全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(6): 1006−1012 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2007AA100505 和 2007AA10Z182), 国家自然科学基金项目(30671337), 农业部转基因生物
新品种培育科技重大专项(2008ZX08005-003)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王志兴, E-mail: wangcotton@126.com, Fax/Tel: 010-82106102
第一作者联系方式: E-mail: xujingwang0514@126.com; Tel: 010-82106124
Received(收稿日期): 2008-10-10; Accepted(接受日期): 2009-02-17.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01006
中棉(Gossypium arboreum)光诱导基因 Gacab启动子在转基因烟草中
的功能缺失分析
王旭静 李为民 唐巧玲 贾士荣 王志兴*
中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081
摘 要: 分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var. jinhua)光诱导基因 cab 5′上游的调控序列 1 009 bp, 并对其功能进
行了分析, 证明获得的这一 DNA片段具有驱动光诱导表达的功能。为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导
启动子, 根据光诱导表达调控元件所在的位置, 构建了 Gacab P和 197 bp、504 bp、779 bp的 5′端缺失体, 并将这些
缺失体分别与 gus (uid A)基因融合, 构建植物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草, 获得转基因烟草。GUS组织化
学分析表明, 转基因烟草的 T1代种子在光下培养时, 只有 Gacab P 驱动 gus 基因在转基因烟草的叶片表达, 其他 3
个启动子驱动 gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达; 当转基因烟草的 T1代种子在暗中萌发及培养时, Gacab
P 驱动 gus 基因在转基因烟草中无表达, 其他 3 个启动子驱动 gus 基因在转基因烟草的整个植株中均有表达。GUS
定量分析表明, −504 ~ −1 bp的启动子缺失体启动活性最高, 比 CaMV35S启动子高 0.6倍。上述结果表明只有全长的
Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性, 且−504 ~ −1 bp的启动子缺失体启动活性最高。
关键词: Gacab启动子; 功能缺失分析; 转基因烟草
Function Deletion Analysis of Light-Induced Gacab Promoter from Gossypium
arboreum in Transgenic Tobacco
WANG Xu-Jing, LI Wei-Min, TANG Qiao-Ling, JIA Shi-Rong, and WANG Zhi-Xing*
Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Genes encoding plant chlorophyll a/b binding proteins (CAB) are a typical group of light-inducible genes. It is well
established that cab promoters in plants are light-inducible and tissue-specific. We cloned a 1009-bp promoter sequence of the
Gossypium arboreum cab gene and clarified that this promoter (Gacab P) is light inducible. It is also verified that GUS transient
expression driven by Gacab P promoter fragment from −504 to −1 bp was significantly higher than that of the CaMV35S pro-
moter. Further work need to be conducted to testify whether this 500 bp segment still maintains light-inducible character. To find
the shortest length of light-inducible Gacab promoter with strong transcription activity, the full-length Gacab P (pA) and 5′ trun-
cations with lengths of 197 bp (pB), 504 bp (pC), and 779 bp (pD) were fused with the gus (uid A) gene and ligated into plant
expression vectors. All constructs were transformed into Nicotiana tabacum var. NC89 using the Agrobacterium-mediated trans-
formation method. A total of 30 to 35 independent transgenic tobacco lines were generated with each of these constructs. To de-
termine whether the various promoter constructs confer light-regulated expression to gus, F1 progeny seeds of transgenic plants
containing different Gacab promoter deletion constructs were geminated in either the dark or light. Ten days later, the seedlings
grown in the dark were transferred to the light. GUS histochemical assay showed that gus expression of the pA construct was not
detected in the dark, whereas its expression was measurable at green tissue for seedlings grown in the light. gus was expressed
throughout seedlings containing pB, pC, or pD grown in either the dark or the light. PlantCARE analysis reveals that some light
responsive elements are present between −1 009 and −779 bp, including sequences similar to the I-box and the G-box. To analyze
the effectiveness of different lengths of the Gacab promoter, GUS expression under the control of the Gacab promoter deletion
第 6期 王旭静等: 中棉(Gossypium arboreum)光诱导基因 Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析 1007


