全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(2): 355−361 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31100228), 浙江省自然科学基金项目(Y3110218), 浙江省“重中之重”学科“现代农业生物技术与作
物病害防控”开放基金(ZC323012042)和浙江师范大学博士启动基金(ZC304010042)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 郭卫东, E-mail: gwd@zjni.com
第一作者联系方式: E-mail: fangleiliao@126.com
Received(收稿日期): 2013-03-30; Accepted(接受日期): 2013-09-08; Published online(网络出版日期): 2013-11-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131114.1708.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00355
比较和分析 NtGNL1的反义寡聚核苷酸抑制在烟草三种培养体系中的
效果
廖芳蕾 1 王 鲁 2 辛可行 1 陈文荣 1 郭卫东 1,∗
1 浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江金华 321004; 2 中国科学院武汉植物园, 湖北武汉 430074
摘 要: 为探讨反义寡聚核苷酸抑制(antisense oligodeoxynucleotides inhibition)技术在植物材料上的应用, 以已知功能
的 NtGNL1 (Nicotiana tabacum GNOM-Like1)为目标基因 , 寻找反义寡聚核苷酸抑制最适作用体系 , 并进一步分析
NtGNL1的具体作用。根据目标基因 mRNA序列设计反义寡聚核苷酸序列, 商业合成后并将其添加到烟草胚珠、种子和
花粉管离体培养的培养基中, 以抑制 NtGNL1 的表达。结果表明, 将反义寡聚核苷酸引入离体培养系统, 短时间内抑制
了目标基因 mRNA 的表达, 但对胚胎发育过程的影响和种子萌发的抑制都不明显。在花粉离体萌发系统中, 反义寡聚
核苷酸抑制能够高效地引起目标基因 mRNA的下调。对 FM4-64染色的花粉管显微缩时观察发现, NtGNL1的下调能够
引起囊泡分布和运输方向的改变。对花粉管膜流相关的 5个基因的半定量分析也显示反义寡聚核苷酸进入花粉管后, 导
致 3个基因的表达下调, 暗示 NtGNL1抑制表达会影响花粉管囊泡运输的多个节点。
关键词: 反义寡聚核苷酸抑制; NtGNL1; 离体培养; 花粉管; 囊泡运输; 膜流
Comparison and Analysis of Effects of Antisense Oligodeoxynucleotide Inhibi-
tion of NtGNL1 in Three Culture Systems of Tobacco
LIAO Fang-Lei1, WANG Lu2, XIN Ke-Xing1, CHEN Wen-Rong1, and GUO Wei-Dong1,∗
1 College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China; 2 Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sci-
ences, Wuhan 430074, China
Abstract: To develop the antisense oligonucleotide inhibition technology in plant materials, we used the known-function-gene
NtGNL1 as the target to establish the optimum application system and further analyze the specific role of NtGNL1. Based on the
mRNA of target gene, we designed, commercially synthesized and then applied the antisense oligonucleotide sequences into the in
vitro cultured ovules, seeds and pollen tubes to inhibit the expression of NtGNL1. The results revealed that the co-culture of an-
tisense oligodeoxynucleotides hardly affected the pattern formation of the embryos, as well as the seeds germination, despite the
expression of NtGNL1 decreasing during short periods. Significantly, the antisense oligodeoxynucleotides down-regulated the
expression of target gene in the in vitro cultured pollen tubes. Microscopic time laps observation of pollen tubes by FM4-64 stain-
ing indicated that the inhibition also changed the vesicles distribution model and the direction of vesicle trafficking. Furthermore,
the mRNA expression of five genes related to membrane trafficking was also analyzed by semi-quantitative PCR, showing that
three genes were down-regulated after the antisense oligodeoxynucleotides entered into the pollen tubes. All these results implied
that the inhibition of NtGNL1 expression will affect several key points of vesicle trafficking in pollen tubes.
Keywords: Antisense oligonucleotide inhibition; NtGNL1; in vitro culture systems; Pollen tube; Endosome trafficking; Mem-
brane trafficking
反义寡聚核苷酸抑制也称为反义 ODN抑制(antisense
oligod eoxynucleotid inhibition)。该技术能够高效抑制正常
基因的表达, 常用于动物系统或核酸治疗系统[1-3]。推测
反义 ODN通过依赖于 RNA酶 H活性的 mRNA降解或形
成 DNA核酸三链复合物(triplex)来抑制转录和翻译[4]。与
RNAi 转基因技术相比, 反义 ODN 能够抑制正常基因的
356 作 物 学 报 第 40卷


