全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(9): 1561−1569 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08010-002)和重庆市自然科学基金(CSTC2009BA1088)项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 杨建平, E-mail: yangjianping@caas.net.cn, Tel: 010-82105859
第一作者联系方式: E-mail: yulinxi_1001@126.com, Tel: 010-82105851
Received(收稿日期): 2012-03-06; Accepted(接受日期): 2012-04-20; Published online(网络出版日期): 2012-07-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120703.0858.201209.0_001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01561
拟南芥 RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评
价
习雨琳 1,2 周 朋 1 宋梅芳 1 李志勇 1,3 孟凡华 1 杨建平 1,4,*
1 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 2 中国农业科学院研究生院, 北京 100081; 3 河南农业大学农学院, 河南郑州
450002; 4 重庆邮电大学生物信息学院, 重庆 400065
摘 要: RBCS编码光合碳同化关键酶核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基, 是控制植物光合作用的重要基因之
一。本研究利用实时荧光定量 PCR技术分析了拟南芥 RBCS-1A受光调节的表达模式, 结果表明, AtRBCS-1A表达受
到光的诱导, 同时具有组织表达特异性; 运用生物信息学手段分析发现, 该基因启动子序列中存在多个参与光应答
的顺式作用元件; 采用 PCR技术从拟南芥基因组中分离到长度为 1 691 bp的 AtRBCS-1A启动子片段 , 将该片段与
GUS 报告基因融合构建植物表达载体并转化野生型拟南芥 , 对获得的转基因植株进行 GUS 染色 , 结果显示 ,
AtRBCS-1A启动子是光诱导型和组织特异型启动子。以上结果初步证明, AtRBCS-1A启动子应用于植物遗传转化切实
可行, 具有重要应用价值。
关键词: 拟南芥; RBCS-1A基因; 表达模式; 光诱导表达; 顺式作用元件
Expression Patterns of Arabidopsis RBCS-1A Gene in Response to Light Treat-
ments and Application Evaluation of Its Promoter in Transgenic Engineering
XI Yu-Lin1,2, ZHOU Peng1, SONG Mei-Fang1, LI Zhi-Yong1,3, MENG Fan-Hua1, and YANG Jian-Ping1,4,*
1 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 Graduate School of Chinese Academy of Agricul-
tural Sciences, Beijing 100081, China; 3 Agronomy College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 4 College of Bio-information,
Chongqing University of Posts and Tele-communication, Chongqing 400065, China
Abstract: RBCS gene encodes the small subunit of Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco), which catalyzes
the rate-limiting step of CO2 fixation in photosynthesis. In this study, we analyzed the transcription patterns of Arabidopsis
RBCS-1A in response to light treatments using real-time quantitative PCR assays. The results indicated that the transcription
abundance of AtRBCS-1A was induced by light, and had the tissue-specific feature. In silico analysis revealed that the promoter
region of AtRBCS-1A keeps many cis-acting elements for light regulation. Based on the information, we isolated a genomic frag-
ment with 1 691 nucleotides upstream of the translation start codon of AtRBCS-1Aand constructed a binary vector with
AtRBCS-1A promoter fused with GUS (encoding β-glucuronidase) reporter gene, then generated Arabidopsis transgenicplants.
Histochemical analysis of the transgenic lines suggested that AtRBCS-1A promoter was a light-induced and tissue-specific pro-
moter. All the analyses preliminarily prove that AtRBCS-1A promoter has important application value in plant transgenic engi-
neering.
