全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(2): 238−242 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 教育部科学技术研究重点项目(02010)
作者简介: 李雪梅(1982–), 女, 山东东营, 硕士。
*
通讯作者(Corresponding author): 王振英(1966–), 博士, 教授。Tel: 022-23766569; E-mail: wzycell@eyou.com.cn
彭永康(1950–), 男, 博士, 博士生导师, 教授。Tel: 022-23766569; E-mail: pykcell@eyou.com.cn
Received(收稿日期): 2007-03-09; Accepted(接受日期): 2007-08-23.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00238
PSⅡ抑制型除草剂 Atrazine 诱导白菜幼苗叶绿体蛋白质组的变化
李雪梅 张维佳 王 艳 王振英* 彭永康*
(天津师范大学生物系, 天津 300387)
摘 要: 为了分析除草剂的作用机理, 用PSⅡ抑制型除草剂阿特拉津处理白菜幼苗, 用 2-DE技术和生物质谱方法分析叶
绿体蛋白质组的变化, 结果表明, 23种叶绿体蛋白质斑点表现出明显且可重复的改变, 其中 4个下调, 5个上调, 14个表现
出质的变化；在被处理植株中 10个蛋白质斑点是新合成的; 14个蛋白质斑点中的 4个在高浓度(10 mg L−1) Atrazine处理
后消失了, 但在低浓度 (0.01、 0.1 和 1 mg L−1) Atrazine 处理下没有变化。对 14 个发生了质变的蛋白质斑点进行了
MALDI-TOF MS分析, 其中 7个分别被鉴定是糖基转移酶-Ⅰ、异戊二烯合成酶、一个经推测的蛋白质、脯氨酸脱氢酶、
推测的 6-果糖磷酸激酶异构酶Ⅱ、钙转运 ATP酶和尿素酶 K。同时也分析了阿特拉津处理对白菜幼苗叶绿素含量和可溶
性蛋白质含量的影响, 结果表明, 经阿特拉津处理后叶绿素 a 含量下降, 叶绿素 b 含量有上升趋势, 但不显著。可溶性蛋
白质含量随阿特拉津浓度的增加呈上升趋势。
关键词: PSⅡ抑制剂阿特拉津; 叶绿体蛋白质组; 质变; MALDI-TOF MS; 白菜
Changes in Chloroplast Proteome of Chinese Cabbage Seedlings Induced by
PSⅡInhibiting Herbicide Atrazine
LI Xue-Mei, ZHANG Wei-Jia, WANG Yan, WANG Zhen-Ying*, and PENG Yong-Kang*
(Department of Biology, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China)
Abstract: To investigate the mechanism with which the herbicides works, chloroplast proteome was analyzed in Chinese cab-
bage seedlings treated with PSⅡinhibiting herbicide Atrazine by using 2-DE techniques and MALDI-TOF MS. The results indi-
cated that 23 protein spots showed significant and reproducible changes in treated-seedlings, of which 4 protein spots were
down–regulated (spots 15−18) and 5 protein spots up-regulated (spots 19−23). Fourteen protein spots showed qualitative changes
between control and treated samples. Ten out of 14 proteins (spots 5−14) were newly synthesized in the treated seedlings. Four out
of 14 protein spots (spots 1−4) disappeared treated with high concentration Atrazine (10 mg L−1), and not with low concentration
Atrazine (0.01, 0.1, and 1 mg L−1, respectively). From the 14 protein spots, spots 1, 2, 5, 6, 8, 10, and 13 were respectively identi-
fied as glycos-transf-Ⅰ , isoprene synthase, hypothetic protein, proline dehydrogenase, putative 6-phospho-fructo kinase
isozymeⅡ, calcium transporting ATPase, and maturase K, respectively. Changes in chlorophyll content and soluble protein content
were also determined in treated seedlings. It was found that chlorophyll a content decreased, while chlorophyll b content showed a
little increase without significant difference. The soluble protein content increased with increasing treatment concentration.
Keywords: PSⅡinhibiting herbicide Atrazine; Chloroplast proteome; Qualitative change; MALDI-TOF MS; Chinese
cabbage
阿特拉津(Atrazine)是一种三氮苯类除草剂, 被 广泛用于控制农田一年生杂草和阔叶杂草。自 20世
第 2期 李雪梅等: PSⅡ抑制型除草剂 Atrazine诱导白菜幼苗叶绿体蛋白质组的变化 239


