全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(4): 585592 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31170271, 31101023)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张骁, E-mail: xzhang@henu.edu.cn
Received(收稿日期): 2014-08-22; Accepted(接受日期): 2015-02-06; Published online(网络出版日期): 2015-03-02.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150302.0300.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00585
拟南芥下胚轴向光弯曲 P2SA2基因的克隆与功能鉴定
赵青平 赵 翔 慕世超 肖慧丽 张 骁*
河南大学生命科学学院 / 棉花生物学国家重点实验室 / 植物逆境生物学重点实验室, 河南开封 475004
摘 要: 向光素 PHOT1 介导较宽范围蓝光诱导的下胚轴向光弯曲, 而向光素 PHOT2 仅在强蓝光下起作用。强蓝光
下, PHOT1和 PHOT2介导拟南芥下胚轴向光弯曲的功能冗余性, 限制了人们对 PHOT2功能的研究。为此, 以拟南芥
phot1 突变体为材料, 避开 PHOT1 基因的干扰, 通过 EMS 诱变筛选拟南芥下胚轴向光不弯曲突变体, 成功克隆到 1
个基因, 命名为 P2SA2 (phototropin 2 signaling associated 2), 该基因被证明是 NPH3的等位基因。P2SA2基因的突变
可导致拟南芥缺失强蓝光诱导的下胚轴向光弯曲反应。在 p2sa2突变体背景下, P2SA2基因超表达可恢复强蓝光诱导
的拟南芥下胚轴向光弯曲。该结果将为强蓝光下 PHOT2下游基因的筛选、功能鉴定和揭开 PHOT2调节强蓝光诱导
的下胚轴弯曲的机制提供理论基础。
关键词: 拟南芥; 下胚轴向光弯曲; 蓝光; 图位克隆
Functional Analysis and Mapping of Gene P2SA2 Involved in Hypocotyl Pho-
totropism of Arabidopsis thaliana
ZHAO Qing-Ping, ZHAO Xiang, MU Shi-Chao, XIAO Hui-Li, and ZHANG Xiao*
State Key Laboratory of Cotton Biology / Key Laboratory of Plant Stress Biology / College of Life Sciences, Henan University, Kaifeng 475004,
China
Abstract: PHOT1 functions at both low- and high-intensity blue light to mediate phototropic responses, but PHOT2 functions
only at high-intensity blue light. The functional redundancy of PHOT1 and PHOT2 on high-intensity blue light-induced
phototropic curvature of hypocotyls in Arabidopsis thaliana, restricts the understanding of the mechanism of PHOT2 signal
transduction. Therefore, in order to avoid the interference of PHOT1, Arabidopsis phot1 mutant was selected as material for
screening high blue light insensitive mutants by the EMS mutation, and we successfully screened and cloned the gene P2SA2
(phototropin 2 signaling associated 2). The gene P2SA2 turned out to be the allelic of NPH3 (Nonphototropic hypocotyl 3). The
mutation of gene P2SA2 could result in that Arabidopsis thaliana lost the phototropism to unilateral high intensity blue light.
Transgenic plants of p2sa2 35S::P2SA2 restored hypocotyl phototropism to high intensity blue light. These findings will open new
perspectives about the screening and functional identification of PHOT2 downstream genes in response to high blue light, and