表达, 虽具有暂时性, 但专一性较强[5]。在反义核苷酸的
两端加上硫代磷酸脂化修饰(phosphorothioate), 抑制效率
和专一性将增加[6-7]。植物细胞具有细胞壁, 反义 ODN穿
越质膜进入细胞的难度很大。1994年 Estruch等[8]利用钙
离子的沉淀技术在玉米的花粉管中导入反义 ODN, 效率
很低。在带正电荷的磷脂脂质体的包裹下, 小片段的 ODN
进入非洲百合花(Agapanthus umbellatus)的花粉管, 由于
脂质体的毒性很大, 抑制效果很难被量化[9]。摘下大麦叶
片插入装有反义 ODN的试管, ODN能够直接被大麦吸收,
并抑制目标基因的表达 , 但这以破坏植物组织的完整结
构为代价[10]。反义 ODN 参与植物细胞的功能基因分析,
需要找到一种适合的应用体系。
ARF-GEFs (guanine-nucleotide exchange factors for
ADP-ribosylation factor GTPases)家族在所有真核生物的
膜流运输中是必不可少的。它促进 GDP 的剥落并引进
GTP, 使 ARF获得活性, 指引其与膜融合[11], 8个 ARF-EF
家族中, GBF (golgi-specific BFA resistance factor)是植物
ARF-GEF的标志性亚家族。植物的 GBF蛋白在膜流中执
行各自保守的功能。NtGNL1 (Nicotiana tabacum GNOM-
ike1)是烟草 GBF 的新成员, 该基因与拟南芥 GNL1 亲缘
关系最近。NtGNL1 基因在烟草的生命周期中广泛表达,
在利用 RNAi 技术抑制 NtGNL1 表达的转基因植株中, 发
现其早期胚胎细胞分裂不同步, 胚胎发育不对称, 根毛生
长速度明显慢于野生型植株 , 且花粉萌发和生长受到抑
制[12]。对花粉管的细胞学观察还发现, 转基因植株的花粉
管尖端的细胞内吞作用、内含体与多泡体之间的囊泡转运
出现紊乱[13]。
本文将以已知大致功能的NtGNL1为反义ODN抑制目
标, 在烟草的胚珠体外培养系统、种子萌发系统以及花粉
离体萌发系统中 , 加入针对 NtGNL1 基因设计的反义
ODN(两端加入硫代磷酸化修饰), 以期探索反义 ODN的作
用特点, 并进一步分析 NtGNL1在植物囊泡运输中的作用。
1 材料与方法
1.1 反义 ODN及其对照序列的设计
根据NtGNL1基因序列设计反义ODN序列, 为HPLC
级别(TaKaRa 合成), 选用其中的 ON4 作为后续试验。试
验中随机选择 4R-4R3 序列(4R, 5-TCTCACACGCGACC
GGGTCTCC-3; 4R1, 5-CTCACACGCGACCGGGTC-3;
4R2, 5-GCTGCGACCTGCCACAGC-3; 4R3, 5-CCGTGA
CCTGCACGACGC-3)作为对照序列。预试验中确定为稳
定有效的反义 ODN 序列, 在其 5端和 3端进行磷酸硫代
修饰(ON4, 5-C(S)T(S)G(S)GGCCAGCGCAC(S)A(S)C(S)-3)
(标记由 TaKaRa完成), 该反义 ODN序列能够特异地抑制
烟草花粉管中 NtGNL1的表达[14]。本文结果部分提到的对
照, 是从上述 4R-4R3对照序列中随机选取的。
1.2 植物材料的培养与观察
野生型烟草 SR1的培养条件为 26 , 16 h℃ 光照, 8 h
