全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(8): 11471154 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由“十二五”农村领域国家科技支撑计划项目(2013BAD01B05-2, 2012BAD03B01-2), 科技部国际合作项目(2013DFR30890-1)
和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-05)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 董国清, E-mail: dongbio@126.com; 郭刚刚, E-mail: guoganggang@caas.cn
第一作者联系方式: E-mail: zhanglisa06@163.com
Received(收稿日期): 2014-12-15; Accepted(接受日期): 2015-04-02; Published online(网络出版日期): 2015-05-18.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150518.1557.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01147
基于 EST-SSR和 SNP标记的大麦麦芽纯度检测
张利莎 1,2 董国清 1,* 扎 桑 2,3 卓 嘎 3 王德良 4 谷方红 4
袁兴淼 2 张 京 2 郭刚刚 2,*
1武汉轻工大学生物与制药工程学院, 湖北武汉 430023; 2农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室 / 国家农作物基因资源与
基因改良重大科学工程 / 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 3西藏大学农牧学院, 西藏林芝 860000; 4 中国食品发酵工
业研究院, 北京 100027
摘 要: 大麦麦芽作为啤酒酿造的主要原料之一, 其纯度决定了麦芽原料的均一性, 进而影响加工工艺和啤酒品质。
为高效准确地鉴定麦芽纯度, 在啤酒企业进行麦芽原料采购和质量监测时提供参考依据。本研究分别利用 EST-SSR
和 SNP标记定性检测了按比例预混的麦芽样品纯度, 并利用 SNP标记定量检测了 4份送检的麦芽盲样纯度。结果表
明, EST-SSR标记能定性检测混杂度高于 10%的麦芽样品, 而 SNP标记能够有效鉴定混杂度低至 5%的麦芽样品。SNP
标记对纯度定量检测的单次抽样的测定值与真实值之间的误差在 3%以内。比较发现, 本研究所用的两类分子标记均
可用于麦芽样品的纯度检测, 但基于 KASP技术的 SNP标记可以满足麦芽纯度的快速定量检测需要。
关键词: 大麦麦芽; 纯度检测; 分子标记; KASP技术
EST-SSR and SNP Markers Based Barley Malt Purity Detection
ZHANG Li-Sha1,2, DONG Guo-Qing1,*, ZHA Sang2,3, ZHUO Ga3, WANG De-Liang4, GU Fang-Hong4,
YUAN Xing-Miao2, ZHANG Jing2, and GUO Gang-Gang2,*
1 School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2 Key Laboratory of Crop Germplasm
Resources and Utilization, Ministry of Agriculture / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop
Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3Agricultural and Animal Husbandry College of Tibet University, Linzhi
860000, China; 4 China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027, China
Abstract: Barley malt is one of the main raw materials used in beer production. Malt purity determines the level of its homogene-
ity, which affecting processing techniques and beer quality. For the efficient and accurate identification of malt purity, providing
evidence for the malt raw materials procurement and quality monitoring in beer production, the purities of six proportionally pre-
mixed malt samples and another four blind samples were detected by using EST-SSR and SNP markers in this study. The results
showed that the samples with mixing ratio higher than 10% were distinguished with EST-SSR markers in qualitative detection,
whereas those with SNP markers were more effective even the sample impurity as low as 5%. In the quantitative detection, the
standard error between the measured value and the true value was lower than 3% in one sampling. Obviously, both of the two
types of molecular markers are all can be used for malt purity test, but KASP assay based-SNP detection is more suitable for rapid
and quantitative malt purity test.
