2
Zhong 17o2
[(中 17×R60)BC5]F4
[(Zhong 17×R60)BC5]F4
辽 3053
Liao 3053
(7922×B68)/5003 辽 3053o2
Liao 3053o2
[(辽 3053×R60)BC5]F4
[(Liao 3053×R60)BC5]F4
lx00-6

Reid种质
Germplasm of Reid
lx00-6o2 [(lx00-6×R60)BC5]F4
E28

A619Ht1×(旅九宽)×旅九宽
A619Ht1×(Lüjiukuan)×Lüjiukuan
E28o2 [(R60×E28)BC5]F4
沈 5003
Shen 5003
美国杂交种 3147
U.S. hybrid 3147
沈 5003o2
Shen 5003o2
[(沈 5003×R60)BC4]F5
[(Shen 5003×R60)BC4]F5
⑦-61

黄改系
Derived from Huangzao 4
⑦-61o2 [(CAL60×⑦-61)BC6]F5
中黄 204
Zhonghuang 204
Mo17改良系
Derived from Mo17
中黄 204o2
Zhonghuang 204o2
[(CAL60×中黄 204)BC6]F5
[(CAL60×Zhonghuang 204)BC6]F5
313

未知
Unknown
313o2 [(313×CA335)BC5]F7
CA156

Pool33选系
Derived from Pool33
CA156o2 [(CA156×QM96)BC3]F7
吉 4112
Ji 4112
朝 23×超甜
Chao 23×Chaotian
吉 4112o2
Ji 4112o2
(吉 4112×QM105)BC3]F7
(Ji 4112×QM105)BC3]F7
昌 7-2
Chang 7-2
(黄早四×潍 95)×S901
(Huangzao 4×Wei 95)×S901
昌 7-2o2
Chang 7-2o2
[(昌 7-2×QM93)BC3]F7
[(Chang 7-2×QM93)BC3]F7
郑 58
Zheng 58
478改良系
Derived from Ye 478
郑 58o2
Zheng 58o2
[(郑 58×QM93)BC3]F5
[(Zheng 58×QM93)BC3]F5
R60、CAL60和 QM材料为优质蛋白玉米自交系 CA339改良系。
R60, CAL60, and QM are quanlity protein maize inbred lines, derived from CA339.

分别吸取 3.89 mmol L−1的AO-12染料溶液 141、
154、167、180、193、206和 219 μL, 分别于 25 mL
容量瓶中, 用磷酸缓冲液定容至刻度, 即得 0.022、
0.024、0.026、0.028、0.030、0.032和 0.034 mmol L−1
的 AO-12染料溶液, 用 FLUOstar OPTIMA-BMG多
功能酶标仪测定 482 nm处吸光度(A), 在 96孔酶标
板上每个孔定量加 400 μL样, 保证均一, 并求吸光
度随染料溶液浓度而变的回归方程。3次重复, 每个
点取 3次重复的平均值, 在 Excel中制作标准曲线。
将玉米种子研磨成粉 , 过 80 目筛 , 80℃烘干
2 h。分别称取酰化与不酰化样 0.0350 g和 0.0250 g,
小心转移到 2.0 mL离心管, 加入 100 μL半饱和醋酸
钠溶液, 在振荡器上振荡 5 min; 然后在酰化样中加
10 μL丙酸酐, 不酰化样中加 10 μL磷酸缓冲液, 振
荡混匀, 在 30℃酰化 20 min; 加入 1000 μL 3.89
mmol L−1酸性橙12染料溶液, 于摇床上 120转 min−1
反应 90 min; 12 000×g离心 10 min, 吸取 500 μL上
清液于 25 mL容量瓶稀释 50倍, 测定吸光度。每个
样测定 3次。
赖氨酸含量 (%)=[(3.89−1.11Cb)/Wb−(3.89−1.11Ca)/
第 9期 陈 岩等: opaque-2玉米近等基因系的构建与赖氨酸含量快速检测 1533