黑暗。试验材料早期胚珠、种子和花粉均来自培养的野生
型烟草。
1.2.1 胚珠离体培养 对受精后的烟草子房, 以 75%
的医用酒精表面灭菌 , 4%的次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡
10 min, 无菌水清洗 3次, 每次 5 min。刮取胚珠并于 13%
的甘露醇(2 mL)中清洗一次, 2 mL培养基清洗 2次, 将胚
珠接种到培养基中(MS, 6%蔗糖, 不附加激素, pH 调至
5.8, 0.25 µm微孔滤膜过滤灭菌), 每 1.5 mL培养基中接种
100~150 个胚珠[15]。在培养基中添加反义 ODN至终浓度
为 5 μmol L–1, 培养胚珠 30 d, 每 10 d观察一次。
1.2.2 胚胎的透明观察 采用二步酶解法分离二胞原
胚。对小球型及其以后时期的胚胎分离, 采取平头玻棒研
磨, 在显微镜下将分离的胚胎用微吸针吸出并清洗。
用先经卡诺氏液固定 , 后用霍氏透明剂透明的胚珠
观察球形胚及更晚期的胚。用镊子和解剖针剥离胎座上的
胚珠, 无菌水清洗一次, 再加入卡诺氏固定剂(无水乙醇
与冰醋酸以 3∶1 的体积比混合)固定。室温处理 3 h, 无
菌水清洗, 取胚珠铺展于载玻片上, 稍干燥后滴加改良霍
氏透明剂(7.5 g阿拉伯树胶、100 g水合氯醛、5 mL甘油
和 60 mL双蒸水混合后过夜溶解), 15 min后封片, 透明过
夜后在干涉差显微镜下观察。
1.2.3 种子的液体培养 野生型烟草种子经表面消毒
后, 在 MS 液体培养基中培养, 其中含 5 μmol L–1 反义
ODN, 培养箱 28℃暗培养 2 d。后转移到光照培养箱 28℃
每天光照 16 h培养, 7 d后测量统计反义 ODN处理的种子
的萌发率。
1.2.4 反义ODN处理体外培养的花粉并染色观察 采
集成熟花粉在花粉培养基中培养, 加入反义 ODN 至终浓
度为 5 μmol L–1, 28℃暗培养。烟草花粉的体外萌发培养
基配方为 5 µmol L–1 CaCl2、5 µmol L–1 Ca(NO3)2、1 mmol
L–1 Mg(SO4)2、0.01% H3BO3、18%蔗糖, pH 6.5~7.0 [16]。
取培养 3 h对照和处理的花粉, 加入 FM4-64 染液至
终浓度为 2~4 μmol L–1。封片, 在倒置显微镜(Leica)下获
取 FM4-64 染色的花粉管图像 , 并用 MetaMorph 软件
(Universal Imaging Corporation Inc.)的序列抓拍功能, 以
0.5 s的间隔时间取图, 跟踪观察花粉管的囊泡运输。
1.3 花粉管中膜流相关基因的半定量分析
从野生型和经反义 ODN处理的体外萌发花粉管中提
取 mRNA (TRIreagent), 反转录成 cDNA (SuperScript III)。
选择 5 个膜流相关基因(其引物序列如表 1), 进行半定量
RT-PCR分析。
1.4 数据处理
用 Metamorph采集数字图象, 软件 Adobe Photoshop
CS4作图像排版。采用 Microsoft Excel 2003软件统计分
析试验数据。
2 结果与分析
2.1 反义 ODN对胚胎发生和种子萌发率的影响
在胚珠的体外萌发系统中施加反义 ODN, 观察反义
第 2期 廖芳蕾等: 比较和分析 NtGNL1的反义寡聚核苷酸抑制在烟草三种培养体系中的效果 357