Keywords: Barley malt; Purity test; Molecular marker; KASP
自2002年起, 我国啤酒产量连续12年居世界首
位, 目前年产销量达到5000万吨, 占全球总量的四
分之一[1]。啤酒消费量稳定增长的同时, 消费者对啤
酒的风味和质量要求也进一步提高。大麦麦芽作为
啤酒工业的主要原料, 其质量的优劣直接关系到啤
酒的品质和口感。由于不同大麦麦芽品种之间的淀
粉、蛋白质、β-葡聚糖以及酶系活性等均存在一定
差异, 其酿造工艺也有一定差异, 啤酒企业对大麦
1148 作 物 学 报 第 41卷


麦芽纯度要求在97%以上, 因此麦芽纯度检测是啤
酒加工企业尤为重视的问题[2-4]。然而, 由于我国农
业生产的不确定性和进口大麦原料价格低廉等原因,
国内多数啤酒和麦芽企业没有建立自有的原料大麦
供应基地, 而不同的啤酒大麦品种从种源控制、田间
收获、销售收购、制麦进料, 直至麦芽出厂的产业链
中, 多个环节都存在导致麦芽纯度变化的风险。
常用的品种纯度检测方法有蛋白质电泳法、同
工酶电泳法和DNA指纹图谱法等。蛋白质电泳法是
依据蛋白质电泳产生的特征蛋白质分子标记将不同
品种区分开来, 具有重复性好, 稳定性强的优点。早
在1986年, 国际种子检验协会就正式颁布了应用蛋
白质酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(pH 3.2)鉴定小麦和
大麦品种的标准程序 [5], 但该方法不能有效区分亲
缘关系较近的品种, 限制了它的使用范围[6]。同工酶
电泳法可以实现大量样品的低成本检测, 具有稳定
性好、重复率高的特点, 是目前啤酒生产企业应用
最为广泛的麦芽纯度检测方法, 但可利用的同工酶
数量少、多态性低, 而且酶提取要求高, 导致检测效
率偏低[7]。随着DNA分子标记的开发和利用, DNA指
纹图谱逐渐成为鉴定种子纯度的另一种重要方法。
DNA指纹图谱法主要依靠RFLP、AFLP、RAPD和
SSR等类型的DNA分子标记来构建不同品种的指纹
图谱 , 然后利用具有多态性的标记检测样品的纯
度。谷方红等[8]从20对引物中筛选出3对多态性高的
AFLP标记完成对11个啤酒大麦品种的区分。Tinker
等[9]从70个RAPD标记中筛选出9个标记可区别27个
大麦品系和20个DH系。黄祥斌等[10]采用PCR-RAPD
技术 , 鉴定了来自北美洲的5个二棱和11个六棱啤
酒大麦品种。Russell等[11]利用4对SSR标记的不同组
合可以区分24个大麦品种, 也可以有效区分来自相
同亲本的不同基因型。
与其他类型的分子标记相比, SNP标记在植物
基因组中的分布最为普遍, 不断发展的SNP检测技
术为其应用提供了便利。目前, 利用SNP标记进行农
作物品种鉴定的研究已有相关报道, 兰青阔等[12]应
用高分辨率熔解曲线(high resolution melting, HRM)
技术筛选出用于黄瓜杂交种纯度鉴定的SNP位点
CLA6 (A/G), 结合焦磷酸测序技术, 建立了相应的
黄瓜杂交种纯度鉴定方法。喻辉辉等[13]开发了基于
水稻全基因组SNP信息的芯片RICE6K, 该芯片包含
籼稻和粳稻亚种的多态性信息, 可用于水稻品种的
基因型以及纯度鉴定。
DNA提取是保证研究结果真实可靠的前提, 叶
片、根系等植物新鲜组织是最常用的提取材料, 而
麦芽很少用于DNA提取, 并且麦芽DNA提取方法也
鲜有报道, 可能是由于麦芽DNA在制麦过程的高温
阶段容易被破坏, 致使完整的DNA量少且易降解。
谷方红等[14]利用植物DNA提取试剂盒(DNeasy Plant
Mini Kit, QIAGEN)及CTAB法, 获得了质量较好的
麦芽DNA, 而采用酚-氯仿法的提取效果不理想。为
确定最适合的麦芽DNA提取方法 , 本研究比较了4
种DNA提取方法的提取效果。
目前, 针对SNP标记的检测手段也从常规测序、
CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences)、
dCAPS (derived cleaved amplified polymorphic se-
quences)等发展到用Taqman探针 [15]、HRM [16]、
