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Screening of Methyl Jasmonate-Insensitive Mutants in Maize

玉米茉莉酸甲酯不敏感突变体的筛选



全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(9): 14541461 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31270317)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 昉黄大 , E-mail: huangdafang@caas.cn; 郎志宏, E-mail: langzhihong@caas.cn
Received(收稿日期): 2015-02-09; Accepted(接受日期): 2015-05-04; Published online(网络出版日期): 2015-06-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150603.0901.009.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01454
玉米茉莉酸甲酯不敏感突变体的筛选
查象敏 1 汪 海 1 路小铎 2 张春义 1 昉黄大 1,* 郎志宏 1,*
1中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081; 2齐鲁师范学院生命科学学院, 山东章丘 250200
摘 要: 植物激素茉莉酸(jasmonic acid, JA)作为一种可以长距离运动的信号分子在植物对昆虫侵害的系统抗性中起
核心调控作用。为了解析玉米 JA 信号途径及抗虫机制, 本研究利用改进的玉米突变体的筛选方法, 筛选与 JA 信号
途径相关的突变体用于下一步的研究。将甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)诱变的玉米突变体库 6118份种
子分别置含有外源茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)的培养基中培养, 通过观察玉米根系的生长情况, 确定对
MeJA的不同耐受性。当 MeJA终浓度为 50 µmol L–1时, 初步筛选到对 MeJA不敏感的 I级耐受性突变体 61株; 当
MeJA终浓度分别为 100 µmol L–1和 200 µmol L–1时进行验证, 得到的耐受性事件分别为 37株和 10株。对自交收获
的子一代遗传性分析表明, 这些突变体对 MeJA 表现出的耐受性具有可遗传性。筛选获得的对 MeJA 不敏感突变体
可能与 JA调控有关, 是研究玉米 JA信号途径的很好材料。
关键词: MeJA/JA; 玉米突变体库筛选; MeJA不敏感; 玉米虫害应答
Screening of Methyl Jasmonate-Insensitive Mutants in Maize
ZHA Xiang-Min1, WANG Hai1, LU Xiao-Duo2, ZHANG Chun-Yi1, HUANG Da-Fang1,*, and LANG
Zhi-Hong1,*
1 Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 School of Life Sciences, Qilu Normal Uni-
versity, Zhangqiu 250200, China
Abstract: The phytohormone jasmonate plays a pivotal role in plant systematic resistance to herbivores attack as a long-distance
mobile signal. To demonstrate the Jasmonic acid (JA) signal pathway and the insect-resistant mechanism in maize, we utilized an
improved approach to screen the maize mutants associated with JA signal pathway, which will be available for further research.
The 6118 lines’ seeds from EMS-mutagenic maize mutants library were cultivated in the medium containing the exogenous MeJA.
The different tolerances of the mutants to MeJA were identified by observing the growth of maize roots. When the final concen-
tration of MeJA was 50 µmol L–1, 61 MeJA-insensitive mutants with tolerance Grade I were obtained in the primary screening
experiment. When the final concentration of MeJA was 100 µmol L–1 or 200 µmol L–1, 37 and 10 tolerant events were gained in
the confirmation experiments, respectively. Then, we analyzed the heredity of M1 seeds tolerant to MeJA. The results showed that
the tolerance of the mutants to MeJA was hereditable. The MeJA-insensitive mutants associated with JA regulation pathway are
the potential materials for the further studies of JA signal pathway and insect resistant mechanism in maize.