constructs was examined by fluorometric assays of transgenic tobacco leaf protein extracts. Twenty independent lines for each
construct were selected to monitor GUS activity. The average GUS activity is presented for each construct. GUS activity in-
creased when the nucleotides between −1009 and −504 were deleted. Further deletions from −504 to −197 resulted in decreased
promoter strength. The highest GUS activity was observed with construct pC, which contained the promoter fragment from −504
to −1 bp. In transgenic plants, the 5-deletion Gacab promoter fragments A, B, and D had relative activities of 50.2%, 60.0%, and
51.5% respectively (compared with pC). The −504 to −1 (C) fragment of the Gacab promoter had an activity of 160% compared
with CaMV35S. The strength of the other Gacab promoter deletion constructs was similar to CaMV35S. According to these re-
sults, we can get conclusion that only the full-length Gacab promoter was light inducible and expressed in a tissue-specific man-
ner, and the promoter fragment from −504 to −1 bp has the highest activity, 0.6-fold higher than that of the CaMV35S promoter.
Keywords: Gacab promoter; Function deletion analysis; Transgenic tobacco
植物光形态建成需要大量结构、代谢和调控基
因的表达。其中一部分基因在光下表达水平很高 ,
而在暗中表达水平很低甚至不表达, 称之为光诱导
基因。光诱导基因的表达由于光质、光量、光周期
和光向等的变化而受到不同的影响。其中一些光诱
导基因的表达具有组织特异性, 只在绿色组织中高
表达, 在根等器官中无法检测到。
植物捕光叶绿素 a/b蛋白复合体(chlorophyll a/b
binding protein, CAB)基因是一类典型的光诱导型基
因。目前已从梨、小麦和水稻等植物中分离得到了
cab 基因[1-6]。研究表明, 植物中的 cab 启动子具有
光诱导和组织特异表达的特性[7]。cab基因的表达是
在转录水平进行调控的, 而且其表达与不同光受体
有关[8]。
研究发现, cab基因的表达调控元件位于基因的
5′非翻译区。如梨 cab 基因 5′端上游的一个 400 bp
的启动子序列, 在转基因烟草中足以表现出组织特
异性和光诱导表达的特性[9]。拟南芥 cab-1 基因 5′
上游 1 396 bp中至少存在 3个光依赖性的顺式作用
元件, 其中 2 个近端的分别位于转录起始位点−253
~ −158 bp及−321 ~ −253 bp, 前者是启动子特异性
必需的, 后者具有增强 cab 启动子活性的作用。另
一个位于远端−1 396 ~ −766 bp, 也是负责启动子特
异性应答。序列分析发现, 在该启动子中存在一个
与 cab1 表达光调控有关的 Z-box 形成序列
(5′-ATACGTGT-3′) [10]。单子叶植物小麦 cab-1 启动
子转录起点−357 ~ −89 bp片段与 35S基本元件连接,
转化烟草证明, 268 bp DNA片段是一个光反应和组
织特异性的增强子, 由 3个不同的元件组成[7]。另外,
目前也已证明 cab启动子中含有一些 cis元件[11-14]。
李为民等[15]从金华中棉中分离得到了棉花 cab
基因的启动子 Gacab P, Gacab P全长 1 009 bp, 有明
显的组织特异表达和光诱导特性。缺失分析发现 ,
−504 ~ −1 bp的启动子缺失体驱动 gus 的瞬时表达
水平明显高于 35S 启动子的活性, 但是否仍表现光
诱导特性需要实验证明。因此, 本研究根据上述结
果, 设计 Gacab 启动子的一系列 5′端缺失体, 构建
植物表达载体, 农杆菌介导法转化烟草, 并以 GUS
基因作为报告基因来检测不同缺失体的表达特性 ,
以期分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子 ,
从而为未来植物基因工程研究提供新的调控元件 ,
使外源基因能够更经济有效的发挥作用。
1 材料与方法
烟草品种 NC89、含植物表达载体 pBI121的转