AS-PCR (allele-specific PCR) [17]和KASP (Kompeti-
tive allele-specific PCR) [18]等多种快速精准检测方
法。同时由于当前基于同工酶和SSR分子标记等常
规检测技术已不能满足企业开展规模化、快速高效
的麦芽纯度检测的需求, 本研究提出利用最新发展
的 SNP标记检测技术鉴定麦芽纯度。通过比较
EST-SSR和SNP标记对大麦麦芽预混样品和盲样的
定性和定量纯度检测, 确定基于KASP技术的SNP标
记检测方法可以实现麦芽纯度的快速定量检测, 能
够满足啤酒原料质量监测的产业化需求, 为保障啤
酒的商品品质提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 麦芽预混样品和盲样的制备
麦芽预混样品和盲样均由中国食品发酵工业研
究院制备。其中, 预混样由样品A (红08-746, 国家大
麦北方区试的参试品系)和样品B (甘啤6号, 国家大
麦北方区试对照品种)按不同粒数比混合而成, 混杂
比例为2%、5%、10%、20%、40%和50%, 依次命名
为T1~T6; 4个麦芽盲样由参加区试的其他品种(系)
按照质量比混合制备, 命名为C1~C4。
将上述制备的麦芽预混样和盲样分别混合均匀,
然后各取100粒混合磨粉、DNA提取 , 并分别用
EST-SSR标记和SNP标记进行纯度定性检测。
从混合均匀的4份麦芽盲样中2次抽样(每份样品
每次48粒), 以单粒提取DNA, 在麦芽盲样定性检测筛
选出多态性SNP标记的基础上, 开展纯度定量检测。
1.2 DNA提取方法
分别采用植物种子DNA快速提取法 [19]、改良
第 8期 张利莎等: 基于 EST-SSR和 SNP标记的大麦麦芽纯度检测 1149


CTAB法 [20]、植物DNA提取试剂盒 (DNeasy Plant
Mini Kit, QIAGEN)和新型植物基因组DNA快速提
取试剂盒(北京强欣博瑞生物技术有限公司) 4种方
法提取DNA, 并取1.5 μL DNA在0.8%琼脂糖凝胶上
电泳检测纯度。
1.3 引物的合成、筛选与反应体系
1.3.1 EST-SSR 引物 根据已报道的遗传图谱信
息, 挑选出均匀分布于大麦 7条染色体的 40对大麦
EST-SSR 引物。引物序列从 Graingenes2.0 (http://
wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)数据库获得, 引
物由北京赛百盛公司合成(表 1)。PCR体系为 10 μL,
含 1 μL DNA (50 ng μL–1), 5 μL无染料的 2× pfu PCR
Mix (北京强欣博瑞生物技术有限公司), 正向和反
向引物各 1 μL (2 μmol L–1)。在 T100型热梯度循环
仪(Bio-Rad)上进行 PCR, 反应程序为 94℃预变性
5 min; 94℃变性 30 s, 56℃退火 30 s, 72℃延伸 45 s,
37个循环; 72℃延伸 7 min。利用 QIAxcel Advanced
全自动 DNA/RNA分析系统(QIAGEN), 通过高分辨
率毛细管电泳分离扩增产物。
1.3.2 SNP引物 根据本实验室前期研究结果
(未发表 ), 挑选出均匀分布于7条染色体上的30个
SNP标记 , 并将其侧翼序列信息提交 LGC公司
(Laboratory of the Government Chemist, Hoddeston,
UK)进行KASP引物的设计和合成(表2); PCR体系为
5 μL, 包括1.5 μL DNA (10 ng μL–1), KASP Mix 2.5
μL (LGC Genomics, Hoddeston, UK), 0.07 μL KASP
Assay Mix和1 μL ddH2O。PCR和荧光信号检测在
ABI 7900荧光定量仪上完成。PCR程序为94℃热激
活15 min; 94℃变性20 s, 61~55℃退火和延伸60 s, 10
个循环 (touch-down, 每循环降低0.6℃ ); 94℃变性
20 s, 55℃退火和延伸60 s, 30个循环。
1.4 数据统计及分析
利用QIAxcel Screen Gel软件分析EST-SSR标记