provide the theoretical basis to uncover hypocotyl bending mechanism regulated by PHOT2.
Keywords: Arabidopsis thaliana; Blue light; Phototropism; Map-based cloning
植物向光性是植物对光产生的最普遍反应, 即
在单侧光照射时, 植物体部分向光发生弯曲生长。
已有研究表明, 向光性由多个光受体系统控制, 尤
其是蓝光受体向光素。拟南芥蓝光受体向光素
(PHOT1 和 PHOT2)的 C末端含有 Ser/Thr 蛋白激酶
区域[1], N 端含有与 FMN 结合对光照、氧气及电压
差敏感的 2个 LOV (light, oxygen, voltage)区, 调节
其 C 末端激酶活性[2]。蓝光激发引起一个可逆的光
循环, FMN和 LOV区内保守的半胱氨酸之间形成共
价结合, 诱导蛋白构象变化, 激活 C 端激酶区, 引
起受体自磷酸化 [3], 从而引起相应生理反应 , 如植
物向光性[4], 气孔运动[5]、叶绿体移动反应[6]以及叶
片伸展 [7]等, 优化植物在极弱或极强光逆境下的生
长[8-9], 但其具体的分子机制并不清楚。
586 作 物 学 报 第 41卷


PHOT1 介导弱蓝光(0.01~1.00 µmol m–2 s–1)和
强蓝光( >1.00 µmol m–2 s–1)诱导的下胚轴向光弯曲, 而
PHOT2仅在强蓝光( >1.00 µmol m–2 s–1)下起作用[4,10]。
目前, 关于 PHOT1介导弱蓝光引起的下胚轴弯曲研
究较为明确, 即 PHOT1 感受弱蓝光后, 与其下游的
信号蛋白 NPH3[11]、RPT2[12]和 PKS1[13]相互作用, 调
控生长素输出载体 PIN1和输入载体AUX1[14-15]的活
性及定位, 引起生长素在下胚轴中不对称分布, 导
致植物向光弯曲。虽已证明 NPH3 和 RPT2 也参与
PHOT2 介导强蓝光诱导的下胚轴向光弯曲调节[12,16],
但并未检测到 RPT2与 PHOT2体内互作[12-13]。近年
研究发现, 编码 Ser/Thr蛋白磷酸酶 2A (PP2A)A1亚
基的 RCN1 与 PHOT2 蛋白体外互作 , 双突变体
phot1-5rcn1-1 在蓝光的照射下, 表现增强拟南芥下
胚轴向光弯曲[17]。因此, 进行强蓝光下 PHOT2下游
基因的筛选与功能鉴定, 将为揭开 PHOT2调节强蓝
光诱导下胚轴弯曲的机制提供基础。
文中以 phot1突变体为材料, 利用 EMS (甲基磺
酸乙酯)诱变筛选下胚轴强蓝光不弯曲突变体, 以期
获得 PHOT2 下游信号分子或 PHOT1 和 PHOT2 信
号的中心调节子。目前, 成功克隆到 1个基因, 命名
为 P2SA2 (phototropin 2 signaling associated 2), 该
基因被证明是 NPH3 的等位基因。P2SA2 基因的突
变, 可导致拟南芥缺失强蓝光诱导的下胚轴向光弯
曲反应。构建 P2SA2 基因的超表达载体获得 p2sa2
35S:: P2SA2植株, 发现其恢复了强蓝光诱导的拟南
芥下胚轴向光弯曲反应。通过对 P2SA2基因的研究,
将为揭示受 PHOT1和 PHOT2调节的强蓝光诱导下
胚轴弯曲的差异机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料诱变和培养
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)生态型除用于
图位克隆的Landsberg (Ler)为野生型外 , 其余都是
Columbia-0生态型 (gl1), 用作野生型对照 , 拟南芥
突变体种子 phot1 (phot1-5)、 phot2 (phot2-1)和
phot1phot2 (phot1-5 phot2-1)由Ken-ichiro Shimazaki
(日本九州大学)惠赠 [6,18], 突变体nph3-6由Christian
Fankhauser (瑞士日内瓦大学)惠赠[11]。试验以拟南芥
phot1突变体为材料参考赵翔等[19]的方法进行诱变。
1.2 突变体的筛选及遗传分析
将拟南芥M2代种子点种于0.6% MS培养基, 4℃
低温处理3 d, 待下胚轴长度约1 cm时 , 移入0.8%
MS培养基 , 将培养皿垂直放置 , 进行单侧强蓝光
(100 μmol m–2 s–1)处理。处理12 h后观察M2代幼苗下
胚轴向光弯曲情况, 筛选出下胚轴向光不弯曲的疑
似突变体移出进行培养, 待单株收获种子后进行遗
传和生理分析。突变体遗传分析, 以稳定遗传的疑
似突变体为母本 , 分别与父本phot1和WT (Lands-
berg生态型)回交和杂交得到F1代, F1代自交后产生
群体F2。把F2点种在含有0.6%琼脂的MS培养基上,
4℃低温处理3 d后暗处理4 d, 将黄化幼苗移入0.8%
MS培养基, 进行强蓝光(100 μmol m–2 s–1)单侧处理。
观察下胚轴向光弯曲与不弯曲的比例, 以确定其遗
传特性。
1.3 下胚轴向光弯曲度测量
参照 Zhao 等[20]的方法测量下胚轴向光弯曲度,
将黄化 4 d生长约 5~8 mm的拟南芥幼苗用镊子小心
移入 0.8% MS 培养基, 整齐排列成两行, 使下胚轴
与根部都紧贴培养基表面, 垂直放于 23℃暗室, 照
水平单侧蓝光 12 h。用数码相机照相, 在电脑上用
电子软件 E-尺测量弯曲度数。试验重复 3~5 次, 统
