全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(10): 17561766 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2013ZX08002-002)和国家自然科学基金项目(31201200)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 尹钧, E-mail: xmzxyj@126.com, Tel: 0371-63558203; 陈明, E-mail: chenming02@caas.cn, Tel:
010-82108789
第一作者联系方式: E-mail: liurongbang@126.com, Tel: 010-82108750
Received(收稿日期): 2014-03-10; Accepted(接受日期): 2014-06-16; Published online(网络出版日期): 2014-07-23.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140723.1026.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01756
拟南芥 H+-焦磷酸化酶 AVP1互作小 GTP结合蛋白 AtRAB的特性鉴
定与功能分析
刘荣榜 1,2 陈 明 2,* 郭萌萌 2 司青林 2 高世庆 3 徐兆师 2 李连城 2
马有志 2 尹 钧 1,*
1 河南农业大学 / 小麦玉米作物学国家重点实验室 / 河南粮食作物协同创新中心, 河南郑州 450002; 2中国农业科学院作物科学研究
所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室, 北京 100081; 3北京杂交小麦工程
技术研究中心, 北京 100097
摘 要: 以拟南芥 AVP1 为诱饵, 采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥 cDNA 文库, 获得一个与 AVP1 互作的小
GTP 结合蛋白 AtRAB。酵母互作试验表明, AVP1 和 AtRAB 存在互作; 双分子荧光互补实验(BiFC)证明, AVP1 和
AtRAB能在质膜和细胞核上发生相互作用。野生型拟南芥(WT)、AtRAB和 AVP1的拟南芥突变体 rab和 avp1在高盐
胁迫条件下, 随着 NaCl浓度的加大, 突变体 rab和 avp1的表型变化相似, 相对于 WT都表现为根长缩短, 侧根数减
少; 在低磷处理条件下, 随着磷浓度的逐渐降低, 2个突变体的表型相似, 相对于WT同样表现为根长缩短, 总根面积
减少, 侧根数减少; 在相同磷浓度条件下, 突变体 rab对胁迫的反应比 avp1强; 在低钾处理条件下, 随着钾浓度的降
低, 2个突变体的表型与在低磷胁迫处理条件下的表型相似。结果说明, AVP1和 AtRAB可以在细胞膜和细胞核上相
互作用, AtRAB能够影响植物对离子的吸收, AVP1和 AtRAB的突变体在高盐、低磷和低钾等胁迫条件下表型变化相
似, 证明了 2个基因都正向调控植物对高盐、低磷和低钾胁迫的反应, 它们属于同一信号途径。
关键词: 氢离子焦磷酸化酶; 小 GTP结合蛋白 AtRAB; 酵母双杂交法; 蛋白互作; 抗逆反应
Characterization and Functional Analysis of a Small GTP-binding Protein
AtRAB Interacting with H+-pyrophosphatase AVP1 in Arabidopsis thaliana
LIU Rong-Bang1,2, CHEN Ming2,*, GUO Meng-Meng2, SI Qing-Lin2, GAO Shi-Qing3, XU Zhao-Shi2, LI
Lian-Cheng2, MA You-Zhi2, and YIN Jun1,*
1 Henan Agricultural University / National Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science / Collaborative Innovation Center of Henan Grain
Crops, Zhengzhou 450002, China; 2 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Re-
sources and Genetic Improvement, Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081,
China; 3 Beijing Hybrid Wheat Engineering and Technology Research Center, Beijing 100097, China
Abstract: H+-pyrophosphatase (H+-PPase) is an important proton transporter in plants. It cooperates with H+-ATPase and trans-
port protons in vacuole or extracellular area to maintain a constant H+ gradient, which enables the transport of ions and other
components (e.g. amino acids, carbohydrates). In the current research, AVP1 was applied to membrane proteins-based yeast
two-hybrid system, and a small GTP-binding protein AtRAB was identified by screening the Arabidopsis cDNA library. The in-
teraction between AVP1 and AtRAB was confirmed by interaction analysis in yeast. Bimolecular fluorescent complementation
(BiFC) analysis suggested that AtRAB and AVP1 interaction took place in the plasma membrane and the nucleus. Phenotypes of
wild type (WT) and Arabidopsis mutants of avp1 (AVP1) and rab (AtRAB) were compared under high-salt, low-phosphorus and
low-potassium conditions. Under the high salt stress, avp1 and rab presented similar phenotypes along with the increase of NaCl
concentration, which were characterized by shortened root length and reduced lateral root number in comparison with the WT.
第 10期 刘荣榜等: 拟南芥 H+-焦磷酸化酶 AVP1互作小 GTP结合蛋白 AtRAB的特性鉴定与功能分析 1757
The decreasing phosphorus concentration also led to the phenotypes of shortened root length, reduced lateral root number and
reduced total root area in the two mutants. Particularly, stronger response was observed in rab than in avp1 under the same phos-
phorus concentration. The potassium treatments resulted in similar phenotypes to those in phosphorus treatment. The results indi-
cated that AVP1 can interact with AtRAB on the plasma membrane and the nucleus and further influence the absorption of ions in
plants. The two mutants of avp1 and rab showed similar phenotypes, suggesting that both AVP1 and AtRAB positively regulate
plant response to high salt, low phosphorus and low potassium stresses in the same signaling pathway.