的毛细管凝胶电泳分型结果, 按照峰图及带型特点,
统计同一对SSR引物扩增条带在各个样品中的有无
或片段大小差异。
利用ABI 7900荧光定量PCR仪配套分析软件的
基因分型模块, 读取各样品的两种不同荧光信号值
并分析基因型 , 在SNPViwer2软件(LGC Genomics,
Hoddeston, UK)中生成基因分型图。
2 结果与分析
2.1 不同麦芽 DNA提取方法比较
用 4种方法分别提取麦芽样品B的基因组DNA,
用琼脂糖凝胶电泳检测提取纯度, 2次重复结果一致
(图 1)。用植物种子 DNA快速提取法获得的 DNA有
少量杂质 , 而其他 3种方法均能得到质量较好的
DNA。鉴于用改良 CTAB 法提取的 DNA 质量可以
满足本实验需要, 且该方法成本低、批量提取所耗
时间与试剂盒差别不大, 故后续实验中均采用改良
CTAB法提取麦芽样品的基因组 DNA。

图 1 4种 DNA提取方法进行麦芽 DNA提取的凝胶电泳检测
结果
Fig. 1 Gel electrophoresis of malt DNA by using four
extraction methods
M: DL2000; 1~2: 植物种子 DNA快速提取法; 3~4: 改良 CTAB
法; 5~6: DNeasy Plant Mini Kit; 7~8: 新型植物基因组 DNA快速
提取试剂盒。
M: DL2000; Lane 1–2: rapid seed DNA extraction method; Lane
3–4: improved CTAB method; Lane 5–6: DNeasy Plant Mini Kit;
Lane 7–8: New Plant DNA Extraction Kit.

2.2 麦芽预混样纯度的定性检测
2.2.1 EST-SSR 对纯度的定性检测 高分辨率毛
细管电泳结果显示, 40 对 EST-SSR 标记中有 5 对
(HvHVA1、HVM70、GBM1008、HVPLASC1B 和
HVMLOH1A)在麦芽样品 A和 B间的扩增产物片段
具有长度多态性。利用这 5 对多态性标记对麦芽预
混样品 T1~T6 进行纯度定性检测, 结果 HVM70 和
GBM1008 可有效区分混杂度在 10%以上的样品 ,
HVPLASC1B 能够区分混杂度在 20%以上的样品,
而 HvHVA1和 HVMLOH1A仅能区分混杂度在 40%
以上的样品(图 2-a)。
2.2.2 SNP 对纯度的定性检测 在所有 30 个 SNP
标记中, D01、D03、D22、D26、D27和 D30呈现多
态性高且稳定性好。利用这 6个标记对 T1~T6麦芽
预混样进行检测, 对混杂比例为 2%的样品进行分型
时, 除标记 D01 可以区分样品外, 其他标记由于荧
光信号值非常接近样品 B而不能被确定为杂合样品,
但 5个多态性标记均可以对混杂度在 5%以上的麦芽
样品进行有效区分。从 SNP荧光信号二维图中可以
看出, 样品 A 和样品 B 分别靠近两坐标轴, 即分别
对应不同的 SNP 类型; 多数麦芽预混样落在 2 种荧
光信号值接近的对角线附近, 说明对应 2 种 SNP 的
荧光信号均被有效检出 , 从而被判定为含杂样品。
1150 作 物 学 报 第 41卷


表 1 本研究所用 EST-SSR标记
Table 1 EST-SSR markers used in this study
引物序列 Primer sequence (5′–3′) 引物
Primer
染色体
Chr. 正向 Forward 反向 Reverse
重复基序
Motif
GBM1451 1H GACTCCTTCATCCACCCCTC TACGCCGTCGAGTACCTCTC (TCG)7
HVM64 1H GATGTGAAGGCTGCCCTG ACACGCCCTATTACCCAGTG (GA)4(GT)7(CT)2, (GT)4(GA)8
HVM20 1H CTCCACGAATCTCTGCACAA CACCGCCTCCTCTTTCAC (GA)19
GBM1051 1H ACTCGGCGAAAGGACTCTCT AGCTGCATGTTCCTCTCCAG (AGG)5
HVM43 1H GGATTTTCTCAAGAACACTT GCGTGAGTGCATAACATT (CA)9