Keywords: MeJA/JA; Screening maize mutants library; MeJA-insensitive; Insect attack response
高等植物在长期的进化过程中形成了复杂而精细的
抗性反应机制以抵抗昆虫的侵害。茉莉酸(JA)在植物防御
如植物与食草动物之间的相互作用方面起着重要作用。
Reymond等 [1]的研究表明 , 在拟南芥叶片中 , 约 67%~
85%的伤害诱导和昆虫诱导的基因是由JA调控其表达的,
超过 1.3%的蛋白编码基因是通过激活JA信号来响应伤害
诱导表达的。这些蛋白编码基因被分为功能基因(如茉莉
酸合成、茉莉酸信号组件等基因)、防御基因和胁迫响应
基因等。李常保等 [2]以番茄为模式系统研究植物对昆虫
抗性反应的分子基础 , 筛选获得番茄抗性缺失突变体
spr6。研究表明, 茉莉酸(JA)能够以剂量依赖的方式诱导
蛋白酶抑制剂II (protease inhibitor, PI-II)的表达, Spr6 基
因是LeCOI1 基因单碱基突变形成的一个等位基因 , 该
突变并没有影响JA的基础含量, 但影响了受伤诱导的JA
第 9期 查象敏等: 玉米茉莉酸甲酯不敏感突变体的筛选 1455


的积累。
基于 JA 途径在植物防御中的重要作用, 在 JA 的生物
合成与调控方面的研究进展很快, 已有多篇文献综述[3-9]。
在信号转导方面, JA 通过与转录因子间的相互作用来调
控防御蛋白的表达及次生物质的合成[10]。JA 信号发生在
细胞核中, 它作为信号分子会诱导相关抗逆基因的表达,
从而增强植物的抗逆性[2]。拟南芥 JA 信号途径在没有外
界胁迫的情况下, JAZ蛋白与MYC2及其他转录因子结合
处于失活状态 , 不能启动基因转录 ; 一旦植物受到生物
(如昆虫、真菌激发子等)和非生物(如干旱、高盐和低温等)
胁迫刺激时, 植物体内合成大量 JA, 在依赖 ATP的腺苷酸
形成酶 JAR1的作用下形成 JA-Ile, JA-Ile与它的受体 COI1
结合, COI1蛋白与 SCF泛素 E3连接酶形成复合物[11], 此
复合物与 JAZ 蛋白相互作用并被泛素化。然后, JAZ 蛋白
在 26S蛋白酶体的作用下降解, 解除对 MYC2转录因子的
抑制作用, 从而启动 JA响应基因的转录[5,8,12-13]。
JA合成与信号转导链突变体是剖析 JA合成与信号转
导最有效的工具, 如拟南芥突变体 aos、opr3、coi1、jar1
等。JA合成基因缺陷的敲除突变体 CYP74A (AOS)是运用
反向遗传学的筛选方法分离得到的。此酶催化 JA合成途
径中的氢过氧化物脱水形成一种不稳定的丙二烯氧化物,
aos突变体在伤处理 1 h后, 内源 JA水平没有增加, 而野
生型增加了 100倍[14]。突变体 opr3是从拟南芥生物资源
中心的 28 个雄性不育的 T-DNA插入诱变的拟南芥株系中
筛选获得的, 该突变体缺乏 JA合成所必需的 12-氧-植物二
烯酸还原酶(OPR3), 而外源施用 JA可以恢复它的育性[15]。
coi1 突变体是在筛选抗冠菌毒素的拟南芥突变体中被鉴
定出来的 [16], 该突变体雄性不育, 且对 JA 不敏感 [16]。
1998年运用图位克隆的方法定位了 COI1基因, 该基因编
码 F-box蛋白[17]。野生型拟南芥幼苗在含有 0.1 µmol L–1
的 MeJA 琼脂培养基中, 根的生长有 50%受到抑制, 而
MeJA对突变体 jar1根伸长的抑制不敏感, 遗传学分析表
明该性状是隐性的, 且受单基因控制[18]。玉米 JA信号转导
方面的研究还鲜有报道, 拟南芥 JA合成与信号转导链突变
体的筛选方法为本研究的开展提供了良好的借鉴作用。
目前, 在玉米抗虫研究中, 主要是利用转基因技术外
源导入 Bt 杀虫蛋白基因来获得抗虫玉米, 而内源抗虫的
研究报道在国内外较少。本研究通过施用外源 MeJA, 观
察玉米幼苗根的生长抑制情况, 从 EMS 诱变的玉米突变
体库 6118 份种子中筛选出对 MeJA 不敏感的突变体, 并
对其进行遗传性分析。该突变体材料将为今后研究玉米抗
虫分子机理与 JA信号转导之间的关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
EMS 诱变的玉米郑 58 突变体库 6118 份种子[19], 保
存于中国农业科学院生物技术研究所。琼脂粉购于北京普
博欣生物科技有限责任公司。MS 培养基购于美国
PhytoTechnology Laboratories公司。植物凝胶购于北京迪
朗生化科技有限公司。 95%茉莉酸甲酯 (MeJA)购于
