全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(8): 13561363 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31171590)和江苏省自然科学基金项目(BK2010065)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王心宇, E-mail: xywang@njau.edu.cn, Tel: 025-84395736
Received(收稿日期): 2014-01-10; Accepted(接受日期): 2014-06-04; Published online(网络出版日期): 2014-06-12.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140612.1637.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01356
TRV病毒介导的基因沉默体系在棉花中的建立及应用
王心宇 1,* 吕 坤 1 蔡彩平 2 徐 君 2 郭旺珍 2
1南京农业大学生命科学学院, 江苏南京 210095; 2南京农业大学农学院 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095
摘 要: 以陆地棉CLA1基因为标记基因, 利用烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus, TRV)载体建立基于病毒介导的棉花
基因沉默体系(virus-induced gene silencing, VIGS)。病毒 RNA2的 RT-PCR分析证明, 棉花子叶接种 TRV病毒后, 该
病毒可高效扩散到受体的根、茎、叶等器官。利用 TRV-VIGS体系同时诱导 34份不同来源棉花材料 CLA1基因沉默,
尽管不同材料间的抑制程度有差异, 但均可有效抑制 CLA1 基因的表达, 说明该体系在棉花研究中的广谱利用性。
GhMAPKKK 基因受黄萎病菌诱导表达 , 接种后 96 h 表达量达到高峰。利用 TRV-VIGS 体系 , 成功抑制了棉花
GhMAPKKK 基因的表达, 与对照株相比, 抑制后的棉花植株接种黄萎病菌后更易感病, 说明 GhMAPKKK 参与了棉
花对黄萎病菌的抗性反应。具有广谱性、灵敏性和高通量等特点的棉花 TRV-VIGS 体系建立将加速棉花功能基因组
研究进程。
关键词: 棉花; TRV-VIGS; GhCLA1; GhMAPKKK; 黄萎病
Establishment and Application of TRV-Mediated Virus-Induced Gene Silencing
in Cotton
WANG Xin-Yu1,*, LÜ Kun1, CAI Cai-Ping2, XU Jun2, and GUO Wang-Zhen2
1 College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2 State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm En-
hancement / College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Using upland cotton GhCLA1 as marker gene, tobacco rattle virus induced genes silencing (TRV-VIGS) was estab-
lished in cotton. A gene fragment of TRV subgenomic RNA2 was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction
(RT-PCR) in root, stem and leaf of cotton, demonstrating the virus can spread into various organs. The TRV induced silencing of
CLA1 gene was further tested in 34 different cotton varieties (lines) originated from several ecological regions of China. The re-
sults showed that CLA1 could be silenced in all tested varieties (lines), though the levels of silencing showed a little difference,
implicating wide application perspective of TRV-VIGS system in cotton. GhMAPKKK, a mitogen-activated protein kinase
(MAPK) kinase kinase gene of cotton, was up-regulated in cotton at 96 hours post inoculation by Verticillium dahliae. Silencing
GhMAPKKK in G. barbadense cv. Hai 7124, a cotton variety with high resistance to V. dahlia exhibited reduced resistance to V.
dahliae infection, suggesting that GhMAPKKK participated in cotton resistance signaling pathway to V. dahliae. With the wide
adaption without genotype selection, sensitivity and high throughput, the TVR-VIGS system will significantly promote functional
gene analysis in cotton.