GBM1143 1H TCCAACGGCACTAGCAATTT GAAAATATGAAGGCGGACCA (AG)7
HvHVA1 1H CATGGGAGGGGACAACAC CGACCAAACACGACTAAAGGA (ACC)5
GBM1121 2H ACCACCCCCATCCATCAG GACTGCACCTTGTAGCCGAT (AG)7
HVM36 2H TCCAGCCGACAATTTCTTG AGTACTCCGACACCACGTCC (GA)13
GBM1214 2H ATGCTACAGCAAGCATGCAC TGGTGAGGATGTCGGAGAAC (CA)15
HvXan 2H CAGCCACCTCCATAGTACTT CTGCTCTAGGCTCGTGTT (CCT)6
GBM1062 2H GACTTGTGGCTAGCACGTCA GAGGGGCATTATTCTGCTTG (AAAC)5
HV13GEIII 3H AGGAACCCTACGCCTTACGAG AGGACCGAGAGTGGTGGTGG (AT)5
HVM09 3H CTTCGACACCATCACCCAG ACCAAAATCGCATCGAACAT (TCT)5
HVM27 3H GGTCGGTTCCCGGTAGTG TCCTGATCCAGAGCCACC (GA)14
HVM44 3H AAATCTCAGGTTCGTGGGCA CCACGGAGACCACCTCACTT (GA)8
HVM60 3H CAATGATGCGGTGAACTTTG CCTCGGATCTATGGGTCCTT (AG)11, (GA)14
GBM1034 3H AGGTGAACGCTACAGGCATC GACAGACGCTCCCTGAGTTC (AT)7
GBM1233 3H TTAACCCCCAATGTCAGGAA AATGTGTTCACTGTGGCTGC (CG)8
HVM70 3H CCGCCGATGACCTTCTC ACCCACGACCTATGGCAC (CA)8
HVM15 3H TCATAACCACGGCGTCCT CGTGACTGGAAACCCTGC (GA)8
GBM1221 4H ACCAGCAATCCAAGTTACGG TGCCTTGGTCTTGGTGTGTA (AC)10
HVM40 4H CGATTCCCCTTTTCCCAC ATTCTCCGCCGTCCACTC (GA)6(GT)4(GA)7
HVB23D 4H GGTAGCAGACCGATGGATGT ACTCTGACACGCACGAACAC (GT)6
GBM1323 4H GCTCTCCAGGGTTCGTTTC CACCGTCTTGCAGTTGAGAC (GCC)8
GBM1044 4H CGCATGGCATCAACTACAGA ATCTCTGCCCAAAGATGAGC (AAG)6
GBM1003 4H GCCGACCAGATCATCAGATT CATCTCACTGTCGTGGCTTG (CTT)8
HVMLOH1A 4H CCTCCCCTCTGATATGATAA GTACAGACGGTTTAATTGTCC (GA)6
GBM1015 4H TTGTTGGAACATACAAACATGC AAGAGGCAAGTCCCTTCAGA (ACAT)13
HVM67 4H GTCGGGCTCCATTGCTCT CCGGTACCCAGTGACGAC (GA)11
GBM1438 5H TGAAGGAGATCAAGAACGGC ATCAGTCCGGAAAGACATGC (GC)11
HVM06 5H CATGAATGAATGATTGGTTTTG CGCATCCGTATGTATGAGTAA (GA)9
HVM07 5H ATGTAGCGGAAAAAATACCATCAT CCTAGCTAGTTCGTGAGCTACCTC (AT)7
GBM1215 6H ATGACCAGAAAACGCCTGTC GGATTCTGCACACACGAGAA (AC)12
HVM31 6H CGGTTTCTGGTTGCTTGG CGAAGCTCTCAGGCTTCATG (AC)9
HVM74 6H AGGAAGTCATTGCGTGAG TGATCAAGAATGATAACATGG (GA)13