Keywords: Arabidopsis; RBCS-1A gene; Expression pattern; Light-induced expression; cis-acting elements
启动子是位于基因 5′端上游的一段特殊的DNA
序列, 包含着基因表达最核心的调控信息, 决定了
基因的转录起始、转录效率及转录时空特异性。植
物启动子按其转录方式可分为组成型、组织特异型
和诱导型, 但因植物种类、发育阶段及处理条件差
异, 表现也不具有绝对性[1]。目前, 组成型启动子广
泛应用于植物的遗传转化, 如花椰菜花叶病毒(cauli-
flower mosaic virus, CaMV) 35S启动子[2-3]、玉米泛
1562 作 物 学 报 第 38卷

素(Ubiquitin)启动子[4-5]和水稻肌动蛋白(Actin)启动
子[6-7], 它们均具有强度大、效率高、持续期长和对
外源基因无特异启动等显著特点。然而, 外源基因
的组成型表达也存在许多负面效应, 例如高强度持
续合成外源基因产物会增加植物的代谢负担, 并且
组成型启动子的高效表达往往以大量的营养消耗为
代价, 从而直接干扰到植株的生长发育, 导致生长
延滞、植株矮小、产量降低等[8-11]。另外, 组成型启
动子也可能诱发基因沉默[12], 可能限制转基因的应
用范围。随着人们对转基因植物要求的多样化, 特
别是对转基因食品安全性的关注, 使得组成型启动
子越来越不能完全满足人们的要求[13-15]。与组成型
启动子相比, 诱导型启动子仅在某些物理或化学信
号的刺激下才能启动基因的表达, 并且该类型启动
子通常兼具组织表达特异性。它不仅能使目的基因
产物在一定时空积累, 使得目的基因的可控性及区
域表达量增加, 从而提高遗传转化的有效性, 同时
可以避免由组成型启动子的超量表达对植株发育引
起的负面效应, 在一定程度上应用于解决遗传转化
中的基因沉默和某些食品安全性问题。因此, 诱导
型启动子在植物遗传转化中有着广泛应用前景。
光是影响植物生长发育最重要的环境因素之一,
它不但是植物光合作用的能量来源, 而且还作为植
物感知环境变化的信号[16]。植物中受光调节表达的
基因非常多, 在转录水平上受光调节的基因至少有
100多个[16]。其中, RBCS是显著受光诱导表达的基
因之一, 并且其表达受到光受体的调节[17-19]。RBCS
编码核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的小
亚基, 控制 Rubisco的催化活性, 从而决定光合碳同
化的效率, 在植物光合作用中起重要作用[20-23]。已
有研究表明, RBCS基因的表达具有光诱导和组织表
达特异性[24-25], 其启动子的正向或负向顺式调控元
件对于调控外源基因的受光诱导和组织表达特异性
是必需的[26-30]。但是, 关于 AtRBCS-1A 启动子中光
应答顺式作用元件的比较全面的预测和分析以及
RBCS 启动子在植物遗传转化中的可行性论证还未
见报道。对 RBCS 启动子的功能进行进一步的研究
与鉴定, 将为 RBCS 启动子能否应用于植物遗传转
化提供理论依据。
在已有的植物 RBCS 研究基础上, 我们以模式
植物拟南芥为材料 , 通过实时荧光定量 PCR
(RT-qPCR)技术深入研究拟南芥 RBCS-1A (AtRBCS-
1A)受光调节的表达模式 ; 并对其启动子序列进行
生物信息学分析, 找出其中参与光应答的顺式作用
元件; 进一步克隆 AtRBCS-1A 启动子, 转化拟南芥
后, 初步分析论证该启动子在植物遗传转化应用中
的可行性。这对于 RBCS 启动子的理论和转基因应
用研究具有重要意义, 并为应用于农业生产奠定了
基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
拟南芥 Columbia生态型 Col-0, 农杆菌 GV3101
由本实验室保存, 大肠杆菌 Trans5α 感受态细胞购
自北京全式金生物技术有限公司。pMD18-T Vector
购自 TaKaRa公司, 植物表达载体 pCAMBIA1301由
本实验室保存。各种限制性内切酶和修饰酶购自
New England Biolabs公司、TaKaRa公司和全式金公
司。TRIzol 试剂购自 Invitrogen 公司, X-Gluc 购自
Gold Biotechnology公司, 其他试剂均为进口或国产
分析纯。反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA
Synthesis Kit)购自 Fermentas 公司 , 质粒提取和
DNA 纯化回收试剂盒均购自北京博迈德科技发展
有限公司。引物由 Invitrogen公司合成, 测序由北京
奥科生物技术有限公司完成。
1.2 总 RNA的提取和 cDNA的合成
用 TRIzol 试剂提取拟南芥总 RNA, 经 RNase-
free DNase I在 37℃处理 30 min及无水乙醇沉淀和
75%乙醇清洗后, 加入 50 μL 的 RNase-free ddH2O,
用 UV-2550 型分光光度计(日本岛津)标定其含量。
采用反转录试剂盒, 以 1 μg总 RNA为模板、Oligo
(dT)18为引物逆转录合成 cDNA 第一链, –20℃保存
备用。
1.3 拟南芥 RBCS-1A表达的实时荧光定量 PCR
分析
以不同处理的拟南芥 cDNA第一链为模板, Ac-
tin基因为内参, 测定 AtRBCS-1A的相对表达量。根
据 AtRBCS-1A 与 Actin 的序列设计特异的实时荧光
定量 PCR引物(表 1), 按照全式金 Trans Start Green
qPCR SuperMix 试剂盒的说明书, 用 Light Cycler
480 II (Roche, 瑞士)仪器及 SYBR Green荧光染料
相对定量 PCR方法检测, 参照基因的 2–ΔΔCT法[31]计
算结果。经 3 次独立的生物学重复, 并以此计算其
标准差。
1.4 拟南芥 RBCS-1A启动子序列分析
参照 Plaza 数据库 (http://bioinformatics.psb.