Keywords: H+-pyrophosphatase; Small GTP-binding protein AtRAB; Yeast two-hybrid system; Protein interaction; Stress re-
sponse
氢离子焦磷酸化酶 (H+-pyrophosphatase, H+-
PPase)是一类不同于 H+-ATPase的质子泵[1], 也是一
种以焦磷酸(pyrophosphate, PPi)为底物的水解酶。焦
磷酸化酶 (PPase)一般可以分为可溶性和不溶性两
类, 前者主要存在于细胞质及胞液中, 后者主要结
合在膜上(H+-PPase), 能够将焦磷酸(PPi)水解为 2个
Pi 并生成能量。H+-PPase 存在于植物、少数藻类及
光合细菌[2]的液泡膜或细胞膜上[3-7], 能够与 H+跨膜
运输相耦联, 和 H+-ATPase 协同将胞质中的 H+泵入
液泡中[8], 使液泡和细胞质之间维持一定的 H+梯度,
为离子和其他溶质(氨基酸、糖类等)的次级转运提供
动力[9-10]。有研究表明, 过表达 H+-PPase 基因能够
提高拟南芥的耐盐性和抗旱性[11-13], 同时可以提高
番茄、棉花、苹果等作物耐盐性及抗旱性 [14-18]。
H+-PPase 基因还能够提高水稻的抗寒性 [19], 对黄
瓜、烟草、小麦的重金属胁迫(如镉和铜)抗性也有重
要作用[20-22]。另外, Li等[23]还发现 H+-PPase基因参
与控制生长素的运输, 影响生长素相关的各种发育
过程。H+-PPase基因还参与苹果酸、可溶性糖的积
累[24], 养分的有效存储需要有活性的 H+-Ppase [25]。
通过过表达 H+-PPase 能够增强单子叶植物和双子
叶植物对磷元素的吸收[26]。以上报道证明 H+-PPase
基因广泛参与植物生长发育、抗逆反应、营养物质
吸收、重金属耐性等各方面的过程。在作物抗逆、
营养高效利用等遗传改良方面具有重要的应用价
值。然而, 目前关于 H+-PPase基因的研究大都集中
在基因功能以及生理机制研究方面, 调控机制鲜见
报道。因此, 筛选与 H+-PPase 互作的蛋白并研究其
功能对于揭示 H+-PPase的作用机制具有重要的理论
意义与实际意义。
本研究采用拟南芥氢离子焦磷酸化酶 AVP1 为
诱饵筛选拟南芥 cDNA文库, 筛选到一个AVP1互作
蛋白小 GTP 结合蛋白 AtRAB。通过比较 AVP1 和
AtRAB 拟南芥突变体在高盐、低磷、低钾胁迫条件
下的表型, 分析 AtRAB 对离子吸收的调控, 其结果
有助于明确正向调控的抗逆反应及探索调控机制。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 研究材料 拟南芥野生型(Columbia)由中
国农业科学院作物科学研究所小麦分子育种课题组
提供, 拟南芥 H+-焦磷酸化酶基因 AVP1突变体 avp1
和小 GTP 结合蛋白 AtRAB 突变体 rab 购于
Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)。
1.1.2 载体和菌株 克隆载体 pZero Back/blunt
Vector、大肠杆菌感受态 TOP10 购于天根生化科技
(北京 )有限公司。筛库所用表达载体 pBT3N、
pBT3STE、pPR3N和质粒 pOst1-Nubl、pTSU2-APP、
pNubG-Fe65 及酵母菌株 NMY51 购于 Dualsystems
Biotech公司。拟南芥均一化 cDNA文库由本实验室
采集拟南芥整株包括根、茎、叶、花、果荚等所有
组织经各种处理及提取 RNA 后构建。GFP 载体、
YFPN、YFPC载体由本实验室保存。
1.1.3 试剂 DNA 聚合酶 PrimeSTAR HS DNA
Polymerase, RT-PCR所用反转录试剂盒购于 TaKaRa
公司。基因克隆所用反转录试剂盒购于 Invitrogen。
限制性内切酶、T4连接酶购于 Promega。DNA、RNA
提取, 质粒提取, 琼脂糖凝胶 DNA 回收, 荧光定量
试剂盒, DNA MarkerIII、D2000等采用天根生化科
技(北京)有限公司或 QIAGEN 的相应产品。纤维素
酶和果胶酶采用日本 Yakult 的产品。其他试剂购于
Sigma、Amresco、Fermentas、BD、OXOID等公司,
分析纯试剂为国产。引物合成及 DNA测序由北京奥
科鼎盛生物科技有限公司承担。
1.2 采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥
cDNA文库
膜蛋白酵母双杂交系统是由经典的酵母双杂交
改进而来, 主要用于膜蛋白及胞质蛋白的筛选[27]。
从拟南芥 cDNA 中扩增得到拟南芥 H+-焦磷酸化酶
基因 AVP1 (At1g15690)的全长 CDS序列, 并连接到
pBT3STE 载体上作为筛选 cDNA 文库的诱饵载体,
验证载体的自激活活性后进行筛库。筛库步骤及各
1758 作 物 学 报 第 40卷
种试剂的配制按照 Dualsystems Biotech 公司的
Membrane 系统进行 (http://www.dualsystems.com/,
P01201-P01229/P01301-P01329/P01401-P01429)。以
筛库诱饵载体 pBT3STE-AVP1 转化 NMY51 酵母感
受态细胞, 将拟南芥 cDNA 文库质粒转入, 将转化