Keywords: Cotton; TRV-VIGS; GhCLA1; GhMAPKKK; Verticillium wilt
病毒介导的基因沉默 (virus-induced gene si-
lencing, VIGS)是植物体内普遍存在的一种遗传免疫
机制, 属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene
silencing, PTGS)[1]。当携带含有内源基因片段的病毒
载体侵染寄主植物后, 能够激活植物自身的免疫系
统; 在识别并降解病毒 RNA的同时也会产生含内源
目的基因的 microRNA, 这些 microRNA与靶基因的
mRNA结合, 之后被 Dicer酶降解, 从而使目的基因
表达水平下降或功能丧失[2]。其中由烟草脆裂病毒
(tobacco rattle virus, TRV)诱导的基因沉默 (TRV-
第 8期 王心宇等: TRV病毒介导的基因沉默体系在棉花中的建立及应用 1357
VIGS), 以其沉默效率高、持续时间长, 寄主植物病
毒症状轻, 不会掩盖沉默表型, 且在各种组织均可
产生基因沉默等优点, 成为目前应用最为广泛的一
类基因沉默体系。TRV-VIGS已在茄属的番茄、烟草、
辣椒[3-5]、拟南芥[6]、麻风树[7]、矮牵牛[8]、罂粟[9-11]
等植物上成功应用。
植物 CLA1 基因(cloroplastos alterados 1 gene)
编码 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase, 参与叶
绿体发育过程, 进化中高度保守, CLA1 基因突变体
cla1-1 有明显的白化表型[12], 是易于识别的标记性
状。棉花是世界性重要的经济作物。近年来, 已有
TRV-VIGS体系构建与应用的相关报道。以雷蒙德氏
棉 CLA1基因序列设计目标沉默片段, Gao等[13]建立
了基于农杆菌介导的棉花 TRV-VIGS 体系, 并在不
同遗传背景的 6个棉花品种材料中成功应用 , 为棉
花重要基因功能的鉴定奠定了基础。进一步通过
TRV 病毒抑制棉花抗黄萎病相关基因 GhNDR1 和
GhMKK2 表达, 使棉花受体更易感病, 快速鉴定了
基因功能[14]。Qu等[15]发现 TRV-VIGS不仅可用于沉
默营养器官中基因, 还可用于沉默纤维等组织和生
殖器官如花蕾中的基因。然而, TRV-VIGS能否广泛
应用于棉花各品种, 即该体系是否受寄主基因型的
影响还不清楚, 未见相关研究报道。近年来, 棉花基
因组研究取得快速进展, 大量的棉花表达序列信息
已在公共数据库释放 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
dbEST/), 与四倍体棉种 D基因组供体亲缘关系最近
的雷蒙德氏棉, 已完成全基因组测序及序列分析[15-16],
大量棉花重要基因的功能需进一步鉴定。建立基于
目标性状的不同棉花受体基因瞬时干扰表达体系 ,
将加速棉花功能基因组学研究进程, 快速获得目标
性状的候选功能基因。
本研究以拟南芥 AtCLA1 基因为探针, 搜索雷
蒙德氏棉(G. raimondii Ulbrich)全基因组序列[16], 获
得 CLA1基因序列, 进一步设计引物, 通过同源克隆
法从陆地棉遗传标准系 TM-1 中克隆出 CLA1 基因,
命名为 GhCLA1。构建了 VIGS-GhCLA1载体, 以海
7124 为受体材料, 建立了棉花的 TRV-VIGS 体系。
选择不同来源及不同生态区的 34份棉花材料, 进行
沉默体系重复试验。通过 TRV-VIGS 技术抑制受黄
萎病诱导表达的 GhMAPKKK 基因的表达, 发现海
7124对黄萎病的感病性显著增强。与通过棉花遗传
转化来研究基因功能相比, TRV-VIGS具有无基因型
选择性、快速(当代可观察表型)和高通量等特点, 将
在棉花基因功能研究中扮演重要角色。
1 材料与方法
1.1 试验材料
34 份棉花品种(系), 包括 33份陆地棉材料和 1
份海岛棉抗黄萎病品种海 7124 (表 1)。33份陆地棉
材料包括: 黄河流域棉区 11个, 长江流域棉区 8个,
西北内陆棉区9个, 北部特早熟棉区2个; 感黄萎病品
系军棉 1号, 抗黄萎病品系 60182, 以及陆地棉遗传标
准系 TM-1。TRV-VIGS 体系的构建以及 GhMAPKKK
的功能研究均以海 7124为研究材料。同时诱导 34份
材料 GhCLA1 基因沉默, 观察叶片的白化情况, 以研
究 TRV病毒在不同遗传背景材料中的适用性。
pTRV1和 pTRV2 VIGS载体由清华大学刘玉乐教
授惠赠。农杆菌 GV3101由本实验室保存。MES (Sigma
原装)及卡那霉素、利福平、乙酰丁香酮等主要国产生
化试剂, 均购自南京奥斌生物科技有限公司。