GBM1008 6H CCATCATAACAGCAATGGACA TCTCGGTTTGTGACGCTATG (AAC)10
HVPLASC1B 7H GTGCATGCATCATATTGATTA ACGTACGTACTTATCACGAAGA (TCTAC)4
GBM1516 7H CCCTCTCCTTTCCCTATCGT GTGGGGTTGATGTTCCTGTT (CT)9
HVM51 7H TCTAAATTACCTTCCCAGCCA AAAGCAGACATGTAGGAGGTCA (GA)3(GGGA)3 (GA)8
黑体引物表示本试验中的多态性标记, 其扩增产物为 159/162 bp (HvHVA1)、175/178 bp (HVM70)、200/207 bp (HVMLOH1A)、
106/109 bp (GBM1008)和 127/133 bp (HVPLASC1B)。
Bold primers were polymorphic in this study and the amplified products are 159/162 bp (HvHVA1), 175/178 bp (HVM70), 200/207 bp,
(HVMLOH1A), 106/109 bp (GBM1008), and 127/133 bp (HVPLASC1B).
第 8期 张利莎等: 基于 EST-SSR和 SNP标记的大麦麦芽纯度检测 1151


表 2 本研究所用 SNP标记
Table 2 SNP markers used in this study
标记
Marker
染色体
Chr.
变异碱基
SNP
序列
Sequence (5′–3′)
D01 1H [T/G] GGAGGTGGTGCAGTACTGCT[A/C]CGCTGTGGACATGGATCAG
D02 1H [A/G] GAGACAGACATCATATACAT[A/G]TCTTCTTTTGGCTCATTTG
D03 1H [T/C] TCCTTGCTCAGCCGCCCCTT[A/G]TCGTTGGTGATGGTGATCT
D04 1H [A/G] TTGGTACTCAGTAGTGTGTT[A/G]TCGTTCCGCCCGTCTGTCT
D05 2H [A/G] AGCACCACCGTCAAGGACGA[A/G]GAGGGCATGCCGGCCTTCG
D06 2H [A/C] CAGGCACTACAATCGGTAAG[A/C]GGTATGCAAGGACAGACGA
D07 2H [T/C] TGGGAACTGTGGGGCACACC[A/G]CGTGTCCCGTGGGAATCAT
D08 2H [G/C] TATGGTTATGCGAGCTCCCT[C/G]GGTAAAAGGGCTTCCATGG
D09 3H [T/C] ACCATCCCACGGCCTTCGAC[A/G]CTAAGCTTTGAAGCCTGAA
D10 3H [T/C] CCTCCTGATAGCTGTATGCC[A/G]TGCTCTCCACAATCAGTGT
D11 3H [G/C] GGTAGTCAAAAGATTCCACA[C/G]AGCTCCAAGTCCCGCTCTC
D12 3H [T/C] GATATAAGCTCCTTGAACTG[A/G]CCGTCATATGCGTTTGACG
D13 3H [T/G] TTTGTGCATCCMAGACAGG[A/C]AAAGCACACCACAAGGACA
D14 4H [A/T] TCGGCGCCAAATTTGGACAT[A/T]GTCGTGCAAAGATCCCTGA
D15 4H [C/G] ATACCAGTGGATTTGAAAAG[C/G]CTGACACAGGACCTGAACC
D16 4H [A/G] GCTTTACTCTGGTCAGCAGC[A/G]ATTTCATCTGGAAACAACT
D17 4H [T/C] CCGATGGAGCTGGTCCCTGT[A/G]ATCTGTGTGGCCTTCCCCT
D18 5H [A/G] TCCAGCATTAACGTTCTGCG[A/G]CCACTTACGAACATGCTCA
D19 5H [A/C] TTCCAAGGGGTGAACTGTTG[A/C]TGTTCTTCTCTGTCCTTGC