SIGMA-ALORICH 公司。24 孔细胞培养板购于美国康宁
(CORNING)公司。
1.2 方法
1.2.1 浸种处理 为了破除种子休眠, 提高发芽率并
使发芽时间同步, 首先对 6118 份玉米突变体库的种子和
对照野生型郑 58 种子进行浸种处理, 将种子依序放入 24
孔板中, 每孔 1 份, 每份 2 粒; 每孔加入无菌水, 盖好盖
后, 置 4℃冰箱过夜; 12 h 后取出并去除孔内的水, 加入
1%次氯酸钠溶液, 浸泡种子 15 min 后, 用无菌水清洗 3
次, 每孔内加无菌水, 置 4℃冰箱过夜。
1.2.2 转盒发芽 方形塑料盒(长 18 cm×宽 10 cm×高 4
cm)用 75%乙醇除菌后, 加入灭菌蛭石和适量无菌水, 拌
匀、铺平、压实, 备用; 去除 24 孔板内的水, 加入 1%多
菌灵溶液, 浸泡上述处理过的种子 15 min 后, 将包被有
多菌灵溶液的种子依序转入方形塑料盒内, 依序编号后,
用保鲜膜盖住, 放入暗培养室, 25℃培养 3~4 d。
1.2.3 耐受性筛选培养基的配制 该筛选培养基分两
层, 上层是 0.7%的琼脂, 起固定作用; 下层是 1/4 MS +
0.4%植物凝胶(Gelrite) + 终浓度 50 µmol L–1的 MeJA。先
配制下层培养基, 调 pH至 5.7~5.8, 121℃灭菌 20 min。待
培养基冷却至 50℃时, 加入 MeJA 溶液, 初筛浓度为 50
µmol L–1, 验证时的浓度为 100 µmol L–1和 200 µmol L–1,
充分混匀。取 80 mL培养基加入无菌组培玻璃管, 室温放
置, 待其凝固。将高压灭菌后的 0.7%琼脂冷却至 50℃, 取
50 mL 倒入已装有下层培养基的组培玻璃管, 室温放置,
待其凝固后使用。
1.2.4 转管培养 3~4 d 后, 将发芽的玉米种子(根长
1~2 cm)转至含有 MeJA 的培养基上培养。用镊子夹取种
子, 小心将根尖刺入琼脂中。在玻璃管外, 用记号笔注明
转管日期及转管时的根长。将转管后的种子放在光照培养
室, 光/暗周期为 16 h/ 8 h, 25℃培养 20 d。在培养的过程
中, 注意观察根的生长抑制情况, 并及时做好记录。
1.2.5 筛选和评价指标 在 50 µmol L–1 MeJA条件下
初筛, 观察 20 d 后玉米根的生长情况, 对照野生型郑 58
植株的根的生长停留在上层琼脂与下层 MS 培养基的交
界处, 不能超过交界处伸入到下层培养基中, 与对照相比,
若突变体的根伸入下层含有 MeJA的 MS培养基中, 且根
系发达, 幼苗更加粗壮, 则说明突变体对 MeJA 不敏感或
耐受; 若突变体的根的生长受到抑制, 只停留在琼脂层,
根系不发达, 幼苗矮小, 则说明突变体对 MeJA 敏感或不
耐受(表 1)。在 50 µmol L–1 MeJA条件下对突变体自交子
一代进行遗传分析, 记录 20 d后的玉米根伸入MS培养基
中的长度, 定量分析评价子一代的遗传性。
1.2.6 MeJA不敏感突变体的遗传性分析 收获耐受性
事件的子一代自交种子, 分别播种于 50 µmol L–1 MeJA和
100 µmol L–1 MeJA培养基及 50 µmol L–1 MeJA 蛭石介
1456 作 物 学 报 第 41卷


表 1 突变体对 50 µmol L–1 MeJA 不敏感或耐受性等级
Table 1 Insensitivity or tolerance grade of the mutants to 50 µmol L–1 MeJA
根伸长的程度
Degree of root elongation
幼苗表型
Phenotype of seedlings
对 MeJA不敏感或耐受的等级
Insensitivity or tolerance grade to MeJA
根伸长到管底, 且继续在底部生长。
Roots elongate to the bottom of tube, and
continuously grow in the bottom.
根系非常发达, 幼苗粗壮。
Flourished root system, and burly seedling.
I级: 非常不敏感或非常耐受。
Grade I: very insensitive or very tolerant.
根伸长到下层培养基的中下部, 尚未到管底。
Roots elongate in the middle and lower MS
culture medium, not yet to the bottom of the tube.