基因烟草、大肠杆菌 DH5α、农杆菌 LBA4404及植
物表达载体 pBI121 由本实验室保存。限制性内切
酶、Taq 酶和 T4连接酶购自 TaKaRa 试剂公司。其
他化学试剂为国产分析纯。
1.1 含有不同长度 Gacab 启动子的植物表达载
体的构建
根据获得的 Gacab P 序列设计引物 pA (5′-GC
AAGCTTGTCTAATAAATAATG-3′)、pB (5′-CAAG
CTTAGACCAACACCACTGACT3′)、pC (5′-CTAAG
CTTCAACATCAAGGGAGTTGT-3′)、pD (5′-CTAA
GCTTGTGGATTAAAGATTGCC-3′)和 pR (5′-CTG
GATCCGGTTGTAGAGGCCATTGTG-3′), 在前 4种
引物的 5′端引入 Hind III酶切位点, 在 pR的 5′端引
入 BamH I 酶切位点。以 Gacab P 为模板, 用引物
pA/pR、pB/pR、pC/pR及 pD/pR进行 PCR扩增, 反
应条件为 96℃ 3 min, 94℃ 30 s, 50℃ 1 min, 72℃
1 s, 30个循环, 72℃ 10 min, 分别获得长度为 1 009
bp的片段A, 779 bp的片段B, 504 bp的片段C及 197
bp的片段 D。用 Hind III/BamH I酶切上述 4种不同
长度的 DNA 片段, 回收后备用。同样用 Hind III/
BamH I处理 pBin121质粒, 将 35S启动子切除, 与
回收的 4 种不同长度的片段连接, 构建植物表达载
体 pA、pB、pC及 pD。
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1.2 烟草转化
将植物表达载体 pA、pB、pC 及 pD 利用热击
法转入农杆菌 LBA4404。含有植物表达载体的
LBA4404接种到 YEB液体培养基中(含 Kan 100 mg
L−1, Str 100 mg L−1, Rif 300 mg L−1), 150~250 g振荡
培养过夜; 培养物按 1∶1 的比例用 YEB 液体培养
基进行稀释, 继续培养至 A550 nm ≈ 1.0, 并利用此培
养物浸染 3~4 周龄的烟草叶片。侵染过的叶块摆放
在铺有 2层滤纸的MS共培养培养基上, 28℃暗培养
4 d。经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培
养基(MS + 6-BA 2 mg L−1 + Kan 100 mg L−1 + Carb
500 mg L−1)上进行培养, 获得转基因植株。
1.3 GUS组织化学染色
参考 Jefferson(1987)的方法。取植物组织或切片,
浸入适量 X-Gluc溶液中, 密封, 37℃避光过夜, FAA
固定 15 min, 75%、85%、95%和 100%酒精脱除叶绿
素, 观察是否有蓝色出现。
1.4 GUS定量分析
1.4.1 蛋白的提取 称取 100 mg新鲜的植物叶片,
在液氮中研成粉末, 加入 600 μL预冷的 GUS提取液
(0.05 mol L−1 Na3PO4, pH 7.0, 0.01 mol L−1巯基乙醇,
0.01 mol L−1 EDTA, 0.1% (W/V) Sarcosyl, and 0.1%
(W/V) Triton X-100)并混匀。然后 4 000×g离心 15 min,
吸出上清液, 并利用 Bradford方法测定蛋白浓度[17]。
1.4.2 4-methylumbelliferone (4-MU)标准曲线的绘
制 在 0.2 μmol L−1 Na2CO3 的终止液中加入
4-MU, 配成不同 4-MU 浓度的溶液 , 然后利用
Kontron SFM 25 分光光度计测其产生的荧光(激发
光 365 nm, 发射光 455 nm, 缝隙宽度为 10 nm),
绘制标准曲线。
1.4.3 GUS定量 吸取 10 μL蛋白提取液加入到
500 μL GUS检测液中[在GUS提取液中加入 1 mmol
L−1 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide (MUG)],
37℃反应 30 min后加入 990 μL 0.2 μmol L−1 Na2CO3
终止反应。然后利用 Kontron SFM 25分光光度计进
行荧光测定(激发光 365 nm, 发射光 455 nm, 缝隙
宽度为 10 nm), 根据标准曲线计算出产生的 4-MU
的浓度。GUS活性用每毫克蛋白每分钟形成的 4-MU
的 pmol表示, 计算公式为 G = 1510 × e / 30 × d (G:
GUS蛋白活性; e: 4-MU的浓度; d: 可溶性蛋白浓度)。
实验重复 3次。
1.5 不同长度的 Gacab启动子的表达模式分析
T1 代转基因烟草种子一部分在光下萌发和培养,
另一部分在黑暗条件下萌发, 待萌芽后再在光下培养
2 d。检测转基因烟草在不同生长条件下的 GUS表达,
从而确定不同长度 Gacab启动子的表达特性。
2 结果与分析
2.1 含有不同长度 Gacab 启动子的转基因烟草
的获得
利用 PCR的方法获得了Gacab启动子的一系列
5端缺失体 , 并构建了一系列植物表达载体 , 其表
达框如图 1 所示。通过农杆菌介导法转化烟草, 获
得了分别含有 pA、pB、pC及 pD的转基因植株 30~35
株。GUS组织化学染色证明, 由 Gacab启动子的不
同缺失体驱动的 gus基因都得到了有效表达(图 2)。