产物均匀涂布于 SD/–Leu–Trp–His–Ade 营养缺陷型
培养基(四缺)平板上, 3 d 后挑取单克隆摇菌后再重
新点于外加X-α-gal的四缺筛选性培养基平板上, 通
过观察克隆显蓝情况判断报告基因 LacZ 的表达情
况。选取显蓝克隆(3个报告基因 His+、Ade+和 LacZ+
都表达)进行酵母质粒提取, 将质粒重新转入大肠杆
菌 TOP10 感受态中, 重新提取质粒后再转入酵母,
再点于外加X-α-gal的四缺筛选性培养基平板上, 选
取显蓝克隆测序。将所有测序结果用 NCBI 进行
Blast比对。
1.3 通过酵母双杂交系统验证 AtRAB 与 AVP1
的互作
以 Blast序列比对得到一个与 AVP1互作的蛋白
AtRAB (小 GTP结合蛋白, AT5G47200)。克隆 AtRAB
全长 CDS序列后将其连接到捕获载体 pPR3N上, 将
捕获载体 pPR3N-RAB 转化入含有诱饵载体
pBT3STE-AVP1的 NMY51酵母感受态细胞, 均匀涂
布于 SD/–Leu–Trp 和 SD/–Leu–Trp–His–Ade 缺陷型
培养基平板上, 30℃培养 3~4 d。挑取单克隆用相应
的 SD/–Leu–Trp 或 SD/–Leu–Trp–His–Ade 液体培养
基摇菌至 OD值 0.6~0.8之间。吸取 1 μL菌液点于
外加 40 mmol L–1 X-α-gal的四缺筛选性培养基平板上,
30℃培养 3~4 d, 通过观察是否显蓝来判断报告基因
LacZ+的表达与否。同时做好相应的阴性和阳性对照组。
1.4 AVP1 及 AtRAB 的亚细胞定位和体内双分
子荧光互补(BiFC)互作验证
将 AVP1及 AtRAB全长 CDS序列(去除终止密
码子)分别构建到 GFP 载体上融合表达 , 构建成
35S::AVP1-GFP 和 35S::AtRAB-GFP 载体用与亚细
胞定位观察。再将 AVP1全长 CDS序列构建到 YFPN
载体上融合表达, 将 AtRAB 全长 CDS 序列构建到
YFPC 载体上融合表达, 构建成 35S::AVP1-YFPN 和
35S::AtRAB-YFPC 载体用于体内双分子荧光互补
(BiFC)表达载体。用原生质体转化法将对照质粒
35S::GFP、35S::AVP1-GFP、35S::AtRAB-GFP 分别
转化拟南芥叶肉细胞原生质体; 将 35S::AVP1-YFPN
和 35S::AtRAB-YFPC共同转化拟南芥叶肉细胞原生
质体。黑暗条件下 25℃培养 18 h 以上后用 Zeiss
LSM700激光共聚焦显微镜观察载体表达情况。
1.5 拟南芥突变体 rab和 avp1纯合体鉴定
参照 Gantlet (http://www.gantlet.org/)上的方法
清洗、春化及种植拟南芥种子。得到小苗后取单株
拟南芥叶片, 按照植物基因组DNA提取试剂盒的操
作说明(天根)提取单株拟南芥叶片 DNA。用 T-DNA
插入突变的检测方法[28]对突变体进行纯合鉴定, 通
过 http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html 设计 T-DNA
插入突变检测引物(表 1)。
以 RT-PCR 分析得到的纯合突变体及 WT 的叶
片, 按照 RNAprep pure 植物总 RNA 提取试剂盒的
操作说明(天根, 北京)提取 RNA, 按照 PrimeScript
RT Reagent Kit (Perfect real-time, TaKaRa)的操作说
明进行反转录, 合成 cDNA 第一链, 将反转录后的
模板稀释后用作荧光实时定量的模板。
采用 SuperReal荧光定量预混试剂(SYBR Green,
天根)进行实时荧光定量 PCR, 整个体系的配制应在
避光条件下操作。于 ABI7500荧光定量 PCR仪上进
行 PCR。Real-time PCR采用三步法 PCR扩增反应,
PCR的预变性条件设定为 95℃, 15 min。PCR采用
95℃变性 10 s, 60℃退火 20 s, 72℃延伸 32 s, 在 72℃
时采集荧光信号。采用 RT-PCR 方法检测 AtRAB 和
AVP1在 WT和突变体中的表达情况。
表 1 相关引物序列
Table 1 Related primer sequences
引物名称
Primer name
基因座位
Gene locus
正向序列
Forward primer (5–3)
反向序列
Antisenseb (3–5)
AtRABa At5g47200 TGATGGAAAGAGGTACAACGG TTGCCTATCTTTGCAGGTCAC
AVP1a At1g15690 CACAACAACCAAACAGATCCC CACTGAATCCATCTTTGTAAAATAGG
LB — ATTTTGCCGATTTCGGAAC —
AtRABb At5g47200 TGAATCCTGAATATGACTATCTGTTC TCTGGAGTTTGATGGTCTTTCC
AVP1b At1g15690 GGAGATCCTTGTACCGATTTGTGCG CTTAGCGACAACACTCTGGTC
ACTIN At3g18780 GAAATCACAGCACTTGCACC AAGCCTTTGATCTTGAGAGC
a纯合突变体鉴定引物; b RT-PCR引物。
a primers for identification of homozygous mutants of rab and avp1; b RT-PCR primers.