主根粗壮, 侧根较多。
Burly taproot , more lateral roots.
II级: 较不敏感或较耐受。
Grade II: insensitive or tolerant.
与野生型根伸长情况相似, 根停留在交界处。
Similar to the wild type root elongation, roots
stay on the border.
主根短小, 侧根较少, 幼苗矮小。
Short taproot, less lateral roots, short seedling.
III级: 敏感或不耐受。
Grade III: sensitive or intolerant.
根停留在交界处以上。
Roots stop elongation above the border.
主根短小, 无侧根, 幼苗矮小瘦弱或死亡。
Short taproot, no lateral roots, short or dead
seedling.
IV级: 非常敏感或非常不耐受。
Grade IV: very sensitive or very intolerant.
此表适用于 50 µmol L–1 MeJA条件下突变体的初步定性筛选。
The table is suitable for the preliminary qualitative mutants screening in the condition of 50 µmol L–1 MeJA.

质中 , 观察根在培养基中的生长抑制情况和在蛭石中的
发芽情况。用培养基的筛选方法与初筛相同, 对照为野生
型郑 58, 并分别在含有 MeJA和不含 MeJA的 MS培养基
中生长。在含有MeJA的蛭石中培养方法如下, 先将 10 μL
95% MeJA (w/v)溶于 10 mL无水乙醇中, 再用无菌水稀释
至 1000 mL, 混匀, 使 MeJA的终浓度为 50 µmol L–1, 用
此 MeJA 溶液拌蛭石, 最后将子一代种子和野生型郑 58
种子转到装有蛭石的塑料盒中 , 并用保鲜膜包裹住塑料
盒, 防止液体挥发。暗培养室 25℃放置 3~4 d, 观察发芽
和根的生长情况。
2 结果与分析
2.1 50 µmol L–1 MeJA条件下不敏感突变体的初步筛选
在进行筛选实验之前, 首先预实验确定最适的 MeJA
筛选浓度。在浓度梯度实验中, 分别设置 5 µmol L–1、10
µmol L–1、20 µmol L–1、50 µmol L–1、100 µmol L–1、150
µmol L–1 和 200 µmol L–1 的浓度梯度, 结果表明, 随着
MeJA 浓度的增大, 玉米根的生长受抑制的程度越来越严
重, 而观察玉米根系生长情况的最适宜 MeJA 浓度为 50
µmol L–1。因此, 在初步筛选时, 我们确定筛选压力为终
浓度 50 µmol L–1 MeJA。对照为野生型郑 58。从 6118份
突变体中初步筛选获得对MeJA不敏感的 I级耐受事件 61
个(表 2, 含表中的 a、b和 c), 占突变体库总数的 0.997%,
说明该 EMS 突变体库诱变频率相对较高, 适于进行各种
突变体的筛选。与对照相比, 它们均表现出根系发达, 根
伸入玻璃管底部并继续生长; 幼苗粗壮, 生长速度快, 当
对照材料长到第 2、第 3片叶时, 它们均已长到第 5、第 6
片叶; 吸收培养基中的养分快而多, 对 MeJA 表现出较强
的耐受性。对照植株根的生长停留在上层琼脂与下层培养
基的交界处 , 主根短小 , 侧根较少或不发达; 幼苗矮小 ,
瘦弱, 生长速度慢, 对 MeJA 表现出较强的敏感性。如图
1所示, t580、t596和 t407对 MeJA不敏感性非常显著, 耐
受等级为 I 级; 而 t575、t587、t595、t388、t406 和 t424
对 MeJA表现出较不敏感性, 耐受等级为 II级。
2.2 100 µmol L–1和 200 µmol L–1 MeJA条件下初筛不敏
感突变体的验证
为了排除在 50 µmol L–1 MeJA条件下筛选到的 61个
I 级耐受性事件中假阳性的存在和确定这些事件对 MeJA
的耐受程度, 本研究对 61 个 I 级耐受事件进行了进一步
验证。分别在 MeJA终浓度 100 µmol L–1和 200 µmol L–1
条件下进行发芽试验, 20 d后观察结果: 在 100 µmol L–1
MeJA条件下, 61个 I级事件中有 37个事件的根伸入到含
MeJA的培养基中, 即交界面以下 1.0~1.5 cm处。与对照
相比, 主根粗壮, 侧根较多; 幼苗粗壮, 生长速度快, 对
照生长到第 3片叶时, 这些事件均已长到第 4、第 5片叶。
表明在MeJA终浓度 100 µmol L–1条件下, 这 37个事件耐
受性显著(图 2-A和表 2, 含 b和 c)。在 MeJA终浓度 200
µmol L–1条件下, 这 61 个 I 级事件中有 10个事件的根伸
长到含MeJA的培养基中, 即交界面以下约 1 cm处。与对照
相比, 主根粗壮, 有较少侧根, 幼苗粗壮, 而对照主根短小,
无侧根, 幼苗瘦弱。表明在MeJA终浓度 200 µmol L–1条件
下, 这 10 个事件仍然表现出一定的耐受性, 但在高浓度的
MeJA条件下, 根的生长受到抑制(图 2-B和表 2, 只含 c)。