Wa]×1×146.2×10−3×100×10−3
式中 Cb和 Ca代表酰化和不酰化反应剩余染料
浓度, 单位为mmol L−1; Wb和 Wa代表酰化和不酰化
反应样品重量, 单位为 g; 146.2 代表赖氨酸的相对
分子量。
2 结果与分析
2.1 利用 phi057对供体和受体亲本多态性检测
在构建 o2 近等基因系前必须检测供体和受体
亲本间的多态性。不仅受体材料间存在多态性, 而
且 o2供体之间也存在多态性, 如图 1所示, C代表供
体 CA339, S代表供体山东 2548, 1~30分别是 30个
普通玉米自交系。可以看出 phi057扩增出 3种片段
大小不同的条带, C、17、19 是一类, S、3、8、10
是一类, 其余的是一类, 材料间多态性较好。在构建
材料时, 两个供体有隐性纯合的突变基因 o2o2, 其
余普通玉米是显性纯合野生型基因 O2O2, 通过多
态性检测确定杂交组合构建材料, 材料 17 和 19 只
能与山东 2548 杂交, 其余材料均只能与 CA339 杂
交。若 CA339与 17或 19杂交, 则在后代中无法确
定基因型, 材料无法构建, 因此构建材料前亲本多
态性检测是十分必要的。
2.2 利用 phi057检测 K12回交和自交的穗行
在普通玉米自交系 K12转育为高赖氨酸玉米自
交系构建过程中进行 SSR 检测。受体 K12 与供体
CA339杂交, 每代材料都选择杂合个体做母本, K12
为父本进行回交。从图 2可知, 编号 2、3、5、7、9
等为杂合个体, 基因型为 O2o2; 编号 1、4、6、8、
10 等带型和亲本 K12 一致, 是纯合显性个体, 基因
型为 O2O2。23个材料中有 14个杂合个体, 9个显性
纯合个体, 田间去掉显性纯合植株, 留下与亲本株
型一致的杂合植株继续回交或自交。
BC5F1群体中杂合植株自交得到的 BC5F2群体,
由于自交, 玉米籽粒发生透明胚乳和不透明胚乳的
性状分离。一个穗子上共有 203 粒种子, 其中透明
胚乳 158 粒 , 不透明胚乳 45 粒 , 经卡方检验
χ2=0.7241, P 值大于 0.05, 符合孟德尔的 3∶1 的分
离比。图 3 所示是来自同一穗子的 2 行材料, 编号
1~14 是透明胚乳材料, 编号 15~26 是不透明胚乳材
料。SSR 检测结果表明: 与 CA339 带型一致的是隐
性纯合个体, 基因型是 o2o2; 与K12带型一致的是显
性纯合个体, 基因型是 O2O2; 双带型材料是杂合个
体, 基因型是 O2o2。基因型与表型的结果是一致的。
2.3 18组 o2近等基因系 SSR检测确定基因型
构建材料使用的供体都是一些优质蛋白玉米
(QPM)自交系包括 CA339改良系、山东 2548等。供
体材料之间使用 phi057 引物检测也存在多态性, 构
建好的材料带型和供体一致的是成功导入供体的隐
性突变基因, 如图 4所示, 4组材料是以山东 2548为
供体的, 分别是 7和 8、9和 10、11和 12、17和 18,



图 1 引物 phi057 检测 30 个普通玉米自交系和 2 个 o2 供体多态性
Fig. 1 Polymorphism analysis of SSR marker phi057 between 30 normal inbred lines and 2 opaque-2 donors
C: CA339; S: 山东 2548; M: marker; 1~30: 30个普通玉米自交系。
C: CA339; S: Shandong 2548; M: marker; 1–30: 30 normal maize inbred lines.