第 10期 刘荣榜等: 拟南芥 H+-焦磷酸化酶 AVP1互作小 GTP结合蛋白 AtRAB的特性鉴定与功能分析 1759
1.6 突变体 rab和 avp1的高盐处理
将 WT、rab 和 avp1 的纯合突变体种子消毒和
春化处理后, 置培养室培养 4~7 d, 在拟南芥长到 2
片子叶时分别移苗进行 NaCl 处理, 处理浓度为 0
(MS)、50、100、150和 200 mmol L–1。分别选取长
势均匀一致的小苗转移到含有 NaCl 的培养基方皿
(一次性使用)上, 4株苗为一组, 左边 4株 WT, 右边
4株 avp1或 rab, 竖立, 倾斜 3°培养 7 d左右, 观察
小苗生长状况, 并用 WinRHIZO Pro 2012扫根软件
配合 EPSON Flatbed Scanner EPSON Expression
10000XL扫描仪扫描测量根长、侧根数及根分蘖数。
1.7 突变体 rab和 avp1的低钾、低磷营养处理
用 1.6的方法对 WT、rab和 avp1的纯合突变体
进行低磷和低钾处理。低磷培养基中磷的浓度梯度
设为 0、10、20、50和 100 μmol L–1, MS作对照。
低磷培养基配制时参照 MS 培养基的配方, 通过控
制 KH2PO4 的量来控制低钾培养基中磷的浓度, 其
他 4种大量元素盐的量同 MS。用 KH2PO4设置低磷
浓度梯度时减少的 K+量用 KCl来替代, 确保低磷培
养基中磷元素以外其他元素都与 MS 中相同。低钾
培养基同样使K+终浓度为这 5个浓度梯度, 同时MS
对作照。配制低钾培养基时也参照 MS 培养基的配
方, 将大量元素中的 KNO3去除, 通过控制 KH2PO4
的量来控制低钾培养基中 K+的终浓度, 此时减少的
PO43–的量用(NH4)2HPO4替代, KNO3中缺失 NO3–的
量用 NH4NO3替代, 同时减去添加(NH4)2HPO4时多
加入的 NH4–的量, 确保低钾培养基中 K元素以外其
他元素都与 MS中相同。
低磷、低钾培养方法同 NaCl处理, 观察小苗生
长状况, 并用 WinRHIZO Pro 2012扫根软件配合扫
描仪扫描测量根长、根表面积、侧根数及根分蘖数。
2 结果与分析
2.1 AVP1互作蛋白的筛选
利用膜蛋白酵母双杂交系统筛选均一化拟南芥
cDNA文库, 获得一个 AVP1的互作蛋白, 经测序和
NCBI Blast序列比对, 发现这是一个小 GTP结合蛋
白 AtRAB。将 AVP1和 AtRAB全长 CDS序列克隆到
酵母双杂交载体上进行互作验证 , 将 pPR3N-RAB
(带有 AtRAB 基因 )转化含有诱饵载体 pBT3STE-
AVP1 (带有 AVP1基因)的NMY51酵母, 分别培养于
双缺培养基(SD/–Leu–Trp)和四缺筛选培养基(SD/–
Leu–Trp–His–Ade), 经过培养转化 pPR3N-RAB 和
pBT3STE-AVP1的酵母可以在外加 X-α-gal的四缺陷
型上生长并显蓝, 除阳性对照外其他阴性对照组均
不能生长(图 1)。这说明 AtRAB 和 AVP1 蛋白可以
在酵母中互作。
图 1 酵母双杂交验证 AtRAB与 AVP1的相互作用
Fig. 1 Identification of interaction between AtRAB and AVP1
by yeast two-hybrid system
A: 将 pBT3STE-AVP1和 pPR3N-AtRAB及其阴性对照共转化酵
母感受态细胞, 左图为双缺培养基 SD/–Trp–Leu的生长结果; 右
图为四缺筛选培养基 SD/–Trp–Leu–His–Ade+40 mg L–1 X-α-gal
选择性培养基生长结果, 10、10–1和 10–2为不同的稀释梯度;
B: 试剂盒自带质粒空载体阴阳性对照。
A: pBT3STE-AVP1 and pPR3N-AtRAB were co-transformed into
yeast competent cells. Left: yeasts grown on medium (SD/–Trp–
Leu); Right: yeats grown on medium (SD/–Trp–Leu–His–Ade+40
mg L–1 X-α-gal). 10, 10–1, 10–2: different concentration gradients;
B: negative and positive control.
2.2 AVP1 及 AtRAB 的亚细胞定位和双分子荧
光互补(BiFC)试验
将分别转化有 35S::GFP、35S::AVP1-GFP、35S::
AtRAB-GFP 的拟南芥原生质体以及共转化有 35S::
VP1-YFPN 和 35S::AtRAB-YFPC 的原生质体置激光
共聚焦显微镜下观察。发现, 转化有对照质粒 35S::
GFP 的充斥整个细胞(图 2-A), 而 AtRAB-GFP 定位
在细胞膜和细胞核中(图 2-B), AVP1-GFP 只定位在
细胞膜上(图 2-C)。而对于共转化有 35S::AVP1-YFPN
和 35S::AtRAB-YFPC的原生质体细胞则能在其细胞
膜和细胞核上观察到黄色荧光(图 2-D), 这说明 AVP1
和 AtRAB能在细胞膜和细胞核上发生互作。
2.3 AVP1和 AtRAB的表达谱分析
通过查询拟南芥基因表达数据库 AtGenExpress
Visualization Tool (http://jsp.weigelworld.org/expviz/)
1760 作 物 学 报 第 40卷
图 2 AVP1及 AtRAB的亚细胞定位和双分子荧光互补试验
Fig. 2 Subcellular localization and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) experiment of AVP1 and AtRAB
A: GFP质粒空对照; B: AtRAB的亚细胞定位; C: AVP1的亚细胞定位; D: AVP1和 AtRAB的 BiFC试验。
A: GFP control; B: subcellular localization of AtRAB; C: subcellular localization of AVP1; D: BiFC experiment of AVP1 and AtRAB.