2.3 MeJA不敏感突变体的遗传性分析
由于某些突变体存在不育性、畸形、早衰等现象而导
致不能结实或过早地死亡, 因此, 本研究筛选到的61个不
敏感突变体中只收获了46个事件(其中有19个在表2“a”,
23个在表2“b”, 4个在表2 “c”中)的自交子一代种子, 为了
第 9期 查象敏等: 玉米茉莉酸甲酯不敏感突变体的筛选 1457



图 1 初步筛选获得的部分 MeJA 不敏感突变体
Fig. 1 Primary screening of MeJA-insensitive mutants
图 1为 50 µmol L–1 MeJA条件下, 初步筛选获得的不敏感突变体。WT为野生型郑 58, MS培养基中含 50 µmol L–1 MeJA, 作为实验对
照。图 1-A中的 t580和 t596对 MeJA不敏感性非常显著, 耐受等级为 I级, 而 t575、t587和 t595对 MeJA表现出较不敏感性, 耐受
等级为 II级; 图 1-B中的 t407对 MeJA不敏感性非常显著, 耐受等级为 I级, 而 t388、t406和 t424对 MeJA表现出较不敏感性, 耐受
等级为 II级。
Fig. 1 shows primary screening of MeJA-insensitive mutants grown in the medium with 50 µmol L–1 MeJA. WT is wild type Zheng 58 as an
experimental control, grown in the MS culture medium containing 50 µmol L–1 MeJA. Fig. 1-A shows t580 and t596 were significantly
insensitive to MeJA as Grade I, and t575, t587 and t595 were insensitive to MeJA as Grade II. Fig. 1-B shows t407 was significantly insensi-
tive to MeJA as Grade I, and t388, t406 and t424 were insensitive to MeJA as Grade II.

表 2 61 个对 50 µmol L–1 MeJA 不敏感的 I 级耐受事件
Table 2 Sixty-one MeJA-insensitive mutants grown in the medium with 50 µmol L–1 MeJA with tolerance Grade I
MeJA筛选浓度
MeJA concentration for screening
突变体编号
No. of candidate mutants
a: 50 µmol L–1 z803, z918, z935, n002, n513, n887, t170, t175, t180, t198, t211, t325, t332, t386, t407, t450, t471,
t616, t661, h115, h736, h765, h857, f321
b: 100 µmol L–1 z391, z924, z959, z960, n487, n488, n492, n494, n495, n496, n507, n509, n516, n519, n869, t188, t199,
t331, t463, h357, h473, h732, h818, f188, s069, s671, e064
c: 200 µmol L–1 t580, t596, s054, s080, s087, s099, s386, s622, e234, e336
表中“a”为 50 µmol L–1 MeJA条件下的 24个不敏感事件, 它们只在 50 µmol L–1 MeJA条件下不敏感; “b”为 100 µmol L–1 MeJA条
件下的 27个不敏感事件, 它们在 50 µmol L–1 MeJA条件下也同样不敏感; “c”为 200 µmol L–1 MeJA条件下的 10个不敏感事件, 它们
在 50 µmol L–1和 100 µmol L–1 MeJA条件下均同样不敏感。其中, 表中加粗的编号为有子一代种子的材料。
“a” lists 24 insensitive events, which were only insensitive in the condition of 50 µmol L–1 MeJA. “b” shows 27 insensitive events in
the condition of 100 µmol L–1 MeJA, which were also insensitive in the condition of 50 µmol L–1 MeJA. “c” shows 10 insensitive events in
the condition of 200 µmol L–1 MeJA, which were also insensitive in the condition of 50 µmol L–1 MeJA and 100 µmol L–1 MeJA. The bold
numbers show that the mutants had seeds of F1 generation.