纪 80年代早期引入我国, 到 2000年, 其使用量已达
2 835.2 t, 并且当前仍以 20%的需求量增加[1]。阿特
拉津可以在土壤中长期存在 , 并在作物体内累积 ,
造成农业环境污染, 作物受害, 对食品安全造成潜
在威胁。因此, 阿特拉津已经引起人们的高度重视。
在过去几十年中 , 研究者们对阿特拉津的环境检
测 [2-3], 生物降解与生物除污 [4-5], 植物和动物 [6−9]的
毒理影响以及代谢机理[10]的研究取得了很大进展。
目前已知, 阿特拉津是一种选择性除草剂, 它通过
干扰杂草正常的光合作用功能、损害叶绿素、减低
CO2 的固定[11-12]而抑制杂草的生长。虽然许多研究
者对阿特拉津的作用机理和毒害效应已经作了很多
研究, 但他们的工作大多数是侧重于研究经阿特拉
津处理后的作物分离的叶绿体光合作用反应和电子
传递方面, 而从生化毒理学尤其是从叶绿体蛋白质
组学的角度研究阿特拉津很少有人报道, 因而, 其
对农作物有害影响的作用机理还没有很好的理解。
近年来, 蛋白质分析技术上的突破, 特别是蛋白质
组学技术的出现, 使我们在研究植物的某一个特定
组织或在某一特殊环境胁迫下, 植物体内蛋白质组
分变化时, 可以获得更大量、更全面的实验结果。
目前已有很多研究者利用蛋白质组分析技术, 对植
物受到盐、低温、H2O2、疾病等胁迫时[13-16], 体内
蛋白质组的变化作了分析, 取得很多有价值的实验
结果, 但利用白菜为实验材料, 研究在除草剂胁迫
下 , 体内蛋白质组尤其是叶绿体蛋白质组的变化 ,
国内外还没有报道。本研究报道了白菜幼苗经阿特
拉津处理后, 叶绿体蛋白质组的变化, 旨在为农业
上安全使用三氮苯类除草剂提供有用的依据。
1 材料与方法
1.1 材料与培养
中国白菜(Brassica campestris L. ssp. pekinesis)
种子经 3% HgCl2表面消毒 5 min, 再用自来水冲洗 2
次, 在含有用蒸馏水湿润滤纸的培养皿中, 室温下
萌发 24 h, 再在 28℃/25℃(白天/晚上)培养 3 d, 每天
光照 12 h。将 3 d龄的幼苗分别放入 0、0.01、0.1、
1和 10 mg L−1阿特拉津溶液处理 3 d。
1.2 叶绿体分离和叶绿体蛋白质的制备
根据 Roscoe 等[17]的方法。白菜叶子放入预冷
分离介质 A(含 0.33 mol L−1 山梨醇、4 mmol L−1
MgCl2、2 mmol L−1抗坏血酸、10 mmol L−1焦磷酸
钠, pH 6.5)中匀浆, 4层纱布过滤, 200 × g 4℃下离心
7 min, 上清液放入干净的离心管, 1 000 × g 4℃下离
心 7 min, 沉淀物重新悬浮于预冷分离介质 B(含 0.33
mol L−1 山梨醇、4 mmol L−1 MgCl2、50 mmol L−1