1.2 农杆菌菌液的制备
参考 Velásquez等的制备方法 [17]。以 pTRV1和
含有目的基因片段的 pTRV2 分别转化农杆菌
GV3101。挑取新鲜培养的含 pTRV1 和目的基因片段
的 pTRV2的农杆菌GV3101单菌落, 分别接种到 3 mL
LB液体培养基(Kan, 50 μg mL–1; Rif, 50 μg mL–1)中,
28℃ 180 转 min–1培养 24 h; 以 1%含量接入 50 mL
LB液体培养基 (Kan, 50 μg mL–1; Rif, 50 μg mL–1)中,
28℃ 180转 min–1培养 12 h, 至菌液 OD600为 1.0左
右; 1700×g离心 5 min收集菌体细胞, 以适当体积的
重悬液(10 mmol L–1 MgCl2, 10 mmol L–1 MES以及
200 μmol L–1 乙酰丁香酮 )重悬至终浓度为 0.8
(OD600); 将重悬液于室温下静置 3 h 以上 , 含有
pTRV1和目的基因片段的 pTRV2的重悬液按体积比
1∶1混匀, 用于注射棉花子叶。
1.3 材料种植及农杆菌侵染
以人工气候室培养到出苗后 8 d, 子叶完全展平
的棉花幼苗为试验接菌材料。先用注射器针头轻轻
刺破子叶背面造成微伤口, 用去针头的注射器从伤
口处注入 1∶1 混匀的含有 pTRV1 和含目的基因片
段的 pTRV2重悬液。于昼/夜温度 23/22℃, 光/暗周
期 16 h/8 h的人工气候室内培养侵染后的棉花植株。
在相同的环境下培养未经侵染处理和注射空载体
(1∶1 混和 pTRV1 和 pTRV2)的对照植株, 2~5 周观
察不同处理棉花的表型, 并检测目的基因的表达情
况。对每种材料处理 10个单株。
1.4 半定量 RT-PCR检测
利用 CTAB-酸酚法提取叶片总 RNA[18]。以棉花
1358 作 物 学 报 第 40卷
表 1 供试的 34份棉花品种(品系)基本信息
Table 1 Information on 34 tested cotton varieties (lines)
序号
No.
品种(品系)
Variety (line)
推广生态区
Ecological region
引进/审定年份
Introduced or released year
1 科遗 2号 Keyi 2 黄河流域 The Basin of Yellow River 1970
2 中棉所 12 CRI 12 黄河流域 The Basin of Yellow River 1989
3 豫棉 8号 Yumian 8 黄河流域 The Basin of Yellow River 1992
4 豫棉 9号 Yumian 9 黄河流域 The Basin of Yellow River 1994
5 豫棉 11 Yumian 11 黄河流域 The Basin of Yellow River 1994
6 晋棉 21 Jinmian 21 黄河流域 The Basin of Yellow River 1997
7 晋棉 25 Jinmian 25 黄河流域 The Basin of Yellow River 1998
8 豫棉 20 Yumian 20 黄河流域 The Basin of Yellow River 1999
9 中棉所 9409 CRI9409 黄河流域 The Basin of Yellow River 1999
10 冀棉 298 Jimian 298 黄河流域 The Basin of Yellow River 2004
11 银瑞 361 Yinrun 361 黄河流域 The Basin of Yellow River 2007
12 鄂棉 6号 Emian 6 长江流域 The Basin of Yangtze River 1970
13 鄂荆 1号 Ejing 1 长江流域 The Basin of Yangtze River 1991
14 鄂棉 17 Emian 17 长江流域 The Basin of Yangtze River 1992
15 泗棉 3号 Simian 3 长江流域 The Basin of Yangtze River 1993
16 鄂棉 21 Emian 21 长江流域 The Basin of Yangtze River 1996
17 鄂抗棉 9号 Ekangmian 9 长江流域 The Basin of Yangtze River 1999
18 鄂抗棉 10号 Ekangmian 10 长江流域 The Basin of Yangtze River 1999
19 华抗棉 1号 Huakangmian 1 长江流域 The Basin of Yangtze River 2002
20 新陆中 2号 Xinluzhong 2 西北内陆 Northwestern inland 1988