计其平均值。用 t检验进行差异显著性分析。
1.4 转基因材料的获得
提取野生型拟南芥叶片 RNA 并将其进行反转录
合成 cDNA, PCR扩增 P2SA2 CDS片段全长并回收目
的片段, 将目的基因与相关载体空质粒同时进行双
酶切, 连接产物转化大肠杆菌, 37℃过夜培养后, 选
取生长状态良好的菌落, PCR 鉴定是否为阳性菌落,
阳性菌落提取的质粒再经过双酶切和质粒 PCR验证。
将上述阳性质粒转化农杆菌 GV-3101, 鉴定后保存阳
性菌落菌种。选取生长旺盛, 开花较多的拟南芥进行
转化, 转化前剪掉长出的果荚。将其花浸于菌液(含
有目的片段质粒的农杆菌 GV-3101)中保持 30 s, 然
后拿出来标记好, 平放在转苗用的铁托盘中。浸染
完所有植株后, 用保鲜膜保持其湿润状态, 并将其
于避光处放置 24 h。随后将侵染过的材料取出正常
培养。为增加农杆菌的转化效率, 可在第 1次转化 1
周新的花蕾长出后, 进行第 2 次侵染。待收获种子
后使用潮霉素(Hyg)筛选潜在的转基因植株。
2 结果与分析
2.1 PHOT2 介导拟南芥下胚轴向光弯曲下游调
节子筛选与鉴定
考虑到PHOT1和PHOT2功能冗余介导强蓝光诱
导的拟南芥下胚轴向光弯曲生长, 为避开PHOT1基
第 4期 赵青平等: 拟南芥下胚轴向光弯曲 P2SA2基因的克隆与功能鉴定 587


因的干扰, 寻找PHOT2下游信号分子, 我们以phot1
突变体(遗传背景为Columbia生态型)为材料, 利用
0.3% EMS (甲基磺酸乙酯)诱变, 将诱变的种子种下,
自交一代后得到M2代。从大约8万粒M2代种子中初
步筛选出3株, 在100 µmol m–2 s–1单侧蓝光照射12 h
下胚轴弯曲情况与phot1存在明显不同的突变体(图
1-A)。随后将其单株收种, 再次进行表型验证, 如图
1-B和图1-C所示 , 初筛的3株疑似突变体依然表现

图 1 PHOT2介导拟南芥下胚轴向光弯曲下游调节子筛选
Fig. 1 Isolation of regulator involved in PHOT2-mediated
phototropism of hypocotyls in Arabidopsis
A: 从 EMS诱变 phot1突变体 M2代群体中筛选强蓝光不敏感突
变体; 红框: 疑似突变体 phot1p2sa1; 绿框: 疑似突变体
phot1p2sa2; 黄框: 疑似突变体 phot1p2sa3; 箭头: 照光方向、强
度和处理时间; B: 100 µmol m–2 s–1蓝光单侧处理 12 h后不同基
因型拟南芥下胚轴向光弯曲表型; C: 不同基因型拟南芥下胚轴
向光弯曲度统计。图中每个数据分别来自 3次独立重复试验, 大
约 19~24颗苗的平均值±标准误。其中 1: WT; 2: phot1;
3: phot1p2sa1; 4: phot1p2sa2; 5: phot1p2sa3。
A: HBL insensitive mutants from Arabidopsis M2 mutagenesis
population of phot1 mutants and selfing M1; red box: phot1p2sa1;
green box: phot1p2sa2; yellow box: phot1p2sa3; Arrows: direction
of light irradiation, fluence rate and treated time; B: typical seed-
ling phototropic curvature in indicated lines at 100 µmol m–2 s–1
blue light for 12 hours; C: hypocotyl curvatures were measured in
indicated lines. 1: WT; 2: phot1; 3: phot1p2sa1; 4: phot1p2sa2;
5: phot1p2sa3. Values are the means ± SD (n=19–24).
出对强蓝光刺激黄化苗下胚轴向光不弯曲的表型
(WT为 Columbia生态型)。基于 PHOT1基因已经突
变, 新突变体中的突变基因应该是 PHOT2 或位于
PHOT2下游参与调节拟南芥下胚轴向光弯曲反应的
某个基因, 又由于该突变体是在 phot1 突变体背景
下筛选获得 , 因此命名为 phot1p2sa2 (phototropin2
signaling associated 2)。
2.2 p2sa2突变体的遗传分析
首先将 phot1p2sa2 突变体与 phot1 回交, 发现
F1代下胚轴向光均发生弯曲, 而 F2出现下胚轴向光
弯曲与不弯曲表型分离为比 3∶1。将 phot1p2sa2突
变体与拟南芥野生型 (Col 生态型 )杂交 , 发现与
phot1突变体回交结果相似, F1代下胚轴均发生向光
弯曲反应, F2表型分离比同样出现 3∶1 (表 1), 证明
phot1p2sa2 突变体的表型为单基因隐性突变所致 ,
PHOT1基因突变与否并不影响对 p2sa2突变位点的
克隆。同时将突变体 phot1p2sa2与野生型(Landsberg
生态型)杂交, 其 F1代下胚轴均发生向光弯曲, F2分
别出现下胚轴弯曲和不弯曲表型分离比依然为 3∶1
(表 1), 再次证明 phot1p2sa2突变体表型是单基因隐
性突变。同时为其突变位点的克隆提供材料。
2.3 P2SA2基因的图位克隆