HEPES、2 mmol L−1 EDTA, pH 7.6), 1 000 × g 4℃下离
心 7 min, 此步骤需重复 3次。将叶绿体重新悬浮于稀
释的分离介质 B(1︰25), 8 000 × g 4℃立即离心 5 min,
除去分离介质, 将叶绿体悬浮于等渗介质 B和 80%预
冷的丙酮中, −20℃温浴 1 h后, 35 000 × g离心 15 min,
将沉淀物冻干, 然后将干燥的沉淀物溶解于裂解缓冲
液[含 9 mol L−1脲、4%CHAPS、10 mmol L−1 DTT、
0.5%两性电解质(pH 3.0~10.0)、1 mmol L−1 PMSF、
2 mmol L−1 EDTA、20 mmol L−1 Tris-HCl (pH 8.5)]
40 000 ×g离心 30 min。以 BSA为标准蛋白质溶液, 利
用 Bradford介绍的方法[18]测定蛋白质浓度。
1.3 电泳和图谱分析
电泳第一向利用 IPG胶条(pH 3.0~10.0, 11 cm),
第二向在 BioRad蛋白质分析系统进行, 每根胶条的
上样量为 60 μg。分别在 250 V下 1 h, 500 V下 1 h,
1 000 V下 2 h, 2 000 V下 2 h, 4 000 V下 2 h进行等
电聚焦。电泳的第二向用 Laemmli[19]介绍的 12.5%
的聚丙烯酰胺凝胶, 其结果经 3 次重复。凝胶经考
马斯亮蓝 [20]染色 , GS800 色谱扫描取得图像 , 用
PDQuest 软件进行凝胶斑点检测、匹配和差异斑点
鉴别, 确定对照和处理组之间有差异的蛋白质斑点,
进行质谱分析。
1.4 凝胶消化和 MALDI-TOF MS分析
从制备胶上切下经鉴别有差异的蛋白质斑点 ,
用超纯水冲洗 2次, 50 mmol L−1NH4HCO3脱色 2次,
100%乙腈干燥, 用 0.1% TFA在 50%乙腈溶液 37℃下
消化过夜, 将制备物混匀, 冻干。将冻干的制备 物溶
解在含有 0.1%TFA和 50%乙腈的 5 mg mL−1 CHCA中,
利用 ABI 4700 型 (USA)正离子生物质谱仪进行
MALDI-TOF MS分析, 以胰蛋白酶自动降解片段为
内部标准校正。通过 MASCOT 软件, 在 NCBInr 数
据库进行查询。为了表明新鉴别的蛋白质的可靠性,
每个被鉴定的蛋白质序列覆盖率至少达 15%, 最少
肽数目为 5 个, 肽质量数误差范围为±0.1 Da, 未水
解的酶切位点数为 1, 对照物种为水稻和拟南芥。
2 结果与分析
2.1 叶绿素含量和可溶性蛋白质含量变化
分别用 1 mg L−1和 10 mg L−1阿特拉津处理 3 d
后, 幼苗中叶绿素 a 含量从(0.543±0.008)(对照)下降
240 作 物 学 报 第 34卷