21 新陆早 1号 Xinluzao 1 西北内陆 Northwestern inland 1990
22 新陆早 7号 Xinluzao 7 西北内陆 Northwestern inland 1997
23 新陆中 8号 Xinluzhong 8 西北内陆 Northwestern inland 1999
24 新陆早 13 Xinluzao 13 西北内陆 Northwestern inland 2002
25 新陆早 22 Xinluzao 22 西北内陆 Northwestern inland 2005
26 新陆早 30 Xinluzao 30 西北内陆 Northwestern inland 2006
27 新陆中 26 Xinluzhong 26 西北内陆 Northwestern inland 2006
28 新陆中 35 Xinluzhong 35 西北内陆 Northwestern inland 2007
29 朝阳棉 1号 Zhaoyangmian 1 北部特早熟 Northern (early mature) 1957
30 锦棉 6号 Jinmian 6 北部特早熟 Northern (early mature) 1996
31 军棉 1号 Junmian 1 感黄萎病品系 Cotton line susceptible to Verticillium dahliae 1979
32 60182 抗黄萎病品系 Cotton line resistant to Verticillium dahliae
33 TM-1 陆地棉遗传标准系 Genetic standard line of upland cotton
34 海 7124 Hai 7124 海岛棉品种 G. barbadense cv. Hai 7124
Actin 9 (GenBank登录号为 AY305737)为内参基因,
通过半定量 RT-PCR 检测沉默后目的基因的表达。
棉花 GhCLA1、GhMAPKKK 和 GhActin 9 的半定量
RT-PCR引物以及检测 TRV病毒的 RT-PCR引物见
表 2。
1.5 棉花黄萎病菌 Vd8接种及抗性鉴定
将大丽轮枝菌菌株 Vd8涂布于固体土豆培养基
表面, 23℃培养 3~4 d; 后转移到液体培养基中, 振
荡培养 3~5 d; 用无菌蒸馏水将孢子洗脱下, 将孢子
浓度调节到每毫升 107个。
将含有 pTRV1 和 pTRV2-GhMAPKKK 的农杆
菌重悬液等量混合后注射棉花子叶 , 沉默
GhMAPKKK, 2周后用浸根法接种 Vd8菌株的孢子
液。接菌 4周后调查发病情况, 采用 0~4级方法统
计病级[19-20]。对每种材料处理 10 个单株。设 3 个
生物学重复。
第 8期 王心宇等: TRV病毒介导的基因沉默体系在棉花中的建立及应用 1359
表 2 本研究所用引物
Table 2 Primers used in this study
基因
Gene
引物序列
Sequence (5–3)
用途
Purpose
GhCLA1 F: GGAATTCCACAACATCGATGATTTAG
R: GGGGTACCATGATGAGTAGATTGCAC
构建 CLA1沉默载体所用引物(下画线为 EcoR I和 Kpn I位点)
Construction of CLA1 silencing vector (underlines are EcoR I
and Kpn I sites, respectively)
GhCLA1 F: GCCCTTTGTGCATCTTC
R: CTCTAGGGGCATTGAAG
沉默 CLA1后 CLA1基因 RT-PCR分析
CLA1 expression analysis by RT-PCR after silence
GhMAPKKK F: CCGGAATTCTGTTCCGGAGATTCCTGATCG
R: CGAGCTCAGGTCTTGTCCTTGGCGAGGT
黄萎病菌诱导后 GhMAPKKK的 RT-PCR分析
GhMAPKKK expression analysis by RT-PCR after V. dahlia infection
GhMAPKKK F: CCGGAATTCTGTTCCGGAGATTCCTGATCG
R: CGAGCTCAGGTCTTGTCCTTGGCGAGGT
构建 GhMAPKKK沉默载体所用引物(下划线为 EcoR I 和
Sac I位点)
Construction of GhMAPKKK silencing vector (underlines are
EcoR I and Sac I sites, respectively)
GhMAPKKK F: GCCTTGCCTAACACAAGAAC
R: GGATTGAACCACCAGAGACA
沉默 GhMAPKKK后 GhMAPKKK的 RT-PCR分析