验证这些子一代玉米的 MeJA 耐受性是否具有可遗传性
以及研究其在 MeJA终浓度 50 µmol L–1条件下的发芽情
况, 从这 46个事件中选取了具有代表性的 11个事件进行
验证分析。结果表明, 子一代在 MeJA分别为 50 µmol L–1
和 100 µmol L–1条件下, 仍然对 MeJA表现出显著的耐受
性, 其中, t596-2在 MeJA浓度为 50 µmol L–1条件下, 伸
入 MS 培养基中的长度为 2.5 cm, 幼苗粗壮, 根系发达,
耐受程度为 I级, 在 100 µmol L–1 MeJA条件下, 也表现出
对 MeJA 的耐受性, 但在高浓度的 MeJA 条件下, 根的生
长受到抑制(图 3-A和 B)。子一代种子在含有 50 µmol L–1
MeJA的蛭石中第 3天发芽, 而对照野生型郑 58在第 6天
才发芽, 且试验组芽长均比对照组长约 3 cm (图 3-C), 但
1458 作 物 学 报 第 41卷



图 2 部分 MeJA 不敏感突变体在高浓度 MeJA 中的验证
Fig. 2 Confirmation of MeJA-insensitive mutants in 100 µmol L–1 and 200 µmol L–1 MeJA media
图 2-A为 MeJA终浓度 100 µmol L–1条件下的重复验证结果。WT为野生型郑 58, MS培养基中含 100 µmol L–1的 MeJA, 作为实验对
照, 从图 2-A中可以看出 t331-1、t331-2、t199-1、t199-4均伸入到交界面以下, 表现出对终浓度 100 µmol L–1的 MeJA耐受性; 图 2-B
为 MeJA终浓度 200 µmol L–1条件下重复验证结果, WT为野生型郑 58, MS培养基中含 200 µmol L–1的 MeJA, 作为实验对照。从图
2-B中可以看出 s054-1、s054-2、s080-2、s087-1、s087-2均伸入到交界面以下, 表现出对终浓度 200 µmol L–1的 MeJA耐受性。
Fig. 2-A shows the confirmation of MeJA-insensitive mutants in the condition of 100 µmol L–1 MeJA. WT is wild type Zheng 58 as a control,
grown in the MS culture medium containing 100 µmol L–1 MeJA. The roots of t331-1, t331-2, t199-1, t199-4 elongated under the border,
showing that they were significantly insensitive to 100 µmol L–1 MeJA. Fig. 2-B shows the confirmation of MeJA-insensitive mutants in the
condition of 200 µmol L–1 MeJA. WT is wild type Zheng 58 as an experimental control, grown in the MS culture medium containing
200 µmol L–1 MeJA. The roots of s054-1, s054-2, s080-2, s087-1, s087-2 elongated under the border, showing that they were significantly
insensitive to 200 µmol L–1 MeJA.

根的生长抑制情况在发芽初期与对照相似 , 没有表现出
耐受性, 在转移到管中继续培养 20 d后, 根的生长才表现
出明显的耐受性。对在 50 µmol L–1和 100 µmol L–1 MeJA
条件下玉米根的长度和根伸入 MS 培养基的长度测量(表
3)表明, 在 50 µmol L–1 MeJA条件下, 这些耐受性事件中
的根长最长达到 14.00 cm, 比对照长 7.00 cm, 如 h818-1。
而根伸入 MS 培养基中的长度最长能达到 2.50 cm, 对照
则只停留在交界面以上 , 不能伸入 MS 培养基中 , 如
t596-2。同时, 在 100 µmol L–1 MeJA条件下, 这些耐受性
事件中的根长最长达到 13.80 cm, 比对照长 7.2 cm, 如
h818-1; 根伸入 MS 培养基中的长度最长能达到 1.10 cm,