表 1 膜流相关基因的引物
Table 1 Primers designed from the genes related to membrane trafficking
基因
Gene
编号
Number
上游引物
Upstream primer
下游引物
Downstream primer
NtRab11b EMBL, L29269 5-TTGGCAAGGATGATGTTTCA-3 5-TCCTGCGGATAAGGATGAAC-3
NtRAC5 NCBI, AJ250174 5-TGCCCACTGTGTTTGACAAT-3 5-AATGAAAACATCGGCTCCAC-3
NtAra7 NCBI, X63875 5-CAATGCAACGGTGAAGTTTG-3 5-GGCTTTGTTTCCAGCAAGAG-3
RhoGAP1 EMBL, DQ813657 5-CCA AAGTCCACCGCAACTAT-3 5-GCGGCTCAAGTTGCTTATTC-3
RhoGDI2 EMBL, DQ416769 5-GGGGGAACAAAAACTCCAAT-3 5-CTTCGTGCTGTCCACTTTGA-3

ODN的抑制效果。经过30 d连续观察, 发现反义 ODN对
胚珠的生长影响不显著(图1-A, B)。经反义 ODN处理的胚
珠外部形态(颜色、外形、体积等)与对照组没有观察到明
显差别。对培养期的胚珠进行不同时期的胚胎分离, 结果
表明, 处理组的胚胎中, 胚胎发育时期没有明显的滞后现
象。对早期(二胞前后)的胚珠提取 mRNA, 发现 NtGNL1
的表达有所下降, 但在晚期中观察不到(图片未展示)。在
小球型胚 (图1-C)之后的转化期 , 偶见不对称发育的胚
(图1-D), 和一些胚胎细胞隆起于胚表面的胚(图1-E), 这
部分发育不正常的胚的比例并不高。在体外培养的胚珠中
分离到的鱼雷期胚, 显示大部分的胚胎形态正常(图1-F)。
然而 , 在针对 NtGNL1的 RNAi 转基因中 , 早期胚胎异
常 [12]。上述结果表明, 在烟草胚珠的体外培养体系中, 反
义 ODN抑制的效果不明显。
将不同序列的反义 ODN 应用于液体培养的烟草种子,
发现针对 NtGNL1 设计的反义 ODN 引物, 在培养基中加
入 5 μmol L–1引物 ON4和 ON6后观察到种子萌发的明显
迟缓。同时, 萌发率以及萌发后的根生长速度均下降(图
2), 而其余的反义 ODN 片段并没有影响种子的萌发。这
一现象类似于 NtGNL1的 RNAi转基因植株的表型[12]。在
ON4、ON6 处理组萌发出的幼苗中提取 mRNA, 发现
NtGNL1的表达都有所下降(图3), 但将幼苗进一步移栽至
土壤中, 一周后检测, NtGNL1并未下调(图3)。

图 1 ON4在胚珠离体培养中的应用
Fig. 1 Application of ON4 to the in vitro cultured ovules
A: 对照; B: ON4处理的胚珠。ON4处理 4 d之后取图。C, D, E,
F: 反义 ODN处理的胚珠中的胚胎形态。D: 胚胎发育不对称;
E: 胚胎细胞隆起; F: 正常形态。Bar=20 μm
A: control; B: ON4 treatment. Pictures were taken after four days in
the ON4 treatment. Bar=200 μm。C, D, E, and F are the embryos
morphology in the ovules in the ON4 treatment. D: asymmetrical
embryo; E: part embryonic cells bulged from the embryo; F: normal
phenotype under the ON4 treatment. Bar=20 μm.

图 2 反义 ODN (5 μmol L–1)降低种子的萌发率
Fig. 2 Antisense ODN (5 μmol L–1) reduced the seed germination rate
种子培养 10 d后取图。ON4和 ON6的种子萌发率较低。
Pictures were taken after the seeds cultured for 10 days. The seed germination rate is very low both in ON4 and ON6 medium.
358 作 物 学 报 第 40卷



图 3 反义 ODN (5 μmol L–1)在短期内抑制 NtGNL1基因的
mRNA表达
Fig. 3 Effect of antisense ODN treatment on NtGNL1 mRNA
expression
种子与反义 ODN共培养 7 d后, 目标基因的表达在 ON4和 ON6
的处理下有不同程度的下调; 种子萌发后转到土壤中 7 d, 目标
基因的表达并无影响。
The mRNA expression of NtGNL1 was down regulated after the
seeds were co-cultured with antisense ODN for seven days, while
the mRNA expression was not influenced when those germinated
seeds were transplanted to the soil for seven days.