GhMAPKKK expression analysis by RT-PCR after silence
GhActin9 F: CCTCCGTCTAGACCTTGCTG
R: TCATTCGGTCAGCAATACCA
内标对照 Reference gene as control
TRV-RNA2 TCCCCTATGGTAAGACAATGAG 反转病毒 RNA2的特异引物
Primer for reverse-transcription of RNA2
TRV-RNA2 F: TGGAGTTGAAGAGTTATTACCGAAGG
R: CCGGAATTCGAAACTCAAATGCTACCAA
通过扩增 TRV-RNA2来检测病毒的扩散
Detection of virus spread by amplifying TRV-RNA2 in plants
2 结果与分析
2.1 棉花 TRV-VIGS体系的建立
2.1.1 棉花 CLA1基因的克隆及 pTRV2-GhCLA1载体构
建 以 NCBI 中释放的拟南芥 CLA1基因序列
(GenBank登录号为AT4g15560)为探针, 搜索雷蒙德
氏棉(G. raimondii Ulbrich)全基因组序列[15], 获得其
序列信息 (Gorai.011G184200.2), 进一步设计引物 ,
从陆地棉遗传标准系 TM-1中克隆 GhCLA1基因
(GenBank登录号为 KJ123647)。其 ORF全长2163 bp,
编码720个氨基酸。序列相似性分析表明, 该基因与
拟南芥 CLA1基因的氨基酸相似性为83.0%。而来自
雷蒙德氏棉和陆地棉 TM-1中的 CLA1同源基因其核
苷酸和氨基酸序列相似性均达99%以上, 非常保守。
进一步设计 PCR 引物, 并在引物的5端分别加入限
制性内切酶 EcoR I和 Kpn I的酶切位点和保护碱基
(表2), 扩增位于棉花 GhCLA1基因 ORF 中部994~
1414 bp基因片段, 目标扩增片段长度为421 bp。经测
序验证后, 将该基因片段插入沉默载体 pTRV2, 获
得重组载体 pTRV2-GhCLA1。
2.1.2 棉花 TRV-VIGS 体系的建立 以未注射农
杆菌及注射含 pTRV1/pTRV2空载体的农杆菌混合液
的植株为对照, 用含有 pTRV1/pTRV2- GhCLA1的农
杆菌混合液侵染海岛棉海 7124出苗 8 d的子叶, 两周
后观察真叶表型。结果表明注射 pTRV1/pTRV2空载
体的幼苗叶片未呈现白化, 表型与未经侵染的对照
无异。而注射 pTRV1/pTRV2-GhCLA1植株, 其真叶
表现为叶脉及边缘部白化 , 逐渐扩散到整个叶片 ;
从第 2 片真叶起, 白化现象明显, 新生叶几乎完全
白化(图 1)。
为检测 TRV在棉花植株中的扩散情况, 提取注
射 pTRV1 和 pTRV2 空载体 3 周后的棉株根、茎、
叶组织 RNA, 利用 TRV-RNA2 特异引物将病毒
RNA2 反转为 cDNA, 并设计特异性引物扩增病毒
RNA2 序列片段, 以检测病毒在棉花不同组织器官
的扩散。RT-PCR 分析表明子叶接种病毒后, 病毒
RNA在棉花根、茎、叶中均有积累(图 2), TRV病毒
侵染棉花后可扩散到棉花多种组织器官中, 为利用
该体系高通量验证根、茎、叶等组织器官优势表达
目标基因功能提供了依据。
对 pTRV1/pTRV2-GhCLA1处理 3周后, 白化表
型明显的植株和仅空载体侵染处理的对照植株, 提
取叶片总 RNA, 通过半定量 RT-PCR 的方法检测
GhCLA1 基因的表达水平。结果表明, 与对照相比,
侵染 pTRV1/pTRV2-GhCLA1的植株GhCLA1基因几
乎不表达, 沉默效果明显(图 3)。
1360 作 物 学 报 第 40卷
图 1 沉默棉花 GhCLA1的白化表型
Fig. 1 Albino phenotype of GhCLA1 silenced cotton plants
A: 整株表型, 左为接种 pTRV1和 pTRV2空载体对照, 右为接种
pTRV1和 pTRV2-GhCLA1植株的真叶表型。B: 叶片沉默效果。
从左到右: 第一片真叶到第四片真叶。
A: phenotype of cotton plant, the left is a control plant inoculated with
pTRV1/pTRV2 constructs, the right is a cotton plant inoculated with
pTRV1/pTRV2-GhCLA1 constructs; B: phenotype of GhCLA1 silenced
cotton leaves; from left to right: the first to the fourth true leaves.