对照则只停留在交界面以上, 不能伸入 MS 培养基中, 如
t407-1。从根系的生长情况来看, 这些 100 µmol L–1 MeJA
条件下的玉米根系与在 50 µmol L–1 条件下的情况相似,
均表现出对 MeJA 不敏感, 但在高浓度的 MeJA 条件下,
根的生长受到抑制。
3 讨论
本研究在含有 50 µmol L–1 MeJA的培养基上对玉米
突变体库中的 6118 份种子进行了耐受性筛选。筛选获得
61个 I级耐受事件, 这些突变体主要表现出根系发达, 生
长速度快, 对 MeJA 耐受性显著。当加大筛选浓度到 100
µmol L–1和 200 µmol L–1 MeJA时, 这些事件仍然表现出
MeJA 的耐受性。但随着 MeJA 浓度的增加, 这些事件的
根在培养基中的长度也相应变短, 幼苗也变得弱小。由此
可见, 这些不敏感突变体只在一定的浓度范围内对 MeJA
表现出耐受性, 而高浓度MeJA对植物生长具有一定的抑制
作用, 并且MeJA浓度越高, 对植物的生长抑制越严重[20-21]。
本研究在筛选方法上做了一些改进, 可以快速、大批
量的筛选突变体 , 并且提高了种子的发芽率和减少了霉
菌的产生。首先是在种子的预处理上, 采用了 1%次氯酸
钠溶液浸泡处理 , 以破除种子休眠和使种子发芽处于一
致状态; 其次是用 1%多菌灵溶液包被种子, 使种子处在
多菌灵的保护下发芽, 减少霉菌污染; 其三是用没有任何
营养成分的蛭石作为种子发芽的固定物质 , 除去了配制
培养基的步骤, 既节省了时间, 也减少了霉菌滋生的机会;
其四是将发芽后的种子转移到含有不同浓度 MeJA的 MS
培养基的玻璃管中继续生长 , 可以实时观察根的生长抑
制情况, 并且使筛选结果简单明了。该方法适合筛选大型
突变体库, 具有方便快捷、重复性好的优点。与已发表的
文献相比, 本研究的种子预处理、具体操作步骤和培养基
配制均不同[21-23]。
第 9期 查象敏等: 玉米茉莉酸甲酯不敏感突变体的筛选 1459


从理论上讲 , 初筛获得的不敏感突变体与对应的子
一代应该表现出一致的不敏感性, 但从图 1-A和图 3-A可
以看出, 在 50 µmol L–1 MeJA条件下, t580和 t596虽然都
表现出MeJA不敏感性, 但深入培养基的长度及根分支数
有所不同。究其原因有两点, 第一, 在筛选突变体库时,
由于筛选量大, 只关注根的生长情况, 对筛选结果只做了
一个定性的统计, 在获得了初筛突变体后进一步优化培
养条件, 在更严格的筛选条件下才进行二轮实验确定; 第

图 3 MeJA 不敏感突变体的遗传性分析
Fig. 3 Heredity analysis of MeJA-insensitive mutants
图 3-A为 MeJA终浓度 50 µmol L–1条件下的验证分析结果, WT MeJA– 为野生型郑 58, MS培养中不含 MeJA, WT为野生型郑 58, MS
培养基中含有 50 µmol L–1 MeJA。从图 3-A中可以看出 t580-1、t596-2、t332-1、h818-1和 f188-1均伸入到交界面以下, 表现出对终
浓度 50 µmol L–1的 MeJA耐受性; 图 3-B为 MeJA终浓度 100 µmol L–1条件下验证分析结果, WT MeJA– 为野生型郑 58, MS培养基中
不含 MeJA, WT为野生型郑 58, MS培养基中含有 100 µmol L–1 MeJA。从图 3-B中可以看出 t463-1、t580-1、t596-2、h115-2、h818-1
和 f188-1均伸入到交界面以下, 表现出对终浓度 100 µmol L–1的 MeJA耐受性。图 3-C为子一代种子在含有 MeJA浓度为 50 µmol L–1
的蛭石中的发芽情况, WT为野生型郑 58, 其他处理与实验组一致, 可以看出 t198-2、n516、f188-1、n496-2、t407-1等事件的芽长均
比对照长约 3 cm, 表明突变体种子在发芽时与对照材料相比未受 MeJA抑制。
Fig. 3-A shows the confirmation of the insensitive-mutants progeny grown in the condition of 50 µmol L–1 MeJA. WT MeJA– is wild type
Zheng 58, grown in the MS medium without MeJA. WT is wild type Zheng 58, grown in the MS medium containing 50 µmol L–1 MeJA.