在胚珠体外培养和种子萌发培养基中 , 在特定的反
义 ODN处理下(ON4和 ON6), 偶引起早期胚胎表型异常,
种子萌发延迟, 但其作用不能持续。目标基因 mRNA 的
表达在短时间内下降, 但之后逐渐恢复。推测可能是反义
ODN 在进入珠被和种皮时, 遇到多层细胞的阻碍[17]。也
有极大可能是反义 ODN 虽有少量进入, 但逐渐被细胞内
的内切酶消化, 难有持续作用。因此, 在不同培养体系中
以反义 ODN 处理相对有效的作用时间, 可以达到抑制目
标基因表达的目的。
2.2 反义 ODN抑制对花粉管囊泡分布和运输方向的影响
使用反义 ODN的有效片段 ON4、ON6处理体外萌发
的花粉管, 发现目标基因的 mRNA 水平下调, 并且花粉
管的生长受到抑制, 出现一些不正常的表型, 比如弯曲、
折叠等[14]。所有表型都类似于 NtGNL1的 RNAi转基因植
株的花粉管。这些证明反义 ODN抑制在花粉管培养的 8 h
左右[14], 对目标基因的抑制是非常有效的。
利用内吞标记染料 FM4-64 对 ON4 组花粉管囊泡跟
踪观察发现, FM4-64 在花粉管尖端的分布模式发生了很
明显的改变。在对照组花粉管的尖端, FM4-64定位的囊泡
在几分钟之内 , 可以形成一个倒锥形或者又叫倒喷泉的
模型[20], 即尖端的 V 型区域内聚集着大量的内吞囊泡(图
4-A, B)。但在反义 ODN处理的花粉管中, 大部分尖端的
V 型区一直没有出现, 亚尖端区域反而形成了聚集的囊
泡(图 4-C, D)。这些表型和我们在 NtGNL1的 RNAi植株
的花粉管中观察到的非常类似[13], 也证明反义 ODN在花
粉中的反义抑制的有效性。
在ON4的处理组中, 跟踪观察 FM4-64在不同时间内
的定位, 可以显示囊泡的变化。在野生型的花粉管中, 囊
泡随着时间的延长将有不同的分布, 起初是在膜周, 渐渐
荧光增强转向花粉管内的细胞器。然而在一定时间内
(60 min), 囊泡在花粉管的尖端区域沿膜的分布明显(图
5-A, B, C, D)。而在反义 ODN处理的花粉管中, 弯折花粉
管的囊泡分布在尖端边缘(图 5-G, H), 甚至覆盖了花粉管
的接近亚尖端的区域 , 而并没有在尖端的中心出现 (图
5-J); 可以看出这些尖端的亮团比较大, 可能是囊泡已经
发生了部分的聚集(图 5-J)。

图 4 FM4-64染色显示花粉管的囊泡分布
Fig. 4 Pollen tube vesicle distribution by FM4-64 staining
A, B: 对照; C, D: ON4处理。A, C: 明视野图; B, D: 荧光显微镜
下的 FM4-64染色。Bar=10 μm。以上图片取自体外萌发 3 h的花
粉管, 并被 ON43 h后。
A and B: pollen tube in the control medium; C and D: pollen tube under
the treatment of ON4. Bar=10 μm. A and B: bright field pictures;
B and D: FM4-64 staining pictures under fluorescence microscope.
Pictures were taken after the pollen tubes cultured for three hours
and in the ON4 treatment for three hours.