图 2 通过 RT-PCR分析 TRV在棉花不同组织中的扩散
Fig. 2 Spreading of TRV virus in different cotton tissues
analyzed by RT-PCR
1: pTRV2质粒; 2: 未侵染叶 cDNA; 3: 侵染叶 cDNA; 4: 侵染茎
cDNA; 5: 侵染根 cDNA。
1: pTRV2 plasmid; 2: uninfected leaf cDNA; 3: infected leaf cDNA;
4: infected stem cDNA; 5: infected root cDNA.
图 3 半定量 RT-PCR分析 CLA1基因沉默的效果
Fig. 3 CLA1 expression in silenced and non-silenced cotton
plants detected by semi quantitative RT-PCR
2.1.3 棉花 TRV-VIGS 体系利用的广谱性 选择
不同来源, 不同生态区的 34 份棉花材料, 进行沉默
体系重复。以注射 pTRV1/pTRV2空载体的植株为对
照, 用含有 pTRV1/pTRV2-GhCLA1的农杆菌混合液
注射 34份供试棉种子叶完全展平的幼苗, 诱导棉花
CLA1基因沉默。侵染 3周后统一调查第 2片真叶白
化表型(图 4)。发现在供试的不同棉种材料中, 其
CLA1抑制程度有差异, 如新陆早 1号、朝阳棉 1号、
TM-1 以及海 7124 等整个叶片白化, 中棉所 12、晋
棉 25、豫棉 20及华抗棉 1号等叶脉明显白化, 叶肉
轻度失绿。说明 TRV病毒可应用于所有供试材料的
CLA1 基因沉默, 但不同的棉花品种对 TRV 病毒的
敏感性存在差异。利用 TRV-VIGS 技术诱导目的基
因沉默受体遗传背景影响较小, 可广泛用于来源不
同棉花资源材料中目标基因的功能鉴定。
图 4 34份不同来源棉花品种/品系 TRV-VIGS诱导 GhCLA1基
因沉默表型
Fig. 4 Photobleaching phenotype of GhCLA1 silenced cotton
plants in 34 cotton varieties (lines)
编号对应的材料见表 1。每一材料上方为注射空载体对照, 下方
为沉默 GhCLA1基因的叶片。
Code numbers of cotton varieties correspond with these in Table 1.
In each column, the upper is the leaves of vector control plants and
the lower is those of GhCLA1 silenced plants.