图 2 分子标记 phi057 对自交系 K12 BC5F1 回交群体基因型检测结果
Fig. 2 Genotype identified results of K12 BC5F1 population
C: CA339; S: 山东 2548; M: marker; 1~23: 23个单株; K: K12。
C: CA339; S: Shandong 2548; M: marker; 1–23: 23 individuals; K: inbred line K12.
1534 作 物 学 报 第 39卷



图 3 分子标记 phi057 对自交系 K12 BC5F2 自交群体基因型检测结果
Fig. 3 Genotype identified results of K12 BC5F2 population
C: CA339; S: 山东 2548; M: marker; 1~26: 26个单株; K: K12。
C: CA339, S: Shandong 2548; M: marker; 1–26: 26 individuals; K: inbred line K12.



图 4 18 组 o2 近等基因系基因型检测
Fig. 4 Test of genotype of 18 groups of o2-NILs
M: marker; 1~6: 供体对照, 分别是 R60、CAL60、QM93、QM96、QM105、山东 2548; 7~42: 18组 o2近等基因系, 分别是 SH15o2、
SH15、中自 01 o2、中自 01、辽 3162 o2、辽 3162、沈 136 o2、沈 136、海 9-21 o2、海 9-21、P138 o2、P138、中 17 o2、中 17、辽
3053 o2、辽 3053、lx00-6 o2、lx00-6、E28 o2、E28、沈 5003 o2、沈 5003、⑦-61 o2、⑦-61、中黄 204 o2、中黄 204、313 o2、313、
CA156 o2、CA156、吉 4112 o2、吉 4112、昌 7-2 o2、昌 7-2、郑 58 o2、郑 58。
M: marker; 1–6: checks of donor, they are R60, CAL60, QM93, QM96, QM105, and Shandong 2548; 7–42: 18 group o2-NILs, namely
SH15o2, SH15, Zhongzi 01 o2, Zhongzi 01, Liao 3162 o2, Liao 3162, Shen 136 o2, Shen 136, Hai 9-21 o2, Hai 9-21, P138 o2, P138, Zhong
17 o2, Zhong 17, Liao 3053 o2, Liao3053, lx00-6 o2, lx00-6, E28 o2, E28, Shen 5003 o2, Shen 5003, ⑦-61 o2, ⑦-61, Zhonghuang 204 o2,
Zhonghuang 204, 313 o2, 313, CA156 o2, CA156, Ji4112 o2, Ji4112, Chang 7-2 o2, Chang 7-2, Zheng 58 o2, and Zheng 58.

7、9、11和 17带型与 6一致, 说明成功导入 6的是
隐性突变基因。其余 14组材料和各自供体和受体相
比, 也表明它们都获得了供体的隐性突变基因。
2.4 18组 o2近等基因系赖氨酸含量变化分析
杨文鹏等[22]分析表明, 染料浓度与透光度存在
对数关系, 与吸光度呈正比, 并且透光度与吸光度
之间关系为对数关系, 建立回归方程 R2值等于 1。
通过吸光度和透光度都能计算染料浓度。本试验采
用不大于 0.1 mmol L−1的低浓度范围, 以染料浓度
为 x轴, 吸光度为 y轴绘制了标准曲线, 3次重复的
R2=0.997 (图 5), 满足分析的要求。
对 18组 o2近等基因系按照改良的 DBL法测定
各自剩余染料的吸光度, 然后代入公式 y=17.80x−
0.044计算剩余染料浓度, 最后代入赖氨酸百分含量
计算公式计算赖氨酸含量, 每个样 3 次重复计算平
均值, 重复间差异不显著, Pr 值为 0.9369, F 值为
0.07, Pr>F。结果如图 6, 普通玉米受体自交系籽粒
赖氨酸含量变化在 0.223%~0.368%之间, 平均值为
0.317%; o2 近等基因系籽粒赖氨酸含量变化在
0.373%~0.527%之间, 平均值为 0.430%。转育过后
得到的 o2 近等基因系与原受体亲本相比, 赖氨酸