D20 5H [G/C] TCCAGCCACCGCCCCACCTT[C/G]GTGATCTCCTAGCGCGCGC
D21 5H [A/G] CATGACGATGAAGATTCCCC[A/G]AAATTCATTTCGGGGTTTC
D22 5H [G/C] TGCTGTGGGTCTTGAACCGT[C/G]GTCGCCACGGGAAAAGAGA
D23 6H [T/C] GGAATCAGCAAAAAAATCCG[A/G]GAAAGAGGCTGATTTCTTA
D24 6H [T/C] GTTTGGACGACTCGGCGACG[A/G]GAGAAGCCGAGGAGAGGAA
D25 6H [T/C] AGATGTAAACCTGGCAAGGG[A/G]AGAGGGAACCTGCGATGTC
D26 6H [C/G] GGCAAAGCAGATCAAGATGT[C/G]GAGAACGAAGAGCAGAACG
D27 7H [T/C] AAATAACAACATATCAGGGY[A/G]GGCTTAGAAACCCTGCTCG
D28 7H [A/G] ACAACCTGATTTGATTGATG[A/G]ATCACACGCCTTGCAATTT
D29 7H [A/G] GTGAAGAAGAAGATCTAATC[A/G]AAGAGGGAGAAGCCAAGGT
D30 7H [T/C] CAATTTGCTTTTGCTTCACC[A/G]GAGTTTGTGTAGATGCGAA

检测结果还显示, 按照预混比例从小到大逐渐偏离
样品B (图2-b)。
2.3 SNP标记对麦芽盲样纯度的定量检测
麦芽盲样的定性检测发现, 在30个SNP位点中
13个呈杂合类型, 分别是D06、D15~D17、D20~D25
和D28~D30, 其中D20和D21在样品T1~T6中呈多态
性, 因此选择这2个SNP标记对4份麦芽盲样进行纯
度定量检测, 结果显示各盲样均有不同程度的混杂,
且2次抽样检测结果一致(图3)。
对 SNP 检测为纯合的样品进行计数, 计算麦芽
盲样的样品纯度(数量百分比)。与盲样制备方提供的
真实值(质量百分比)比较, 结果 2次抽样检测的均值
与真实值的相对误差介于–0.29%和 1.79%之间。C1
和 C4 为麦芽纯度为 93% (质量百分比)的同一样品,
经多次检测 , 实测纯度 (数量百分比 )为 92.71%~
94.79% (表 3), 符合工业化检测的误差要求。
1152 作 物 学 报 第 41卷



图 2 分子标记对不同混杂比例麦芽预混样的定性检测
Fig. 2 Qualitative test of premixed malt samples with different mixing ratios using molecular markers
a图为 EST-SSR标记 GBM1008和 HVPLASC1B高分辨率毛细管电泳的检测结果, 其中 T1~T6代表混杂比例分别为 2%、5%、10%、
20%、40%和 50%的预混样, B和 A分别代表甘啤 6号和红 08-746; b图为基于 KASP技术的 SNP标记 D01和 D27的检测结果, 其中
B和 A分别代表甘啤 6号和红 08-746, NTC代表无模板对照。
The high performance capillary electrophoresis profiles of EST-SSR markers GBM1008 and HVPLASC1B are shown in panel a. T1 to T6
represent samples with mixing ratios of 2%, 5%, 10%, 20%, 40%, and 50%, respectively. B and A represent variety Ganpi 6 and line Hong
08-746, respectively. The KASP-based results of SNP markers D01 and D27 are shown in panel b. B and A represent variety Ganpi 6 and line
Hong 08-746, respectively. NTC represents blank control without template.