2.2 利用 TRV-VIGS体系验证棉花 GhMAPKKK
基因功能
在MAPK信号通路中包含至少 3个顺序的激活
蛋白激酶 , 依次为 M A P K K K s、M A P K K s 及
MAPKs[21]。MAPKKKs参与了病原物侵染植物后引
起的过敏性反应[22]。GhMAPKKK (GenBank 登录号
为 FJ966894)是棉花 MAPKKKs 家族中的一个成员,
本研究表明该基因受黄萎病菌诱导表达。以生长到
二叶一心期的海 7124幼苗为受体, 接种黄萎病菌株
Vd8, 分别检测接种 0、24、48、96和 144 h后根组
织中 GhMAPKKK基因的表达水平。RT-PCR分析表
明, 随着接种时间增加, GhMAPKKK 基因表达明显
增强, 接种后 96 h表达量达到高峰, 接种后 144 h表
达量开始降低(图 5)。说明 GhMAPKKK 参与棉花抗
第 8期 王心宇等: TRV病毒介导的基因沉默体系在棉花中的建立及应用 1361
图 5 GhMAPKKK在黄萎病菌诱导下的表达特征
Fig. 5 Expression patterns of GhMAPKKK induced by
Verticillium dahliae strain Vd8
黄萎病信号传导途径。
利用 TRV-VIGS体系进一步验证了 GhMAPKKK
在黄萎病抗性中的功能。选择 GhMAPKKK基因靠近
3区 1519~2077 bp 碱基位置, 基因专化性强, 扩增
出 556 bp的目标片段, 克隆到 pTRV2载体中获得重
组质粒 pTRV2-GhMAPKKK。用含有 pTRV1/pTRV2-
GhMAPKKK以及 pTRV1/pTRV2-GhCLA1 和 pTRV1/
pTRV2 空载体的农杆菌重悬液, 分别侵染海岛棉中
抗黄萎病栽培品种海 7124出苗 8 d、子叶展平的幼
苗。3周后, 注射 TRV2-GhCLA1的植株出现明显白
化。提取 pTRV2-GhMAPKKK处理以及注射空载体
的对照植株叶片总 RNA, 通过半定量 RT-PCR 的方
法检测表明 , 与对照植株相比 , 侵染 pTRV2-
GhMAPKKK的植株GhMAPKKK基因的表达水平显
著降低, 沉默效果明显(图 6)。
图 6 半定量 RT-PCR分析 GhMAPKKK基因沉默效果
Fig. 6 GhMAPKKK expression in silenced and non-silenced
cotton plants detected by semi-quantitative RT-PCR
对 pTRV2-GhMAPKKK 处理以及注射空载体的对
照海 7124 植株, 接种大丽轮枝菌菌株 Vd8。一个月后
观察黄萎病的发病情况。通过 3次生物学重复分析, 注
射空载体的对照海 7124植株, 其平均病情指数为 21.9,
而 GhMAPKKK基因沉默后的海 7124植株感病性增强,
其平均病情指数达 41.25。表明 GhMAPKKK 基因参与
了黄萎病诱导的过敏反应(图 7)。
3 讨论
在病毒诱导的基因沉默中, 最早使用的沉默载
体是以烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)和
马铃薯病毒(potato virus X, PVX)为基础的, PVX比
较稳定但是宿主范围小, TMV 宿主范围广但不稳
图 7 黄萎病菌侵染 GhMAPKKK基因沉默后的海 7124表型
Fig. 7 Wilt symptom of GhMAPKKK silenced Hai 7124 plants
inoculated with Verticillium dahliae strain Vd8
上排和下排 4株分别为 GhMAPKKK 沉默及注射空载体对照后
接种黄萎病菌的表型。
Four plants on the upper and lower respectively: disease symptoms
in GhMAPKKK silenced and vector control plants in response to
Verticillium dahlia infection.