选取拟南芥 5 条染色体中每条染色体上、中、
下游分子标记, 共 15 个, 对 phot1p2sa2 突变体(Col
生态型)与野生型(Ler 生态型)杂交 F2代下胚轴向光
不弯曲的幼苗(接近 100棵)提取 DNA, 进行 PCR扩
增, 电泳检测统计每个分子标记的重组率, 如表 2
所示 , 发现 MQB2 这个 BAC 的重组率最低 , 为
6.32%, 可以判断 p2sa2 的突变位点, 可能位于拟南
芥第 5染色体的下部。
为此, 在第 5染色体 MQB2的 BAC前后, 选定
了 6 个有效的分子 Marker, 进行细定位。结果如表
3, MSJ1这个 BAC上的重组率最低, 为 0.23%, 最终
将 p2sa2突变基因定位到 MSJ1的 BAC上。

表 1 突变体杂交遗传分析
Table 1 Genetic analysis of mutants
F1代群体数 Number of F1 plants F2代群体数 Number of F2 plants
杂交类型
Cross
下胚轴弯曲
Phototropic
hypocotyl
下胚轴不弯曲
Nonphototropic
hypocotyl
下胚轴弯曲
Phototropic
hypocotyl
下胚轴不弯曲
Nonphototropic
hypocotyl
总计(株)
Total plants
卡平方
2
WT (Col)♀×phot1p2sa2♂ 87 0 564 176 740 0.14
phot1 (Col)♀× phot1p2sa2♂ 72 0 630 203 833 0.11
WT (Ler)♀×phot1p2sa2♂ 126 0 2774 956 3730 0.03

588 作 物 学 报 第 41卷


表 2 粗定位引物及重组计算
Table 2 Primers for locations and recombinant frequency
BAC名称
BAC name
标记位置
Marker location
上游引物序列
Forward primer sequence (5–3)
下游引物序列
Reverse primer sequence (5–3)
样数
Sample
size
重组率
RF (%)
T23J18 第 1染色体上部 Upstream of Chr. 1 GATATTTGTTTTGCTAACAC TAATAAAGTTCCAGCTTTGA 81 48.29
F28H19 第 1染色体中部Middle of Chr. 1 TGCGGGAGTGTGATAGAATA TCCTCGAAAGATTCATTGAT 81 49.57
T17F3 第 1染色体下部 Downstream of Chr. 1 GGACCGACGGTTACGAGAGT TAACGGGCCGTTGCAAGA 83 51.27
T23K3 第 2染色体上部 Upstream of Chr. 2 CGTGTTTACCGGGTCGGA AAAACCCTTGAAGAATACG 82 54.38
F3P11 第 2染色体中部Middle of Chr. 2 ATGTATTTGTTGCAAAATAA TGCACAGAAGAAAAAACTA 83 47.54
T16B24 第 2染色体下部 Downstream of Chr. 2 ATGAACGGAGTAGCTATC CGCGTAGAACATAATCTGTA 82 49.13
F20H23 第 3染色体上部 Upstream of Chr. 3 CAATGGGAAGAAGGTGTGAG CGCATTTCCATAAGTTTGTT 81 48.31
K1G2 第 3染色体中部Middle of Chr. 3 ATGAGCTTTAGGAGTGTGTA AATTTTGTCCCAAAAGAATA 82 46.54
T26I12 第 3染色体下部 Downstream of Chr. 3 GAGCAACATTAAGGATAGAA ATCTCATACTCATAATATGTAG 82 43.28
T4I9 第 4染色体上部 Upstream of Chr. 4 TTATAGCAAACGTACAAGTC CTGCATACACGTCGTCTC 83 46.55
FCA8 第 4染色体中部Middle of Chr. 4 TTCGGAGAAAGAAACGACAT ATGGAACTATTCAGGCATTA 84 47.24
T4L20 第 4染色体下部 Downstream of Chr. 4 ACCCTAAAACAATGTCTCTT TGCTAACATGGAAATTTGTC 81 49.52
MBK20 第 5染色体上部 Upstream of Chr. 5 CTCTGTTGGGGCAAAACC GATGCTGGAGAGTAGCTTAG 82 41.95
MYJ24 第 5染色体上部 Upstream of Chr. 5 TTCATGAGAGCGGCATTC GCAAAATGTTTGGACAATTA 88 39.32
T26D22 第 5染色体中部Middle of Chr. 5 CACAGGCCATTGGATGTA TGTTAGAACCCACCATTTG 87 31.66
K6M13 第 5染色体下部 Downstream of Chr. 5 CCTGTTCCAATGAATATG TGTAGCTGCTGAGTTGTC 88 25.41
MQB2 第 5染色体下部 Downstream of Chr. 5 AAAAGGCGACTACTAGCA GCCATTTATTTGGTCAAC 88 6.32
RF: recombinant frequency.