分析 AVP1 和 AtRAB 在胁迫条件下的表达情况。结
果发现在渗透处理条件下, AVP1在地上部分的表达
逐渐下降, AtRAB的表达则上升明显, 而在根中这 2
个基因的表达量变化趋势不大, AtRAB略有上升。在
盐处理条件下 AVP1在地上部分的表达量在 1 h时开
始下降, 在 3 h时最低, 3 h后重新上升, 在根中的表
达量则略有下降; 而 AtRAB 在地上部分的表达量下
降到 3 h后有所上升, 在根中的表达量逐渐下降到 6 h
时达最低, 其后上升。在干旱胁迫下这 2个基因在根
中和地上部分的表达量均较稳定, 受干旱诱导表达
变化不大(图 3)。
2.4 拟南芥纯合突变体的鉴定
取拟南芥突变体的单株叶片, 提取 DNA 用作
PCR检测模板, 用检测 T-DNA插入突变的方法鉴定
拟南芥纯合突变体(图 4)。通过 RT-PCR检测获得 rab
纯合突变体四株, avp1纯合突变体 2株。对所得纯合
突变体进行RT-PCR分析显示, 纯合突变体中AtRAB
和 AVP1的表达受到抑制, 基因功能缺失(图 5)。
2.5 突变体 rab和 avp1耐盐性鉴定
在 MS培养基中添加 NaCl后, 随着添加浓度的
加大, 拟南芥 WT 和突变体 rab、avp1 都逐渐变小,
而突变体 rab和 avp1的生长特别是根部的生长相对
于 WT受到更明显的抑制, 突变体 rab与 avp1的表
型相似(图 6)。根系的扫描结果显示, 在 200 mmol L–1
NaCl处理条件下, 2个突变体在根长与侧根数方面低
于WT, 证明这 2个突变体对高盐胁迫的敏感性趋势
相似, 但 rab对盐的敏感性相对更强一些。突变体相
对于 WT 敏感性明显增强, 证明这 2 个基因都是正
向参与植物的耐盐反应(图 7)。
2.6 突变体 rab和 avp1耐低 P和低K胁迫的鉴定
随着磷浓度的降低, WT和突变体 rab、avp1的
长势也都逐渐减弱, 突变体 rab 和 avp1 根部的生长
第 10期 刘荣榜等: 拟南芥 H+-焦磷酸化酶 AVP1互作小 GTP结合蛋白 AtRAB的特性鉴定与功能分析 1761
相对于 WT受到更多的抑制, rab和 WT的差异, 达
到极显著水平, 而 avp1 比 WT 长势稍差, 差异没有
达到显著水平, rab和 avp1的表型相似(图 8)。对根
系的扫描显示, 在 20 μmol L–1、10 μmol L–1和无磷
胁迫处理条件下, 2个突变体在根长、侧根数和根分
蘖数等方面都低于 WT。avp1 的根表面积虽略大于
WT, 但差异不显著, 属正常误差范围。证明这 2 个
突变体对低磷胁迫的敏感性相似 , 突变体相对于
WT敏感性增强, 证明这 2个基因都是正向参与植物
的耐低磷胁迫的响应(图 9)。而随着 K 浓度的逐渐
降低, WT和突变体 rab、avp1的长势同样变弱, 但
WT 的根系没有像低磷处理那样明显缩短, 突变体
rab和 avp1的根系随着钾浓度的降低变化不大, 维
持在相似水平 (图 10)。根系扫描的结果显示 , 在
100、50和 20 μmol L–1低钾处理条件下, 突变体在
根长、根表面积、侧根数和根分蘖数等方面都低于
WT (图 11), 证明这 2 个基因都正向调控植物耐低
钾胁迫的反应。
图 3 高渗、盐、干旱胁迫下 AVP1和 AtRAB在拟南芥地上部分和根中的表达
Fig. 3 Expression of AVP1 and AtRAB in aerial parts and root under osmotic, salt, and drought stresses
图 4 AtRAB、AVP1突变体的基因图谱
Fig. 4 Gene maps of AtRAB and AVP1 mutants
图 5 AtRAB、AVP1在 WT和突变体中的表达分析
Fig. 5 RT-PCR analysis of AtRAB and AVP1 in WT and
mutants
WT: 拟南芥野生型; rab: AtRAB突变体; avp1: AVP1突变体;
Actin: 内参基因。
WT: Arabidopsis wild type; rab: AtRAB mutant; avp1: AVP1 mutant;
Actin: internal standard control.
1762 作 物 学 报 第 40卷
图 6 不同浓度 NaCl处理条件下突变体 rab和 avp1的表型
Fig. 6 Phenotypes of rab and avp1 mutants on medium with different concentrations of NaCl
图 7 不同浓度 NaCl处理下突变体 rab和 avp1根长、侧根数及根分蘖数的变化
Fig. 7 Root length, lateral root number and root tiller number of rab and avp1 mutants under different concentrations of NaCl
同一处理浓度下标记不同小写字母的表示柱值差异显著(P<0.05); 标记不同大写字母的表示柱值差异极显著(P<0.01)。
The values in the same concentration marked with different lowercase letters and different capital letters are significantly different at P<0.05
and P<0.01, respectively.