图 5 FM4-64染色显示囊泡运输随时间的变化
Fig. 5 Changes of vesicle trafficking with time-variation by
FM4-64 staining
第一行是对照, 第二行是 ON4处理。A, F: 明视野图; B~E, G~J:
FM4-64的染色在不同时间的图像。星号表示囊泡聚集集中的位置。
Bar=10 μm, 以上图片取自体外萌发 3 h的花粉。
The upper parts are controls. The lower parts are the ON4 treat-
ments. A and F: bright field images. B–E and G–J: FM4-64 staining
images at different time. Stars indicate the locations of concentra-
tion of the vesicles aggregation. Bar=10 μm. Pictures were taken
after the pollen tubes germinated for three hours.
第 2期 廖芳蕾等: 比较和分析 NtGNL1的反义寡聚核苷酸抑制在烟草三种培养体系中的效果 359


在反义 ODN 处理的花粉管中, 对花粉管的 FM4-64
染色和显微缩时观察发现 , 囊泡运输的方向和分布方式
都发生了改变 , 推测花粉管囊泡运输的分布和方向都受
到 NtGNL1的调控。
2.3 反义 ODN抑制对花粉管膜流相关基因表达的影响
NtGNL1的下调表达可能影响内膜系统的囊泡运输过
程, 因此对 5 个膜流相关基因的表达进行半定量检测, 以
推测囊泡运输的哪一条途径受到影响。结果发现, 部分基
因的表达量有少量下调(图 6), 如 RhoGAP和 RhoGDI, 但
并非显著性下调。Rab11b、Ara7和 Rac5的下调为显著性
下调(图 7), 这 3 个基因在囊泡运输过程中都发挥着相对
独立的重要作用, 是囊泡运输不同节点的关键基因。Rac5
调控微丝的形态, 它在 ODN 处理后的表达抑制, 表明囊
泡运输也影响微丝骨架的建成。

图 6 相关基因半定量检测电泳图
Fig. 6 Semi-quantitative detection for related genes
相关基因的 mRNA取自体外萌发同时 ON4 (5 μmol L–1)处理 3 h
后的花粉管。
The mRNA of related genes were taken from pollen tubes germi-
nated in vitro under the ON4 (5 μmol L–1) treatment for three hours.