Roots of t580-1, t596-2, t332-1, h818-1, and f188-1 elongated under the border, showing that they were significantly insensitive to 50 µmol
L–1 MeJA. Fig. 3-B shows the confirmation in the concentration of 100 µmol L–1 MeJA. Roots of t463-1, t580-1, t596-2, h115-2, h818-1, and
f188-1 elongated under the border, showing that they were significantly insensitive to 100 µmol L–1 MeJA. Fig. 3-C shows germination of F1
seeds grown in the vermiculite with 50 µmol L–1 MeJA. WT is wild type Zheng 58, and other processing were consistent with the experimen-
tal groups. Buds of t198-2, n516, f188-1, n496-2, t407-1 were approximately 3 cm longer than ones of WT, showing that the seed germination
of mutants is not inhibited by MeJA compared with WT.
1460 作 物 学 报 第 41卷


表 3 子一代在 50 µmol L–1 MeJA 和 100 µmol L–1 MeJA 培养基中 20 d 后的根长和根伸入 MS 培养基的长度
Table 3 The root length and the length of root into the MS medium of mutants progeny in the media with 50 µmol L–1 MeJA and
100 µmol L–1 MeJA after 20 days (cm)
50 µmol L–1 100 µmol L–1 编号
Code 根长
Root length
根伸入 MS的长度
Length of root into the MS medium
根长
Root length
根伸入 MS的长度
Length of root into the MS medium
WT Z58 7.00 0.00 6.60 0.00
t596-2 12.00 2.50 10.00 0.80
t199-1 8.30 1.80 7.60 0.50
t407-1 8.10 1.80 8.50 1.10
t580-1 9.00 1.80 7.50 1.00
z960-1 8.00 1.70 7.40 0.60
z959-1 8.20 1.50 7.50 0.90
n519-2 8.50 1.40 7.00 0.70
t331-1 8.62 1.20 5.13 0.60
h818-1 14.00 1.14 13.80 0.80
f188-1 8.00 1.10 7.70 0.70
h115-2 7.00 0.90 7.50 0.60
t463-1 8.50 0.60 6.00 0.30

二, 培养基添加的MeJA极易挥发, 在子一代材料筛选时,
采取了多种方法减少 MeJA 的挥发, 所以也保证了 MeJA
的抑制根的生长能保持长久。因此, 随着实验条件的进一
步优化, 筛选结果更加真实、有效, 同时也证明了初筛结
果可以很好地反映突变体材料的 MeJA的敏感性。
COI1 基因是拟南芥茉莉素信号转导链重要的调控基
因, COI1 (CORONATINE INSENSITIVE 1)编码一个 F-box
蛋白并参与形成 SCFCOI1 E3 泛素连接酶[17, 24], 表明泛素
化介导的蛋白质降解途径在 JA信号转导途径中起重要作
用。COI1 蛋白通过作用于茉莉酸信号途径调控病虫害的
防御、花粉的发育以及对根的抑制, 其中很多蛋白因子,
如转录因子 MYC2、SCF 和它的下游活性蛋白 AXR1、
JAI4/SGT1b 和 MPK4 也参与了 COI1 和茉莉酸组成的抑
制根生长的信号途径[25]。COI1 蛋白无功能突变体 coil-1
几乎丧失了茉莉素所调控的一切反应, 如根的生长对茉莉
素不敏感, 茉莉素诱导基因几乎不表达, 对一些病虫害的抗
性降低并表现为雄性不育[16]。玉米 JA 途径突变体的筛选
和相关基因的研究也取得了一些研究进展, 例如在 2009
年 Acosta 等[26]通过 tasselseed1 突变体的研究, 克隆了影
响 JA信号的性别决定基因 tasselseed1, 该基因可能与 JA
的生物合成有关; 2012 年 Yan 等[27]从玉米转座子文库中
获得了 opr7 和 opr8突变体, 双突变体表现出叶片延迟衰
老, 更易受到甜菜夜蛾的攻击, 揭示了 OPR7 和 OPR8 基
因参与 JA 诱导的玉米发育和防御功能。但玉米中与 JA
途径相关的突变体和基因的研究仍然较少 , 在国内更是
鲜有报道。本研究筛选获得的玉米 MeJA不敏感突变体可
能在 JA 调控及信号感知方面的基因发生碱基突变, 导致
相关蛋白功能缺失, 从而表现出根的生长对 MeJA 不敏
感。基于以上研究结果, 在下一步的研究中, 我们将从这
些突变体材料出发, 对 JA 途径相关的基因进行定位和克
隆, 并分析这些相关基因在 JA途径中的作用。
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