表 3 细定位引物及重组计算
Table 3 Primers for fine positioning and recombinant frequency
BAC名称
BAC name
上游引物序列
Forward primer sequence (5–3)
下游引物序列
Reverse primer sequence (5–3)
样数
Sample total
重组率
Recombinant frequency (%)
K21L19 AGCGAATAAGAAAAAGAGG AGGCAAAACAAGTTTTGA 886 3.90
MMN10 ATCCCCAAGCACATCAAC ACACTGCTGGTCAAGAAC 891 2.43
MMI9 AAACCAATCCATTGAAAC TGCAAATGCTTAGCTCTG 895 1.05
MGI19 GTTTTTCCCTCCTAATTG AGTATCGCCGTAGACGCA 1064 0.67
MSJ1 TTGTGTCCAGCTCCATGA GACCTTCCAAAACAACCG 1078 0.23
MPA24 AGGTCAGATCGCTGAGAA TCAAAAATGGCTAATCAAG 1082 1.12

MSJ1这个 BAC全长 88.41 kb, 共有 17个基因,
右端与 MGI19 有 8.53 kb 重叠, 左端与 MPA24 有
7.56 kb重叠, 将 MSJ1以及与 MGI19、MPA24相重
叠的基因 , 根据拟南芥网站 (http://arabidopsis.org/)
上报道基因信息, 发现 MSJ1 所在 BAC 上含有一个
参与蓝光信号途径的基因 AT5G64330, 其所编码的
蛋白 NPH3能够和蓝光受体 PHOT1相互作用(表 4),
推测可能是基因 AT5G64330 发生了突变, 随后对它
进行测序。
对突变体 phot1p2sa2中的AT5G64330基因进行
测序。通过序列比对, 发现 AT5G64330 基因的第
1252 bp发生了点突变, 由原来 G变为 A (图 2-A)。
即基因组编码区的第 4个外显子上的 1020碱基发生
突变(图 2-B)。蛋白质序列分析发现, 是三联子密码
TGG突变为 TGA (即由第 255个氨基酸色氨酸突变
为终止密码子)(图 2-C), 即第 255个氨基酸以后的编
码丢失, 导致其功能发生巨大的差异, 拟南芥缺失
强蓝光诱导的下胚轴向光弯曲反应。
2.4 P2SA2 调节强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向
光弯曲的功能验证
以phot1、nph3-6突变体、phot1phot2双突变体以
及phot1p2sa2突变体为材料 , 比较下胚轴向光弯曲
表型。如图3所示, 100 µmol m–2 s–1蓝光单侧照射12 h,
突变体nph3-6表型类似于phot1p2sa2和phot1phot2突
变体, 表现为强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲
缺失 , 而phot1突变体向光弯曲正常 , 暗示突变体
phot1p2sa2缺失强蓝光诱导的下胚轴向光弯曲 , 可
能是基因AT5G64330突变所致。
第 4期 赵青平等: 拟南芥下胚轴向光弯曲 P2SA2基因的克隆与功能鉴定 589


表 4 MSJ1基因功能预测
Table 4 Description of gene for MSJ1
基因名称
Gene name
功能描述
Description
AT5G64350 Encodes FK506-binding protein 12 (FKBP12 or FKP12)
AT5G64340 Encodes a bHLH (basic helix-loop-helix)-type transcription factor SAC51
AT5G64380 Inositol monophosphatase family protein
AT5G64370 PYD3 encodes a beta-ureidopropionase
AT5G64360 Chaperone DnaJ-domain superfamily protein
AT5G64390 Encodes a K homology (KH) domain-containing
AT5G64330 Involved in blue light response signaling pathway; interacts with the blue light photoreceptor NPH1
AT5G64300 Encodes GTP cyclohydrolase II
AT5G64290 Dicarboxylate transport 2.1 (DIT2.1)
AT5G64320 Pentatricopeptide repeat (PPR) superfamily protein
AT5G64310 Encodes arabinogalactan-protein (AGP1)
AT5G64220 Calmodulin-binding transcription activator protein
AT5G64240 Encodes a type I metacaspase
AT5G64210 Encodes an isoform of alternative oxidase
AT5G64230 Unknown protein
AT5G64270 Splicing factor, putative; FUNCTIONS IN: binding
AT5G64250 Aldolase-type TIM barrel family protein

图 2 P2SA2的定位及测序突变位点分析
Fig. 2 Map-based cloning of P2SA2 gene and sequence of the mutant gene
A: P2SA2的突变位点; B: p2sa2突变体的突变分析; C: P2SA2基因编码蛋白序列及突变分析, 编码第 255位色氨酸(红色 W)密码子突
变为终止密码子。
A: mutation of P2SA2 gene; B: mutation analysis of p2sa2; C: P2SA2 protein sequence. The 255th codon which encodes
tryptophan (red W) was mutated to the terminator.