至(0.518±0.003) mg g−1 FW(P<0.05), (0.488±0.010)
mg g−1 FW (P<0.01)。而叶绿素 b含量虽然有一定增
加, 但不显著(表 1)。

表 1 白菜经阿特拉津处理后叶绿素含量变化
Table 1 Changes in chlorophyll content in Chinese cabbage
which with Atrazine (mg g−1)
浓度
Concentration
叶绿素 a
chlorophyll a
叶绿素 b
chlorophyll b
0 0.543±0.008 0.231±0.005
0.01 mg L−1 0.540±0.003 NS 0.251±0.001 NS
0.1 mg L−1 0.551±0.007 NS 0.254±0.004 NS
1 mg L−1 0.518±0.003* 0.258±0.002 NS
10 mg L−1 0.488±0.010** 0.237±0.010 NS
NS: 差异不显著。
NS: no significant difference. *: significant at P<0.05,
**: significant at P<0.01.

用 0.1 mg L−1阿特拉津处理白菜幼苗后, 可溶
性蛋白质含量从(9.446±0.201) mg g−1 FW(对照)下降
至(10.476±0.076) mg g−1 FW (P<0.01), 当浓度提高
到 10 mg L−1 时 , 可溶性蛋白质含量增加到
(14.311±0.528) mg g−1 FW (P<0.01)(表 2)。

表 2 白菜经阿特拉津处理后可溶性蛋白质含量变化
Table 2 Changes in soluble protein contents in Chinese cabbage
treated with Atrazine(mg g−1FW)
浓度
Concentration
可溶性蛋白质含量
Soluble protein content
0 9.446±0.201
0.01 mg L−1 9.612±0.109 NS
0.1 mg L−1 10.476±0.076**
1 mg L−1 10.940±0.175**
10 mg L−1 14.311±0.528**
NS: 差异不显著。
NS: no significant difference. *: significant at P<0.05,
**: significant at P<0.01.

2.2 白菜经阿特拉津处理后叶绿体蛋白质的
2-DE分析
3 d苗龄的白菜经 0、0.01、0.1、1和 10 mg L−1
阿特拉津处理 72 h后, 幼苗已经可以看到明显的处
理症状 , 叶子开始变黄 , 幼苗生长停止 , 但仍能存
活。利用处理 3 d 的幼苗分离的叶绿体蛋白质, 在
pH 3~10 胶条上进行 2-DE 分析, 从图 1 可以看出,
与对照相比, 23 个叶绿体蛋白质斑点产生变化, 其
中有 4个(斑点 15~18)表现下调, 5个(斑点 19~23)表
现上调。在对照和样品间, 有 14个蛋白质斑点表现
出质的变化(图 1-A、B、C), 如有 10个蛋白质斑点(斑
点 5~14)仅在处理过的幼苗中存在, 可以被认为是
经阿特拉津处理后新合成的。有 4个蛋白质斑点(斑
点 1~4)在经 10 mg L−1阿特拉津处理后消失。

图 1 白菜幼苗经 0.1 mg L−1 PSⅡ抑制型除草剂阿特拉津处理后的
叶绿体蛋白质 2-DE 图谱
Fig. 1 2-DE maps of chloroplast proteins in Chinese cabbage
seedlings treated with PS inhibiting herbicide AtrazineⅡ
A: 对照; B: 0.1 mg L−1阿特拉津处理; C: 10 mg L−1阿特拉津处理。
A: control; B: 0.1 mg L−1 Atrazine treatment; C: 10 mg L−1 Atrazine
treatment.

2.3 与阿特拉津处理相关蛋白的 MS鉴定
对 1 4 个有质的变化的蛋白质斑点进行了
MALDI-TOF MS分析, 其中 7个(斑点 3、4、7、9、
11、12、14)由于其含量少而未能鉴定, 7个(斑点 1、
2、5、6、8、10、13)被鉴定出其归属(表 3)。图 2
是以斑点 10作为例子的一张 MS分析结果图。这 7
个被鉴定的叶绿体蛋白质斑点中, 斑点 1 为糖基转
移酶Ⅰ, 主要参与基本的糖代谢; 斑点 2 为异戊二
第 2期 李雪梅: PSⅡ抑制型除草剂 Atrazine诱导白菜幼苗叶绿体蛋白质组的变化 241