图 8 不同浓度低磷处理条件下突变体 rab和 avp1表型
Fig. 8 Phenotypes of rab and avp1 mutants on medium with different concentrations of P
第 10期 刘荣榜等: 拟南芥 H+-焦磷酸化酶 AVP1互作小 GTP结合蛋白 AtRAB的特性鉴定与功能分析 1763
图 9 不同浓度低磷处理下突变体 rab和 avp1根长、根表面积、侧根数及根分蘖数的变化
Fig. 9 Root length, surface area, lateral root number and root tiller number of rab and avp1 mutants under different concentrations of P
同一处理浓度下标记不同小写字母的表示柱值差异显著(P<0.05); 标记不同大写字母的表示柱值差异极显著(P<0.01)。
The values in the same concentration marked with different lowercase letters and different capital letters are significantly different at P<0.05
and P<0.01, respectively.
图 10 不同浓度低钾处理条件下突变体 rab和 avp1的表型
Fig. 10 Phenotypes of rab and avp1 mutants on medium with different concentrations of K
3 讨论
在真核生物中, 小 GTP 结合蛋白能够调节多种
生理过程, 包括细胞信号转导、细胞增殖、细胞骨
架组织以及细胞内膜运输等[29-32]。小 GTP结合蛋白
可以进一步分为 Ras、Rab、Rho、Arf和 Ran 5种, 其
中 Ras类主要调节细胞的增殖, Rho类主要参与控制
1764 作 物 学 报 第 40卷
图 11 不同浓度低 K处理下突变体 rab和 avp1根长、根表面积、侧根数及根分蘖数的变化
Fig. 11 Root length, surface area, lateral root number and root tiller number of rab and avp1 mutants under different
concentrations of K
同一处理浓度下标记不同小写字母的表示柱值差异显著(P<0.05); 标记不同大写字母的表示柱值差异极显著(P<0.01)。
The values in the same concentration marked with different lowercase letters and different capital letters are significantly different at P<0.05
and P<0.01, respectively.
细胞骨架的形成, Arf类主要参与膜上各种物质的运
输, Ran类主要参与蛋白的运输和 RNA的转录[33]。
本研究证明与 AVP1互作的小 GTP结合蛋白 AtRAB
属于 Rab类(图 1和图 2), Rab类小 GTP结合蛋白是
细胞内膜运输的重要调节者, 可以调节胞吞、胞吐
以及细胞内膜的循环利用[34]。有报道指出, AtRAB
能被超氧自由基阴离子和水杨酸等诱导表达, 且在
其转基因植物的液泡和芽中积累大量的 Na+, 并能
提高转基因植物对盐和渗透胁迫的抗性, 减少盐胁
迫下活性氧的积累[35]。本研究发现 AtRAB不仅参与
植物的耐盐反应, 而且参与植物在低磷、低钾胁迫
条件下的反应, 正向调控植物对高盐、低磷和低钾
等胁迫的耐性(图 6~图 11)。
文献报道, H+-PPase可以参与很多生理进程, 它
所形成的H+梯度可以被液泡膜上的Na+/K+反向装运
蛋白利用, 将 Na+泵入液泡, 降低 Na+在细胞质中的
浓度 , 这种离子区域化机制既能维持细胞渗透势 ,
又能维持细胞离子平衡, 避免一些无机离子(如 Na+
和C1–等)对细胞代谢的毒害从而提高植物的耐盐性[36]。
Yang等[26]还发现, 过表达H+-PPase能够增强单子叶
植物和双子叶植物对磷元素的吸收, 其作用原理是
H+-PPase 能够使液泡内 pH 降低, 造成液泡的酸化,
促进生长素 IAA的分布, 进而促进植物根系的发育[23],
同时促进离子的吸收和转运 [36-37]。本研究也证明
AVP1 具正向调控植物的耐盐性及耐低磷胁迫和耐
低钾胁迫的能力。我们推测 AVP1基因的这些功能都
与其可以酸化植物根部细胞的机制相关。
小 GTP结合蛋白能够被 GTP的结合所激活, 被
随后的GTP水解为GDP所抑制, 扮演分子开关的角
色[38-39], 在处于活性状态时, Rab类小GTP结合蛋白
能够和下游很多执行不同功能的蛋白互作, 控制这
些蛋白的活性 [33]。本研究中亚细胞定位分析证明
第 10期 刘荣榜等: 拟南芥 H+-焦磷酸化酶 AVP1互作小 GTP结合蛋白 AtRAB的特性鉴定与功能分析 1765
AVP1和 AtRAB都能在细胞膜上表达(图 2-B, C), 这
与文献报道的VP1的亚细胞定位结果一致[4-6], 双分
子荧光互补实验(BiFC)证明 AVP1和 AtRAB能在细
胞核和细胞膜上互作(图 2-D)。另外, 本研究观察到
AVP1 只定位于细胞膜, 与文献报道一致, 但双分子
荧光互补却表现出细胞膜和细胞核上的黄色荧光 ,
推测可能是 AVP1和 AtRAB在细胞膜上互作后发生
了迁移, 有往核中迁移表达的倾向。至于两者是否
发生互作后迁移, 还需要更深入研究。对拟南芥野
生型(WT)、突变体 rab和 avp1在高盐、低磷及低钾
胁迫条件下的比较表明, 这两个突变体的表型相似,
证明 AtRAB 和 AVP1 处于同一信号途径, 同时正向
调控植物的抗逆反应。另有文献报道, AtRAB 对植
物的尖生细胞伸长是极其重要的, 能够定位于根毛
细胞, 并且推测其通过一个参与极化分泌的细胞壁
成分来调节膜运输[40]。因此, 我们推测 AtRAB可能
是通过和 AVP1互作调节 AVP1的活性, 影响植物对
离子的吸收(图 6、图 8和图 10)。它们之间的调控机
制需要进一步研究。
4 结论
AVP1 和 AtRAB 能在细胞膜和细胞核上发生直
接的相互作用。AVP1和 AtRAB突变体在高盐、低磷
和低钾胁迫条件下表型相似, 证明 AVP1 和 AtRAB
处于同一信号途径, 同时正向调控植物的抗逆反应。
AVP1和 AtRAB之间的调控机制还需要进一步研究。
References
[1] Rea P A, Poole R J. Vacuolar H+-translocating pyrophosphatase.