为进一步证明 phot1p2sa2 突变体表型确实是
AT5G64330基因突变所致, 在 phot1p2sa2突变体背景
下, 构建了P2SA2的超表达植株。如图4所示, phot1p2sa2
突变体背景下超表达 P2SA2/NPH3 (AT5G64330)基因,
确实恢复了 phot1p2sa2突变体下胚轴向光弯曲的生长,
表型类似于野生型(Col)和 phot1 突变体, 不同于突变
体 phot1phot2、phot1p2sa2 缺失强蓝光诱导的拟南芥
下胚轴向光弯曲(图 4-A和图 4-B)。上述结果进一步证
实, phot1p2sa2突变体生理表型, 的确是 P2SA2/NPH3
(AT5G64330)基因突变所致。
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图 3 NPH3调节强蓝光诱导的下胚轴弯曲度生长
Fig. 3 Development of phototropic curvature in etiolated
seedlings of indicated lines
A: 100 µmol m–2 s–1蓝光单侧处理 12 h后不同基因型拟南芥下胚
轴向光弯曲表型; B: 不同基因型拟南芥下胚轴向光弯曲度统计。
图中每个数据分别来自 3次独立重复试验, 大约 19~21颗苗的平
均值±标准误。其中 1: phot1; 2: phot1p2sa2; 3: nph3-6;
4: phot1phot2。
A: development of phototropic curvature in etiolated indicated lines
at 100 µmol m–2 s–1 blue light for 12 hours; B: hypocotyl curvatures
were measured in indicated lines. 1: phot1; 2: phot1p2sa2;
3: nph3-6; 4: phot1phot2. Values are the means ± SD (n = 19–21).

图 4 P2SA2调节强蓝光诱导胚轴向光弯曲生长
Fig. 4 Hypocotyl phototropism of p2sa2 mutant in etiolated
seedlings was recovered by P2SA2
A: 100 µmol m–2 s–1蓝光单侧处理 12 h不同基因型拟南芥下胚轴
向光弯曲表型; B: 不同基因型拟南芥下胚轴向光弯曲度统计。图
中每个数据分别来自 3次独立重复试验, 大约 18~21颗苗的平均
值±标准误。其中 1: WT; 2: phot1; 3: phot1phot2; 4: phot1p2sa2;
5: phot1 P2SA2-OX1; 6: phot1 P2SA2-OX2。
A: typical seedling phototropic curvature in indicated lines at 100
µmol m–2 s–1 blue light for 12 hours; B: hypocotyl curvatures were
measured in indicated lines. 1: WT; 2: phot1; 3: phot1phot2;
4: phot1p2sa2; 5: phot1 P2SA2-OX1; 6: phot1 P2SA2-OX2.
Values are the means ± SD (n = 18–21).
3 讨论
PHOT1 和 PHOT2 既能通过不同的信号通路分
别调节不同的生理反应, 又能以共同的信号分子调
节下胚轴向光弯曲从而实现功能互补[21]。这种功能
互补性限制了 PHOT2调节下胚轴弯曲机制的研究。
为此, 以拟南芥 phot1 为材料, 通过 EMS 诱变筛选
PHOT2 下游调节因子, 成功克隆到基因 P2SA2。由
于是以 phot1 突变体为背景材料, 因此相应突变体
应该为 phot1p2sa2。对 phot1p2sa2 突变体的遗传分
析表明, phot1p2sa2是单基因隐性突变, 即该突变体
的表型由 P2SA2基因突变所致, 并不受 PHOT1基因
突变的干扰。为确定具体的突变位点 , 首先对
phot1p2sa2突变体进行图位克隆, 经过粗定位、细定
位、猜基因、基因功能预测、测序等过程后, 最终
认为 P2SA2 基因是定位于 MSJ1 这个 BAC 上的
AT5G64330基因, 该基因 1020 bp的 G变为 A, 三联
子密码 TGG突变为 TGA, 最终导致基因功能缺失。
该基因与已经报道的 NPH3基因是等位基因。P2SA2
基因突变后, 导致拟南芥缺失强蓝光诱导的下胚轴
向光弯曲反应, 类似于 phot1phot2 双突变表型。由
Christian Fankhauser (瑞士日内瓦大学 )惠赠的
P2SA2的 T-DNA插入突变体 nph3-6, 缺失强蓝光诱
导的拟南芥下胚轴向光弯曲。结合我们获得的
phot1p2sa2 突变体表型回补的超表达阳性植株, 恢
复拟南芥 phot1p2sa2突变体下胚轴向光弯曲的表型,
证实该突变体缺失强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光
弯曲的表型, 确实是 NPH3(At5G64330)突变所致。
NPH3 基因编码蛋白含有两个蛋白-蛋白互作结
构域, 一个是 BTB (broad complex, tramtrack, and
bric-a-brac)/POZ (pox virus and zinc finger), 另一个
是位于 N和 C末端的螺旋-螺旋结构域[11,22], 可能是
作为接头蛋白, 介导蛋白互作。暗处生长的拟南芥
黄化幼苗, 其表达的 NPH3 蛋白被磷酸化, 弱蓝光