表 3 与阿特拉津处理相关叶绿体蛋白质的 MS 鉴定
Table 3 MS identification of chloroplast proteins related to Atrazine treatment
斑点号
No. of spot
登录号
No. of accession
分子量
MW
等电点
pI
蛋白质名称
Protein
肽段匹配数
Peptides matched
蛋白质分值
Protein score
可能功能
Possible function
1 gi|46447735 55 6.6 Glycosyl transferase, groupⅠ
family protein
9 50.6 Sugar metabolism
2 gi|35187004 50 6.5 Isoprene synthase 13 76.1 Isoprene biosynthesis
5 gi|38637530 70 7.6 Hypothetical protein 6 58.5 Unknown
6 gi|2695972 73 7.3 Probable praline dehydrogenase 8 52.2 Proline metabolism
8 gi|49611806 38 5.0 Putative 6-phosphofructokinaseisozyme II 8 47.5 Sugar metabolism
10 gi|3777495 25 6.2 Calcium transporting ATPase 13 58.3 Ca2+ transport
13 gi|31788862 12 5.7 Maturase K 8 49.1 Intron splicing

图 2 斑点 10 的 MS 分析结果
Fig. 2 MS analysis results of spot 10

烯合成酶 , 参与异戊二烯的生物合成。幼苗经 10
mg L−1阿特拉津处理后, 这 2种酶消失, 该现象初次
被报道。以 0.01、0.1和 1 mg L−1浓度处理的幼苗中,
这 2个酶仍然存在。
有 5个叶绿体蛋白质斑点是经 0.1 mg L−1阿特
拉津处理后新诱导产生的, 其中, 斑点 5 是一种被
推测的蛋白质, 其功能目前还不清楚, 斑点 6 与脯
氨酸脱氢酶 (Pro-dh)相匹配 , 这种酶负责将脯氨酸
变成谷氨酸的第一步反应, 斑点 8 为 6-果糖磷酸激
酶同工酶Ⅱ(6-PFK IsozymeⅡ), 此酶参与糖代谢。
斑点 10为钙转运ATPase(Ca2+-ATPase), 该酶对于钙
的转运是必需的。与斑点 13相匹配的是尿素酶, 这
种酶参与内含子的剪切。
3 讨论
白菜是一种对阿特拉津敏感的作物。 许多研究
表明, 在阿特拉津敏感的作物中, 阿特拉津的作用
机理主要是阻断植物光合作用过程中的 Hill 反
应[21-26], 常常导致叶绿素破坏、叶子变黄、生长受
抑和死亡[6]。本研究利用不同浓度的 PSⅡ抑制性除
草剂阿特拉津处理白菜幼苗, 使其叶绿素含量和可
溶性蛋白质含量明显变化。糖基转移酶Ⅰ和异戊二
烯合成酶消失, 脯氨酸脱氢酶、6-果糖磷酸激酶同工
酶Ⅱ、钙转运 ATPase、尿素酶和一种被推测的蛋白
质被诱导产生。另有 4种蛋白质出现上调现象, 5种
蛋白质出现下调现象。虽然我们还不能理解这些变
242 作 物 学 报 第 34卷

化的蛋白质与除草剂的作用机理, 但可以认为, 在
被处理的幼苗中, 其基本的代谢受到干扰, 植物在
维持体内平衡中, 增强对逆境的抗性, 诱导出一些
新的酶或蛋白质。本研究所报道的仅是白菜叶绿体
蛋白质组研究的部分工作, 但也可以帮助我们进一
步了解阿特拉津的作用机理。
4 结论
在经阿特拉津处理的白菜幼苗中, 有 23个蛋白
质斑点产生明显变化, 10 个蛋白质斑点仅在受处理
的幼苗中存在, 它们是经阿特拉津诱导后新合成的,
有 4个蛋白质斑点消失。利用MALDI-TOF MS技术,
对 14个蛋白质的归属进行了分析, 其中 7个蛋白质
的归属得到鉴别, 它们是糖基转移酶Ⅰ、异戊二烯
合成酶、脯氨酸脱氢酶、6-果糖磷酸激酶同工酶Ⅱ、
钙转运 ATPase、尿素酶和一种被推测的蛋白质。该
项研究表明, 在经阿特拉津处理的植物中, 有叶绿
体蛋白质的合成和降解发生。
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