图 3 SNP标记 D20和 D21对麦芽盲样 C1~C4的定量检测结果
Fig. 3 Quantitative detection of blind malt samples C1 to C4 using SNP markers D20 and D21

第 8期 张利莎等: 基于 EST-SSR和 SNP标记的大麦麦芽纯度检测 1153


表 3 SNP标记 D20和 D21定量检测盲样的麦芽纯度
Table 3 Quantitative test of blind malt samples using SNP markers D20 and D21 (%)
纯度检测值 Measured purity 盲样
Blind sample D20 D21 平均值 Mean
真实值
True value
C1 95.83 93.75 94.79 93
C2 87.50 87.50 87.50 86
C3 79.17 81.25 80.21 79
C4 93.75 91.67 92.71 93
纯度检测值为数量百分比, 真实值为质量百分比。
The measured purity is the percentage upon grain number and the true value is the percentage upon grain weight.

3 讨论
当前 , 由于啤酒产业链中麦芽生产环节众多 ,
各种主客观因素导致的大麦麦芽纯度下降已成为影
响啤酒企业生产效率和啤酒品质的亟待解决问题之
一。尽管基于同工酶和SSR分子标记等技术的检测
手段已经广泛应用于麦芽纯度检测, 但前人基于分
子标记的麦芽纯度检测, 仅限于对发芽前的种子和
培养后的叶片DNA进行检测, 并非对制备好的麦芽
样品直接检测, 难以满足企业对于麦芽纯度结果的
时效性需求。因此, 本研究首先比较了4种DNA提取
方法在麦芽DNA提取上的适用性、DNA质量、单个
样品提取的时间及费用成本 , 发现4种常用方法虽
均能够满足麦芽DNA提取的需要, 但综合考虑DNA
质量、操作时间和实验成本等因素, 确定改良CTAB
法是最适合的麦芽DNA提取方法。其次, 比较了当
前常用的两种分子标记麦芽纯度检测的效果, 发现
两种标记均能用于一定混杂度麦芽样品的纯度检测,
但EST-SSR检测需要电泳才能显示结果 , 而SNP分
型结果仅需在可检测荧光标记的酶标仪或荧光定量
PCR仪上读取信号 , 可以大大节省结果产出时间 ;
而且SNP标记在定性检测中的灵敏度和准确性更高,
大于5%的麦芽混杂均可以被定性检出。因此, 将多
态性高的SNP标记结合KASP技术, 可以实现麦芽纯
度快速定性和定量鉴定, 这为满足啤酒原料的源头
质量监测和啤酒品质控制提供了保障。
SNP标记针对麦芽盲样定量检测结果显示, 测
量值与真实值间误差小于3%, 且以质量比计算得出
的麦芽样品纯度与以数量比得出的纯度测量值, 在
无法确定混合前各自样本千粒重的前提下, 本身应
存在着一定的差异。因此, 本研究的误差水平完全
可以满足工业化检测的需求。同时, 建议在样本量
允许的情况下, 可以通过增加抽样检测的次数和增
加单次检测的样本量以进一步提高检测的精度。
此外, 通过逐步建立啤酒工业常用的大麦品种
的SNP指纹数据库, 一方面可以利用最少的标记实
现麦芽纯度检测的需要, 大大降低针对盲样开展多
态性标记筛选的工作量和鉴定成本, 另一方面利用
最少数量的多个SNP标记联合鉴定, 可以实现真正
意义上的混杂麦芽来源品种追溯, 实现麦芽纯度的
全流程控制, 为啤酒产业的良性发展提供保障。
4 结论
推荐改良CTAB法作为大麦麦芽DNA提取的最
适方法。EST-SSR和 SNP两种分子标记对麦芽纯度
的检测结果具有有效性和可靠性, 但综合考虑检测
灵敏度、检测效率和实验成本等因素, SNP 标记较
EST-SSR标记更具优势。建立了基于 SNP标记的麦
芽纯度高效定性、定量检测技术体系, 为大麦麦芽生
产和质量控制的全流程动态监测提供了解决方案。
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