照射可诱导其发生 PHOT1 依赖的去磷酸化反应[22],
调控生长素输出载体 PIN1 和输入载体 AUX1[14-15]
的活性及定位, 导致下胚轴向光和背光侧中生长素
的不对称分布, 诱导 NPH4/ARF7介导的向光弯曲[23]。
鉴于 nph3突变体缺失任何强度光(弱光/强光)照下向
光弯曲反应 , 暗示 NPH3 蛋白可能是 PHOT1 和
PHOT2介导向光性信号转导途径中的重要调节因子[24]。
已有研究证明 NPH3 蛋白定位于细胞质膜, 体外体
内均可与 PHOT1 和 PHOT2 相互作用[11,13,25]。鉴于
强蓝光下 phot1 突变体下胚轴表现向光弯曲, 此时
NPH3并未发生去磷酸化[26], 暗示NPH3的去磷酸化
对于 PHOT2 介导的向光性并非必要。强蓝光下
PHOT2如何调控 NPH3活性介导下胚轴的向光弯曲
反应机制并不清楚。近年来, 通过酵母三杂交, 找到
了NPH3的另一个结合蛋白EHB1 (enhanced bending
1) 受到向光性和向重力刺激, ehb1突变体下胚轴弯
曲度增强表明该蛋白是向光性和向重力性反应的负
调控因子[27], 同时 EHB1 有可能是向光素或者生长
第 4期 赵青平等: 拟南芥下胚轴向光弯曲 P2SA2基因的克隆与功能鉴定 591


素驱动 Ca2+的内流进入囊泡运输途径的信号传导子[28]。
NPH3 有可能是通过与 EHB1 的互作调控生长素的
不对称分布或是 Ca2+的内流来调节 PHOT2 介导的
强蓝光诱导的下胚轴向光弯曲反应。
4 结论
通过图位克隆技术, 成功克隆基因 P2SA2, 该
基因的突变导致拟南芥缺失强蓝光诱导的下胚轴向
光弯曲。测序比对和功能回补验证该突变体缺失强
蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲系 AT5G64330基
因的突变所致。该研究方法的建立将为强蓝光下
PHOT2 下游调节基因的筛选提供研究思路。蛋白
P2SA2 介导强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲的
功能解析, 将为揭开 PHOT2调节强蓝光诱导的下胚
轴弯曲的机制提供重要理论基础。
References
[1] Huala E, Oeller P W, Liscum E, Han I S, Larsen E, Briggs W R.
Arabidopsis NPH1: a protein kinase with a putative redox-
sensing domain. Science, 1997, 278: 2120–2123
[2] Demarsy E, Fankhauser C. Higher plants use LOV to perceive
blue light. Curr Opin Plant Biol, 2009, 12: 69–74
[3] Christie J M. Phototropin blue-light receptors. Annu Rev Plant
Biol, 2007, 58: 21–45
[4] Sakai T, Kagawa T, Kasahara M, Swartz T E, Christie J M,
Briggs W R, Wada M, Okada K. Arabidopsis nph1 and npl1: blue
light receptors that mediate both phototropism and chloroplast
relocation. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 6969–6974
[5] Kinoshita T, Doi M, Suetsugu N, Kagawa T, Wada M, Shimazaki
K. phot1 and phot2 mediate blue light regulation of stomatal
opening. Nature, 2001, 414: 656–660
[6] Kagawa T, Sakai T, Suetsugu N, Oikawa K, Ishiguro S, Kato T,
Tabata S, Okada K, Wada M. Arabidopsis NPL1: a phototropin
homolog controlling the chloroplast high-light avoidance re-
sponse. Science, 2001, 291: 2138–2141
[7] Carbonnel M D, Davis P, Roelfsema M R, Inoue S, Schepens I,
Lariguet P, Geisler M, Shimazaki K, Hangarter R, Fankhauser
C. The Arabidopsis PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE2
protein is a phototropin signaling element that regulates leaf
flattening and leaf positioning. Plant Physiol, 2010, 152:
1391–1405
[8] Kasahara M, Kagawa T, Oikawa K, Suetsugu N, Miyao M, Wada
M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in
plant. Nature, 2002, 420: 829–832
[9] Takemiya A, Inoue S, Doi M, Kinoshita T, Shimazaki K.