Ann Rev Plant Physiol, 1993, 44: 157–180
[2] Nakanishi Y, Matsuda N, Aizawa K, Kashiyama T, Yamamoto K,
Mimura T, Ikeda M, Maeshima M. Molecular cloning and se-
quencing of the cDNA for vacuolar H+-pyrophosphatase from
Chara coralline. Biochim Biophys Acta, 1999, 1418: 245–250
[3] Baykov A A, Bakuleva N P, Rea P A. Steady-state kinetics of
substrate hydrolysis by vacuolar H+-pyrophosphatase. A simple
three-state model. Eur J Biochem, 1993, 217: 755–762
[4] Long A R, Williams L E, Nelson S J, Hall J L. Localization of
membrane pyrophosphatase activity in Ricinus communis seed-
lings. J Plant Physiol, 1995, 146: 629–638
[5] Robinson D G, Haschke H P, Hinz G, Hoh B, Maeshima M, Marty F.
Immunological detection of tonoplast polypeptides in the plasma
membrane of pea cotyledons. Planta, 1996, 198: 95–103
[6] Robinson D G, Hoppenrath M, Oberbeck K, Luykx P, Ratajczak
R. Localization of pyrophosphatase and V-ATPase in Chlamy-
domonas reinhardtii. Bot Acta, 1998, 111: 108–122
[7] Lerchl J, Geigenberger P, Stitt M, Sonnewald U. Impaired
photoassimilate partitioning caused by phloem-specific removal
of pyrophosphate can be complemented by a phloem-specific cy-
tosolic yeast-derived invertase in transgenic plants. Plant Cell,
1995, 7: 259–270
[8] Jose R, Castineira P, Hernandez A, Drake R, Serrano. A plant
proton-pumping inorganic pyrophosphatase functionally com-
plements the vacuolar ATPase transport activity and confers
bafilomycin resistance in yeast. Biochem J, 2011, 437: 269–278
[9] Blumwald E. Tonopast vesicles for the study of ion transport in
plant vacuoles. Plant, 1987, 69: 731–734
[10] Hedrich R, Schroeder J I. The physiology of ion channels and
electrogenic pumps in higher plants. Ann Rev Plant Physiol, 1989,
40: 539–569
[11] Guo S L, Yin H B, Zhang X, Zhao F Y, Li P H, Chen S H, Zhao Y
X, Zhang H. Molecular cloning and characterization of a vacuolar
H+-pyrophosphatase gene, SsVP, from the halophyte Suaeda
salsa and its overexpression increases salt and drought tolerance
of Arabidopsis. Plant Mol Biol, 2006, 60: 41–50
[12] Sun Q H, Gao F, Zhao L, Li K P, Zhang J R. Identification of a
new 130 bp cis-acting element in the TsVP1 promoter involved in
the salt stress response from Thellungiella halophila. BMC Plant
Biol, 2010, 10: 1471–2290
[13] Liu L, Wang Y, Wang N, Dong Y Y, Fan X D, Liu X M, Yang J,
Li H Y. Cloning of a Vacuolar H+-pyrophosphatase gene from the
halophyte Suaeda corniculata whose heterogonous overexpre-
ssion improves salt, saline-alkali and drought tolerance in Arabi-
dopsis. J Integr Plant Biol, 2011, 53: 731–742
[14] Bhaskaran S, Savithramma D L. Co-expression of Pennisetum
glaucum vacuolar Na+/H+ antiporter and Arabidopsis H+-pyro-
phosphatase enhances salt tolerance in transgenic tomato. J Exp
Bot, 2011, 62: 5561–5570
[15] Park S H, Li J S, Pittman J K, Berkowitz G A, Yang H B, Undur-
raga S, Morris J, Hirschi K D, Gaxiola R A. Up-regulation of a
H+-pyrophosphatase (H+-PPase) as a strategy to engineer
drought-resistant crop plants. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102:
18830–18835
[16] Zhang H, Shen G X, Kuppu S, Gaxiola R, Payton P. Creating
drought- and salt-tolerant cotton by overexpressing a vacuolar
pyrophosphatase gene. Plant Signal Behav, 2011, 6:6: 861–863
[17] Pasapula V, Shen G X, Kuppu S, Paez-Valencia J, Mendoza M,
Hou P, Chen J, Qiu X Y, Zhu L F, Zhang X L, Auld D, Blumwald
E, Zhang H, Gaxiola R, Payton P. Expression of an Arabidopsis
vacuolar H+-pyrophosphatase gene (AVP1) in cotton improves
drought-and salt tolerance and increases fibre yield in the field
conditions. Plant Biotechnol J, 2011, 9: 88–99
[18] Dong Q L, Liu D D, An X H, Hu D G, Yao Y X, Hao Y J.