图 1 含有不同长度 Gacab启动子的植物表达载体的构建
Fig. 1 Construction of plant expression vectors containing Gacab promoter 5 deletion mutant
利用 PCR的方法扩增得到 Gacab启动子的一系列 5端缺失体, 扩增产物经 Hind III和 BamH I酶切后插入 pBin121, 构建 pA、pB、pC
和 pD。图中标出了 CAAT框和转录起始位点(ATG)所在的位置。
A series of 5-end-deleted Gacab promoter fragments were amplified using PCR method. Amplified products were digested with Hind III and
BamH I and inserted into pBI121 to make plant expression vectors pA, pB, pC, and pD, in which Gacab promoters replaced the CaMV35S
promoter. The coordinates of the relative deletion fragment are indicated. The relative positions of the CAAT box and transcription starts site
(ATG) are shown.
第 6期 王旭静等: 中棉(Gossypium arboreum)光诱导基因 Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析 1009



图 2 不同转基因烟草叶片的 GUS组织化学检测
Fig. 2 Histochemical GUS assay of different transgenic tobacco leaf
A: 含有 pA的转基因烟草; B: 含有 pB的转基因烟草; C: 含有 pC的转基因烟草;
D: 含有 pD的转基因烟草; E: 含有 pBI121的转基因烟草; F: 烟草受体 NC89。
A: transgenic tobacco with pA; B: ttransgenic tobacco with pB; C: transgenic tobacco with pC; D: transgenic tobacco with pD;
E: transgenic tobacco with pBI121; F: control NC89.

2.2 转基因烟草中不同长度 Gacab 启动子的表
达分析
通过 GUS定量分析的方法, 分析了不同长度的
Gacab 启动子的表达活性。每种类型的转基因烟草
选取了 20 株 GUS 组织化学检测为阳性的植株进行
GUS定量分析, 取其平均值来代表每种 Gacab启动
子缺失体驱动下的 GUS活性, 从而确定启动子的表
达活性。结果显示, Gacab启动子−1 009 ~ −504 bp之
间的DNA片段缺失会使启动子活性增加, −504 ~ −197
bp 的 DNA 片段缺失会导致启动子活性的降低。启动
子 C (−504 ~ −1 bp启动子缺失体)表现出最高的活性,
比 CaMV35S启动子活性高 0.6倍。其他 3个启动子缺
失体(A, B, D)活性较低, 分别为片段 C (−504 ~ −1 bp
启动子缺失体)活性的 50.2%、60.0%和 51.5%, 但与
35S启动子的活性差别不大(图 3)。这些研究结果与在
水稻愈伤组织瞬时表达结果相一致[15]。