图 7 相关基因 mRNA变化量比较
Fig. 7 Comparison of related gene mRNA expression
统计图根据图 6的像素计算获得, 柱形上的不同字母代表处理组
与对照组之间差异显著(P<0.05)。
The statistical chart is calculated according to the pixel of the Fig. 6.
Band superscripted by different letters are significantly different
between the controls and treatment groups (P<0.05).
3 讨论
3.1 针对 NtGNL1的反义 ODN序列设计
应根据 NtGNL1 基因的 mRNA 设计长度适中的反义
ODN 序列, 序列太长不易被细胞吸收, 太短会降低序列
的特异性。利用 Oligo 软件预测反义 ODN 片段的二级结
构, 在GenBank搜索每条设计好的序列, 避免误伤其他基
因。同时, 为了保证反义 ODN 序列能够有效地渗透进供
试材料 , 而不被细胞内的核酸酶消化 , 应对设计的反义
ODN 序列进行了磷酸硫代化修饰[21]。另外为排除外源核
酸引起的细胞毒性, 在本试验中, 设计了多重对照(不同
的 ODN序列)来减少系统本身的副作用。
3.2 反义 ODN适用于花粉的离体萌发系统
反义 ODN 进入细胞的机制还不很明确, 在其他植物
系统中, 为解决反义 ODN 进入植物细胞壁的问题, 不得
不借用一些转运系统如脂质体协助 , 或者直接破坏植物
组织的结构, 以利于植物细胞直接吸收[18]。最近, 有在植
物叶绿体中应用反义 ODN 成功的例子, 也借助了仪器的
导入[19]。有研究认为细胞直接的内吞作用和受体介导的
内吞在反义 ODN渗透进入细胞的过程中起了一定作用。
也有资料显示细胞表面存在能够结合反义ODN的受体蛋白,
这也可能是反义 ODN能够更高效地进入细胞的原因[22]。相
比胚珠和外皮种子, 花粉管的细胞为单层, 且一直处于胞
吞胞吐的活跃状态, 更容易接受外源信号的刺激。
植物细胞壁存在非通透性, 它与反义 ODN 都带有负
电荷, 使得反义 ODN进入植物细胞存在天然障碍。也有研
究认为单糖或多糖能够促进裸露的反义ODN进入细胞[18]。
在本试验中, 胚珠、种子, 花粉的培养基中都有蔗糖, 在
花粉体外培养系统中, 培养基含有大量的糖(20%), 这可
能是促进反义 ODN 进入花粉管的原因。同时, 观察到在
反义 ODN 处理花粉管 8 h 后抑制效果不再明显, 推测可
能是反义 ODN片段被花粉管内的酶消化或本身在执行功
能时被消耗[14]。因此, 反义 ODN 的直接共培养适用于花
粉离体萌发这一类短时间的培养体系 , 而不适用于离体
胚珠培养这样一类时间长、反义 ODN又难以渗透的体系。
当然, 反义 ODN 可以作为一种瞬时转基因的方法来研究
单基因功能, 前提是必须在预试验中确定反义 ODN 作用
的有效时间。
3.3 反义ODN验证了NtGNL1通过囊泡运输调控花粉管
细胞的生长方向
囊泡运输是由多个基因调控的复杂过程, 本研究通
过反义 ODN抑制 NtGNL1后, 确定 Rab11b、Ara7和 Rac5
基因的表达量明显下调。
Rab11b 基因存在于尖端胞质中, 可能调控尖端倒锥
形结构中囊泡的循环, 即循环内含体。花粉管的极性生长
集中在花粉管的尖端区域 , 为尖端生长提供物质基础的
大细胞器的分布往往远离尖端。囊泡运输在花粉管的极性
生长过程中转运物质 , 为尖端生长提供物质基础 [23]。
Rab11b 基因的表达抑制或失能突变将引起尖端的囊泡循
环受阻, 切断花粉管极性生长的物质供应, 引起花粉管弯
曲生长。在本实验中, 反义 ODN抑制处理的花粉管中, 确
实出现了弯曲生长的表型[14]。
Ara7 可能定位于早期囊泡或晚期囊泡中, 决定多泡
体和高尔基体之间的运输[24]。多泡体起源于高尔基体, 并
以分泌泡的形式将高尔基体合成的物质运送至细胞壁[25]。
因此, Ara7可能通过调节细胞壁的生长调节花粉管的极性
生长。前期工作发现 Ara7与 NtGNL1 是部分共定位的[13]。
因此, 反义 ODN抑制影响 Ara7的表达也是可能的。
Rac5 主要是调节微丝骨架的方向, 囊泡沿着固定的
微丝骨架定向运输是细胞极性生长的基础[26]。在花粉管
360 作 物 学 报 第 40卷


的生长中, 肌动蛋白组装成微丝纤维, 构成微丝骨架。微
丝骨架即膜泡运输的轨道, 蛋白质、脂类等装载于膜泡中
沿着微丝轨道特异地运送到生长点[27]。Rac5 表达量下调
将引起微丝的不正常生长 , 导致囊泡不能够正确定位到
生长点, 阻碍花粉管的极性生长, 会出现花粉管生长缓慢,
也和本试验中的反义抑制出现的拟表型类似[28]。
这 3 个基因表达量的下调都能显著影响囊泡运输 ,
进而影响花粉管的极性生长。在花粉管的极性生长过程中,
NtGNL1 可能通过调控囊泡运输的多个节点, 间接地调控
花粉管的极性生长。
被 NtGNL1影响的 3个基因, 主要定位于植物细胞的
后高尔基体转运途径 , 或与囊泡转运有密切关系的微丝
骨架上。因此, 进一步验证了 NtGNL1在植物后高尔基体
转运中的重要作用 , 但不能确认是依赖网格蛋白还是非
依赖网格蛋白的内吞途径。微丝骨架与植物细胞后高尔基
体转运的关系, 还需要更多研究来解释。
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