Phototropins promote plant growth in response to blue light in
low light environments. Plant Cell, 2005, 17: 1120–1127
[10] Briggs W R, Christie J M. Phototropins 1 and 2: Versatile plant
blue-light receptors. Trends Plant Sci, 2002, 7: 204–210
[11] Motchoulski A, Liscum E. Arabidopsis NPH3: a NPH1 photore-
ceptor-interacting protein essential for phototropism. Science,
1999, 286: 961–964
[12] Inada S, Ohgishi M, Mayama T, Okada K, Sakai T. RPT2 is a
signal transducer involved in phototropic response and stomatal
opening by association with phototropin 1 in Arabidopsis
thaliana. Plant Cell, 2004, 16: 887–896
[13] Lariguet P, Schepens I, Hodgson D, Pedmale U V, Trevisan M,
Kami C, de Carbonnel M, Alonso J M, Ecker J R, Liscum E,
Fankhauser C. PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE 1 is a
phototropin1 binding protein required for phototropism. Proc
Natl Acad Sci USA, 2006, 103: 10134–10139
[14] Blakeslee J J, Bandyopadhyay A, Peer W A, Makam S N, Mur-
phy A S. Relocalization of the PIN1 auxin efflux facilitator plays
a role in phototropic responses. Plant Physiol, 2004, 134: 28–31
[15] Stone B B, Stowe-Evans E L, Harper R M, Celaya R B, Ljung K,
Sandberg G, Liscum E. Distruption in AUX1-dependent auxin in-
flux alter hypocotyl phototropism in Arabidopsis. Mol Plant,
2008, 1: 129–144
[16] Sakai T, Wada T, Ishiguro S, Okada K. RPT2: a signal transducer
of the phototropic response in Arabidopsis. Plant Cell, 2000, 12:
225–236
[17] Tseng T S, Briggs W R. The Arabidopsis rcn1-1 mutation impairs
dephosphorylation of phot2, resulting in enhanced blue light re-
sponses. Plant Cell, 2010, 22: 392–402
[18] Doi M, Shigenaga A, Emi T, Kinoshita T, Shimazaki K I. A
transgene encoding a blue-light receptor, phot1, restores blue-
light responses in the Arabidopsis phot1phot2 double mutant. J
Exp Bot, 2004, 396: 517–523
[19] 赵翔, 王琳丹, 李园园, 赵青平, 张骁. PHOT2 介导拟南芥下
胚轴向光弯曲调节子的筛选与鉴定 . 植物学报 , 2014, 49:
254–261
Zhao X, Wang L D, Li Y Y, Zhao Q P, Zhang X. Isolation and
characterization of regulators involved in PHOT2-mediated pho-
totropismof hypocotyls in Arabidopsis. Chin Bull Bot, 2014, 49:
254–261 (in Chinese with English abstract)
[20] Zhao X, Wang Y L, Qiao X R, Wang J, Wang L D, Xu C S, Zhang
X. Phototropins function in high-intensity blue light-induced hy-
pocotyl phototropism in Arabidopsis by altering cytosolic cal-
cium. Plant Physiol, 2013, 162: 1539–1551
[21] Briggs W R, Beck C F, Cashmore A R. The phototropin family of
photoreceptors. Plant Cell, 2001, 13: 993–997
[22] Pedmale U V, Liscum E. Regulation of phototropic signaling in
Arabidopsis via phosphorylation state changes in the phototropin
1-interacting protein NPH3. J Biol Chem, 2007, 282: 19992–
20001
592 作 物 学 报 第 41卷


[23] Harper R M, Stowe-Evans E L, Luesse D R, Muto H, Tatematsu
K, Watahiki M K, Yamamoto K, Liscum E. The NPH4 locus en-
codes the auxin response factor ARF7, a conditional regulator of
differential growth in aerial Arabidopsis tissue. Plant Cell, 2000,
12: 757–770
[24] Liscum E, Briggs W R. Mutations of Arabidopsis in potential
transduction and response components of the phototropic signal-
ing pathway. Plant Physiol, 1996, 112: 291–296
[25] de Carbonnel M, Davis P, Roelfsema M R, Inoue S, Schepens I,
Lariguet P, Geisler M, Shimazaki K, Hangarter R, Fankhauser C.
The Arabidopsis PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE2
protein is a phototropin signaling element that regulates leaf flat-
tening and leaf positioning. Plant Physiol, 2010, 152: 1391–1405
[26] Tsuchida-Mayama T, Nakano M, Uehara Y, Sano M, Fujisawa N,
Okada K, Sakai T. Mapping of the phosphorylation sites on the
phototropic signal transducer, NPH3. Plant Sci, 2008, 174: 626–633
[27] Knauer T, Dümmer M, Landgraf F, Forreiter C. A negative effec-
tor of blue light-induced and gravitropic bending in Arabidopsis.
Plant Physiol, 2011, 156: 439–447
[28] Harada A, Shimazaki K. Phototropins and blue light-
dependent calcium signaling in higher plants. Photochem
Photobiol, 2007, 83: 102–111