图 3 转基因烟草中表达 gus报告基因来对 Gacab的缺失分析
Fig. 3 Gacab promoter deletion analysis in transgenic plants
expressing the gus reporter gene

2.3 转基因烟草中不同长度的 Gacab 启动子的
光诱导表达特性分析
为检测不同长度的 Gacab启动子的光诱导表达
特性, F1 代不同类型转基因烟草的种子分别在黑暗
和光下萌发, 10 d 后将在黑暗中萌发的幼苗转移至
光下培养 2 d。然后对黑暗和光下生长的幼苗进行
GUS 组织化学染色, 结果表明, 黑暗中萌发的含有
pA 的转基因烟草幼苗不能检测到 GUS 的表达, 而
在光下萌发的幼苗或黑暗中萌发后转移到光下培养
的幼苗中能检测到 GUS基因的表达, 而且只能在叶
片中有表达; 在黑暗和光下萌发的含有 pB、pC 或
pD 的转基因烟草幼苗中都能检测到 GUS 基因的表
达。以上结果说明, 只有 A片段的启动子(Gacab P)
具有光诱导和组织特异表达的特性, 其他缺失体均
为组成型表达, 且不受光诱导(图 4)。
3 讨论
一般来讲, 光诱导启动子中存在正负调控元件
来调控基因的转录, 而且基因的表达特性是这些元
件综合调控的结果。研究发现, 梨和烟草 cab 基因
的上游序列能提高基因的表达量[12,18]。Ha 和 An[10]
发现拟南芥 cab1基因上游的–321 ~ –253 bp区域能
增强 cab1 启动子活性。Cecillia 等[7]发现小麦 cab
启动子中的一个 268-bp的 DNA片段(–357 ~ –89 bp)
由 3 个调控元件组成, 对启动子的活性起到增强作
用。本研究将 Gacab 启动子的一系列 5端缺失体导
1010 作 物 学 报 第 35卷


图 4 Gacab 启动子不同缺失体的光诱导和组织特异表达分析
Fig. 4 Light inducible and tissue specific expression characteristic of Gacab promoter 5 deletion mutant
A: 含有 Gacab 5端缺失体的转基因烟草在黑暗条件下萌发和生长; 含有 pB、pC、pD和 pBI121的转基因烟草整株都能检测到 GUS
的表达, 而含有 pA的转基因烟草和非转基因烟草中不能检测到 GUS的表达。B: 转基因烟草在黑暗中萌发, 然后转移到光下培养 2 d;
所有转基因植株都能检测到 GUS的表达, 但含有 pA的转基因烟草只在绿色组织中检测到 GUS表达, 而其它转基因植株整株都能检
测到 GUS表达。C: 转基因烟草在光下萌发和生长; 所有转基因植株都能检测到 GUS的表达, 但含有 pA的转基因烟草只在绿色组织
中检测到 GUS表达, 而其它转基因植株整株都能检测到 GUS表达。a: 含 pA的转基因烟草; b: 含 pB的转基因烟草; c: 含 pC的转基
因烟草; d: 含 pD的转基因烟草; e: 含 pBI121的转基因烟草; f: 受体 NC89。
In order to detect the expression characteristic of a series of Gacab promoter 5′ deletion mutant, F1 seeds of transgenic tobacco were germi-
nated at light or dark such as described in methods and materials. Histochemical GUS assay was done for the plant. The results indicated that
only the whole Gacab promoter is light inducible and express as specifically in green tissue. A: the transgenic tobacco containing Gacab
promoter 5′ deletion mutant was geminated and grown at dark. Gus expression can be detected in the whole plant of transgenic tobacco con-
taining pB, pC, pD, and pBI121, and not in transgenic tobacco plant containing pA and the control. B: the plants were grown at light for 2
days after germinated at dark. All transgenic plants can express GUS effectively. Transgenic plants containing pA can only express GUS at
green tissue, and the others express GUS at all tissues. C: the transgenic tobacco were germinated and grown at light. All transgenic plants
can express GUS effectively. Transgenic plants containing pA can only express GUS at green tissue, and the others express GUS at all tissues.
a: transgenic tobacco containing pA; b: transgenic tobacco containing pB; c: transgenic tobacco containing pC; d: transgenic tobacco containg
pD; e: transgenic tobacco containing pBI121; f: NC89, the control.