定。TMV 和 PVX 系统的缺陷还在于二者均能表现
出病毒本身产生的症状, 干扰那些能产生轻微表型
的基因, 使结果不易区别[23]。同时这 2 种病毒在宿
主植物的生长点和分生组织中不易扩散, 影响目标
基因沉默的整体效果。而以烟草脆裂病毒(tobacco
rattle virus, TRV)为基础的病毒载体具有明显的优势,
TRV 具有更广泛的宿主范围, 可以在包括植株生长
点和分生组织的所有组织器官内扩散, 病毒侵染植
株后的症状与其他病毒相比更加轻微。本研究以完
全展平子叶的棉花为受体, 成功建立棉花病毒诱导
基因沉默体系, 该体系具有稳定性和广谱性, 为快
速高通量研究棉花基因功能奠定了基础。
构建 pTRV-VIGS载体时需要考虑以下 3个方面:
(1)插入载体的目的基因片段的大小。要求适中, 以
300~500 bp为宜。TRV病毒载体插入基因序列长度
上限为 1.5 kb, 若超过 1.5 kb病毒不易在植物体内扩
散或者丢失目的片段, 影响沉默效果[24]。(2)选择合
适的目的基因区域插入载体。如果是单拷贝基因 ,
其 ORF中的任何区域都可以用来作为插入片段, 若
是多拷贝或家族基因, 则要根据研究目的选择基因
区域。如果专化沉默某一家族中的一个基因, 应选
择非保守区域或基因非翻译区(UTR)来区别高度保
守的基因, 如果两基因的同源性达到 85%以上就可
能被同时沉默。如果同时沉默家族基因中功能相似
的基因, 克服功能冗余, 则可选择高度保守区[25-26]。
(3)环境因素影响 VIGS 效果。温度是对沉默效果影
响最大的因素之一, 适宜的温度有利于提高基因沉
默的效率, TRV 介导基因沉默的最佳温度为 22℃左
1362 作 物 学 报 第 40卷
右[27]。本研究中, 克隆并选择棉花标记基因 GhCLA1
插入载体的片段大小为 421 bp, 目标验证基因
GhMAPKKK插入载体的片段大小为 556 bp。选择播
种后两周左右, 子叶完全展开而真叶尚未伸出时是
接种病毒的最佳时期。同时农杆菌侵染棉花后, 选
择 23℃左右的生长温度, 沉默效果好。
陆地棉是异源四倍体 , 基因组预测分析显示 ,
大约含 7万个基因[28], 而 2012年释放的四倍体棉种
亲缘关系最近的Ｄ基因组供体种―雷蒙德氏棉, 其
基因组中约含 3.7万基因[16], 需要建立高通量、准确、
易操作体系快速揭示基因功能。基于下胚轴的棉花
组织培养转基因再生体系周期长 , 受基因型影响
大。建立的 VIGS 技术具有简单、快速、高通量、
不受遗传背景影响等优点, 利用 TRV-VIGS 体系高
通量研究棉花基因功能, 特别是快速查明表型明显,
作用大的重要质量性状基因, 与棉花生长发育、抗
病抗逆等密切相关基因 , 以及关键代谢通路基因 ,
将为目标性状基因的快速发掘与育种应用提供重要
基因资源与依据。Gao等[14]通过 TRV病毒抑制棉花
抗黄萎病相关基因 GhNDR1和 GhMKK2表达, 阐明
了其在棉花抗病研究中利用潜力。Gao 等[29]通过棉
花黄萎病菌侵染后蛋白组学差异表达分析, 结合差
异表达基因的 VIGS功能验证, 揭示棉酚、油菜素类
酯、茉莉酸等对棉花抗黄萎病性具有重要作用。本
研究利用建立的棉花 TRV-VIGS 体系 , 证实沉默
GhMAPKKK 基因后, 抗黄萎病的海岛棉海 7124 植
株变得更易感病, 说明 GhMAPKKK 基因参与了黄
萎病诱导的过敏反应, 在棉花黄萎病抗病机制中发
挥作用。
4 结论
利用烟草脆裂病毒载体建立了基于病毒诱导的
棉花基因沉默体系。利用该体系, 病毒可高效扩散
到受体的根、茎、叶等器官, 受棉花不同遗传背景
影响小。应用该体系, 成功抑制了受黄萎病菌显著
上调的棉花 GhMAPKKK 基因表达。与对照株相比,
GhMAPKKK 抑制表达的棉花植株接种黄萎病菌后,
更易感病。建立的棉花 TRV-VIGS体系具有广谱性、
灵敏性和高通量等特点, 将加速棉花重要基因鉴定
和功能分析研究进程。
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