图 5 吸光度随染料浓度变化的回归方程
Fig. 5 Regression equation of absorbance and dye concentration

含量的提高幅度变化为 13%~74% (图7)。其中 CA156
自交系选自 Pool33, 属于 QPM自交系, 所以其赖氨
酸含量大于 0.400%, 导入 QM96的突变基因后赖氨
酸含量也维持在 0.400%以上。4组以山东 2548这类
o2为供体的近等基因系赖氨酸平均值为 0.440%, 受
体系赖氨酸含量平均值为 0.315%; 而另外 14 组以
CA339 这类 o2 为供体的近等基因系赖氨酸平均值
为 0.428%, 受体系赖氨酸含量平均值为 0.318%。相
比之下, 山东 2548这类供体对赖氨酸含量的提高幅
度较大, 但是两类供体的差异不显著。
第 9期 陈 岩等: opaque-2玉米近等基因系的构建与赖氨酸含量快速检测 1535




图 6 改良 DBL 法测定赖氨酸含量结果
Fig. 6 Results of lysine content measured by improved DBL method
1: SH15中自 01; 2: 辽 3162; 3: 沈 136; 4: 海 9-21; 5: P138; 6: 中 17; 7: 辽 3053; 8: lx00-6; 9: E28; 10: 沈 5003; 11: ⑦-61; 12: 中黄 204;
13: 313; 14: CA156; 15: 吉 4112; 16: 昌 7-2; 17: 郑 58。
1: SH15 zhongzi 01; 2: Liao 3162; 3: Shen 136; 4: Hai 9-21; 5: P138; 6: Zhong 17; 7: Liao 3053; 8: lx00-6; 9: E28; 10: Shen 5003; 11: ⑦-61;
12: Zhonghuang 204; 13: 313; 14: CA156; 15: Ji4112; 16: Chang 7-2; 17: Zheng 58.



图 7 导入 o2 突变基因后赖氨酸含量提高百分比
Fig. 7 Increment of lysine content after the introgression of
opaque-2 mutant gene
3 讨论
长期以来科学家一直关注玉米品质的改良。
1896 年 Hopkins[24]在美国伊利诺伊大学开始了一项
长期的选择试验, 最后选育出一个蛋白质含量很高
的伊利诺斯高蛋白品种(IHP), 其蛋白质含量为普通
玉米蛋白质含量的 2.5 倍左右, 接近大豆蛋白质含
量的水平。但是所选择的高蛋白玉米主要是醇溶蛋
白含量多, 赖氨酸含量相对较少。20 世纪初遗传学
家发现了 o2突变玉米, o2突变基因虽然能够提高玉
米籽粒赖氨酸含量, 但是存在很多缺陷, 如产量低,
容易感染真菌病害, 籽粒物理性状不利于商业化生
产[25]。QPM 是 CIMMYT 科学家利用胚乳修饰基因
获得的硬质或半硬质胚乳并且赖氨酸含量维持在较
高水平的 o2突变玉米, 在一些发展国家生产中得到
一定的应用。巫永睿等阐明 γ-醇溶蛋白对于硬质胚
乳的修饰是必需的[26], 解释了 o2突变玉米含有突变
基因却保持硬质胚乳的原因。
我国 QPM 种质资源狭窄, 来自 CIMMYT 的
QPM 大多是热带种质, 温带地区不适宜种植。使用
分子标记辅助选择转育普通玉米自交系为 o2 自交
系是一个快速、有效地改良玉米品质的方法。利用
分子标记技术转育高赖氨酸玉米首先面临的问题是
选择 o2 供体, 之前有研究发现自交系多黄 29、丹
3130、9046 等一些材料和 CA335 杂交的后代全为
o2o2隐性纯合个体[12], 因为它们与 CA339用 phi057
标记无多态性。也有研究认为利用山东 2548 和齐
205作为供体, 11份玉米自交系为受体, 未能构建 o2
近等基因系[13]。本研究利用山东 2548 能构建 o2 近
等基因系, 如 SH15o2、中自 01 o2、辽 3162 o2等, 如
图 4 所示。说明, 在利用 phi057 构建材料时必须检
测供体和受体亲本间的多态性, 选择存在多态性的
两个亲本杂交才能成功构建材料。本试验中 o2供体
分为两类, 一类是 CA339 及其改良系 R60、CAL60
和 QM系列, 另一类是山东 2548, 它们的 o2突变基
因是不一样的[13]。结果表明, 同一类供体在不同遗
1536 作 物 学 报 第 39卷