MdVHP1 encodes an apple vacuolar H+-PPase and enhances
stress tolerance in transgenic apple callus and tomato. J Plant
Physiol, 2011, 168: 2124–2133
[19] Zhang J, Li J Q, Wang X C, Chen J. OVP1, a Vacuolar
H+-translocating inorganic pyrophosphatase (V-PPase), overexp-
ression improved rice cold tolerance. Plant Physiol Biochem,
2011, 49: 33–38
[20] Kabala K, Janicka-Russak M, Klobus G. Different responses of
tonoplast proton pumps in cucumber roots to cadmium and
copper. J Plant Physiol, 2010, 167: 1328–1335
[21] Migocka M, Papierniak A, Kosatka E, Klobus G. Comparative
1766 作 物 学 报 第 40卷
study of the active cadmium efflux systems operating at the
plasma membrane and tonoplast of cucumber root cells. J Exp
Bot, 2011, 62: 4903–4916
[22] Khoudi H, Maatar Y, Gouiaa S, Masmoudi K. Transgenic tobacco
plants expressing ectopically wheat H+-pyrophosphatase
(H+-PPase) gene TaVP1 show enhanced accumulation and toler-
ance to cadmium. J Plant Physiol, 2012, 169: 98–103
[23] Li J S, Yang H B, Peer W A, Richter G, Blakeslee J, Bandyop-
adhyay A, Titapiwantakun B, Undurraga S, Khodakovskaya M,
Richards E L, Krizek B, Murphy A S, Gilroy S, Gaxiola R.
Arabidopsis H+-PPase AVP1 regulates auxin-mediated organ
development. Science, 2005, 310: 121–125
[24] Yao Y X, Dong Q L, You C X, Zhai H, Hao Y J. Expression
analysis and functional characterization of apple MdVHP1 gene
reveals its involvement in Na+, malate and soluble sugar accumu-
lation. Plant Physiol Biochem, 2011, 49: 1201–1208
[25] Krebs M, Beyhl D, Gorlich E, Al-Rasheid K A S, Marten I,
Stierhof Y D, Hedrich R, Schumacher K. Arabidopsis V-ATPase
activity at the tonoplast is required for efficient nutrient storage
but not for sodium accumulation. Proc Natl Acad Sci USA, 2010,
107: 3251–3256
[26] Yang H B, Knapp J, Koirala P, Rajagopal D, Peer W A, Silbart L
K, Murphy A, Gaxiola R A. Enhanced phosphorus nutrition in
monocots and dicots over-expressing a phosphorus-responsive
type I H+-pyrophosphatase. Plant Biotechnol J, 2007, 5: 735–745
[27] Stagljar I, Korostensky C, Johnsson N, te Heesen S. A genetic
system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions
between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci USA,
1998, 95: 5187–5192
[28] 李敏, 杨双, 阮燕晔, 樊金娟, 张立军. 拟南芥 T DNA插入突
变体 atsuc3的 PCR鉴定. 植物生理学通讯, 2006, 42: 91–94
Li M, Yang S, Ruan Y Y, Fan J J, Zhang L J. Identification of
atsuc3 with T-DNA Insertion by PCR. Plant Physiol Commun,
2006, 42: 91–94 (in Chinese)
[29] Waizenegger I, Lukowitz W, Assaad F, Schwarz H, Jurgens G,
Mayer U. The Arabidopsis KNOLLE and KEULE genes interact
to promote vesicle fusion during cytokinesis. Curr Biol, 2000, 10:
1371–1374
[30] Geldner N, Friml J, Stierhof Y D, Jurgens G, Palme K. Auxin
transport inhibitors block PIN1 cycling and vesicle trafficking.
Nature, 2001, 413: 425–428
[31] Surpin M, Raikhel N. Traffic jams affect plant development and
signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5: 100–109
[32] Molendijk A J, Ruperti B, Palme K. Small GTPases in vesicle
trafficking. Curr Opin Plant Biol, 2004, 7: 694–700
[33] Vernoud V, Horton A C, Yang Z B, Nielsen E. Analysis of the
small GTPase gene superfamily of Arabidopsis. Plant Physiol,
2003, 131: 1191–1208
[34] Peng J L, Ilarslan H, Wurtele E S, Bassham D C. AtRabD2b and
AtRabD2c have overlapping functions in pollen development and
pollen tube growth. BMC Plant Biol, 2011, 11: 25
[35] Mazel A, Leshem Y, Tiwari B S, Levine A. induction of salt and
osmotic stress tolerance by overexpression of an intracellular
vesicle trafficking protein AtRab7 (AtRabG3e). Plant Physiol,
2004, 134: 118–128
[36] White P J, Marshall J, Smith J A C. Substrate kinetics of the
tonoplast H+-translocating inorganic pyrophosphatase and its ac-
tivation by free Mg2+. Plant Physiol, 1990, 93: 1063–1070
[37] Parvanova D, Ivanov S, Konstantinova T, Karanovc E,
Atanassov A, Tsvetkov T, Alexieva V, Djilianov D. Transgenic
tobacco plants accumulating osmolytes show reduced oxidative
damage under freezing stress. Plant Physiol Biochem, 2004, 42:
57–63
[38] Boguski M S, McCormick F. Proteins regulating Ras and its rela-
tives. Nature, 1993, 366: 643–654
[39] Takai Y, Sasaki T, Matozaki T. Small GTP-binding proteins.
Physiol Rev, 2001, 81: 153–208
[40] Preuss M L, Serna J, Falbel T G, Bednarek S Y, Nielsen E. The
Arabidopsis Rab GTPase RabA4b localizes to the tips of growing
root hair cells. Plant Cell, 2004, 16: 1589–1603