入烟草, 以 GUS 为报告基因进行分析, 发现启动子
中促进基因表达的正调控元件位于−504 ~ −197 bp,
而负调控元件位于−1 009 ~ −504 bp。
以往研究表明, GT1基序具有黑暗条件下抑制
光诱导基因转录的功能[19]。5′UTR 嘧啶密集区是一
个 cis 元件, 参与基因转录水平的调控[20], Spl在基
因转录激活中扮演重要角色[21], 而 CAAT 框是一个
普遍存在于启动子和增强子区的 cis元件(图 5)[22]。
PlantCARE分析结果显示, 在Gacab启动子中, −802
~ −504 bp区域存在 2个 GT1元件(5-GGTTAA-3和
第 6期 王旭静等: 中棉(Gossypium arboreum)光诱导基因 Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析 1011


3-TAGTTGG-5), –498 bp处存在 1个 5UTR嘧啶密
集区(5-TTTCTCTCTCTCTC-3), −504 ~ −262 bp存
在 1 个 Sp1 (5-TTTCTCTCTCTCTCCC-3)和 6 个
CAAT框。由此推测, Gacab启动子的−504 ~ −197 bp
区域能增强启动子活性, 此假设与我们得到的 pC
启动子驱动的 GUS 基因表达活性最高的结果相一
致。另外, 研究结果表明, 只有全长的 Gacab 启动
子具有光诱导特性, 在−1 009 ~ −779 bp存在一些光
调控元件。事实上, 序列分析显示, 此区域含有一些
光应答和组织特异调控元件, 包括光诱导启动子中
存在的光调控元件 I-box和 G-box, 这些调控元件是
光调节基因转录活性不可缺少的[23-25]。

图 5 Gacab启动子序列分析
Fig. 5 Sequence analysis of Gacab promoter
PlantCARE分析显示, Gacab启动子中存在一些调控元件, 包括 2个 GT1元件, 1个 5UTR Py-rich、1个 Sp1、2个 G box和 12个 I box。
图中, 上链为“+”链, 下链为“–”链, 起始密码子 ATG的“A”为 +1位点。起始密码子 ATG、TATA box分别用下划线表示; G box
和 I box分别用黑色阴影和深灰色阴影表示; GT1用 表示; CAAT box用方框表示; 5UTR Py-rich用 表示; SP1用 表示。
The results of sequence analysis by PlantCARE indicated that there have many regulatory elements in Gacab promoter. There are two GT1
elements, which is responsible for turning off the transcription of light inducible genes in the dark. One 5UTR Py-rich conferring high tran-
scription levels exists in the –498 bp region, one Sp1 which plays an important role in activation of transcription exists in –498 region. Also,
there are two G box and twelve I box exist in Gacab promoter. In this picture, upper strand is “+”strand, lower one is “-” strand. “A” of the
initiation codon ATG is “+1”. ATG and TATA box are underlined. G box and I box are shaded with black and deep-gray, respectively. GT1
element is framed and shaded. CAAT box is framed. 5UTR Py-rich stretch is shaded. SP1 is underlined and shaded.

4 结论
根据光诱导表达调控元件所在的位置, 构建了
Gacab P和 197 bp、504 bp、779 bp的 5端缺失体, 并
将这些缺失体分别与 gus (uid A)基因融合, 构建植
物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草, 获得转基
1012 作 物 学 报 第 35卷

因烟草。通过对启动子的活性和表达特性分析, 发
现只有全长的 Gacab启动子具有光诱导和绿色组织
特异表达特性, 且−504 ~ −1 bp的启动子缺失体启
动活性最高。
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