传背景中对赖氨酸含量的提高幅度不一致, 变化较
大, 有的只提高 13%, 而有的提高 74%, 与之前报道
一致, 即 o2突变基因在不同遗传背景中的作用具有
很大的差异, α-醇溶蛋白变化幅度从降低几倍到基
本没有变化[16], 赖氨酸含量从最高增加 3 倍到增加
很少[15,17-18]。两类供体对赖氨酸含量提高幅度差异
不显著, 山东 2548 这类提高幅度相对较大, 但是总
体来说赖氨酸提高幅度不一致主要是与受体系的遗
传背景相关, 而不是供体的原因。另外, 如 lx00-6/
lx00-6o2 这类受体系赖氨酸含量很低(0.223%), 虽
然提高幅度大 , 但是最终赖氨酸含量低于平均值 ,
只有 0.373%。说明还是受体系的遗传背景决定赖氨
酸含量提高幅度和最终赖氨酸含量。
构建成功的 o2 近等基因系赖氨酸含量并不一
定得到提高[15], 需要一种快速、方便的方法去检测。
在 QPM 育种中需要定期监测赖氨酸的含量, 目前
CIMMYT 的 QPM 育种使用的是近红外光谱法定期
监测赖氨酸含量[27]。近红外法需要依据某个群体用
仪器分析准确的赖氨酸含量和物理光谱定标, 也比
较麻烦, 但是定标好后可以对这个群体大量的样本
进行测定。除了近红外法外还可以使用氨基酸分析
仪测定, 该法准确, 但也比较耗时。杨文鹏等对 4种
湿化学分析法进行了比较[22], 总的来说湿化学法比
较耗费时间。4 种方法中染料结合法测定结果相对
稳定, 曾作为国家标准测定赖氨酸含量, 但是该方
法所需样品量大, 一次重复就需要 1.2~1.4 g 样, 最
初育种过程中没有足够的样品进行测定。针对其缺
点, 本研究对其进行改进, 与之前相比有几个优点,
首先是测试使用的样品量大大减小, 与之前研究相
比缩小 20倍, 3次重复也只需 0.18 g; 其次, 参考前
人研究[21,28]将染料浓度稀释 50倍, 这样更适合测定
染料浓度的吸光度 , 增加其准确性 ; 第三 , 使用
FLUOstar OPTIMA-BMG 多功能酶标仪代替之前研
究使用的分光光度计具有两个优点, 一是测定速度
快, 分光光度计一般一次测几个样, 再加上清洗比
色杯, 速度很慢, 而酶标仪能在几分钟内完成 96 孔
板数据的读取; 二是酶标仪自身比较稳定, 本试验 3
次重复之间差异不显著(P=0.9369>F=0.07)。改进的
方法快速、稳定、需要样品少, 适合在育种进程中
筛选赖氨酸含量高的品系。
4 结论
利用共显性 SSR标记引物 phi057进行分子标记
辅助选择, 可以把不同类型 QPM 供体(CA339 或山
东 2548)的隐性 o2 突变基因准确地导入普通玉米自
交系。导入供体 o2突变基因后, 赖氨酸含量的变化
主要取决于受体系的遗传背景。改进的 DBL法测定
赖氨酸含量, 方便、快速、稳定, 可以参考使用。
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