第 9期 习雨琳等: 拟南芥 RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价 1563


ugent.be/plaza/)列出的拟南芥基因组序列 , 结合
AtRBCS-1A信息, 选取该基因起始密码子 ATG上游
约 1.7 kb 作为其转录调控序列, 并结合基因顺式作
用元件数据库 PLACE[32] (http://www.dna.affrc.go.jp/
PLACE/signalscan.html) 和 PlantCARE[33] (http://
bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)
分析 , 进一步解析其中包含的光应答顺式作用元
件。
1.5 启动子克隆和表达载体构建
采用 CTAB 法[34]提取野生型拟南芥 Col-0 幼苗
叶片基因组 DNA, 作为 PCR的模板。按照上述序列
设计 AtRBCS-1A启动子特异性引物(表 1), 进行 PCR
扩增, 所用 DNA聚合酶为 Ex Taq。将扩增产物连入
克隆载体 pMD18-T Vector, 并将鉴定正确的阳性克
隆菌送交测序。利用 DNAMAN 比对测序结果与拟
南芥基因组序列(图 2), 结果表明此克隆得到的启动
子序列没有发生突变。BamH I和 Nco I双酶切测序
正确的阳性克隆和载体 pCAMBIA1301, 分别得到
AtRBCS-1A启动子片段和载体片段, 以 T4连接酶连
接得到由 AtRBCS-1A启动子驱动 β-葡萄糖醛酸糖苷
酶(β-glucuronidase, GUS)基因表达的植物表达载体
pAtRBCS-1A:GUS。
1.6 拟南芥遗传转化
利用电击法[35-36]将重组质粒 pAtRBCS-1A:GUS
转入农杆菌 GV3101。挑取含有 pAtRBCS-1A:GUS
质粒的 GV3101单菌落, 接种于 5 mL含 50 mg L–1
卡那霉素 (kanamycin, Kan)、40 mg L–1 庆大霉素
(gentamycin, Gen)和 50 mg L–1利福平(rifampicin, Rif)
的 LB液体培养基中, 在 28℃, 250转 min–1摇床中
培养 36 h。将培养好的菌液按 1∶300转接至 200 mL
LB (Kan 50 mg L–1, Gen 40 mg L–1, Rif 50 mg L–1)液
体培养基中, 在 28℃, 250转 min–1摇床中培养约 15
h, 至 OD600=2.0。离心收集菌体, 弃上清液, 将菌体
重悬于渗透转化液(1/2 MS, 5%蔗糖, 0.01% Silwet
77)中, 稀释至 OD600=1.0, 采用浸花法[37]转化野生
型拟南芥 Col-0。收获 T0代种子, 在含有 25 mg L–1
潮霉素(hygromycin, Hyg)的 MS 培养基上筛选, 获
得抗性植株。
1.7 GUS组织化学染色
按照 Jefferson[38]的方法进行 GUS染色。将不同
处理的材料浸泡在预先配制好的 GUS染液里, 真空
抽滤后 37℃保温、染色过夜, 再用 75%乙醇脱色, 直
至底色完全消失。于体视显微镜(OLYMPUS SZX7)
下观察染色结果, 照相并记录。

表 1 用于 RT-qPCR和 AtRBCS-1A启动子克隆的引物
Table 1 Primers used for RT-qPCR and AtRBCS-1A promoter cloning
用途
Purpose
基因
Gene
引物
Primer
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
退火温度
Annealing tem-
perature (℃)
扩增片段长度
Fragment size
(bp)
Atrq-F CATCACAAGCAACGGCGGAAG 55 RBCS-1A
Atrq-R CGGAATCGGTAAGGTCAGGAAGG 57
104
ACT2-F TCTTGACCTTGCTGGACG 49
实时荧光定量 PCR
Real-time qPCR
Actin
ACT2-R CAAACGAGGGCTGGAACA 49
269
Atrp-F 1) CGCGGATCCTCCGTGGTCGAGATTGTGTA 63 启动子克隆
Promoter cloning
RBCS-1A
Atrp-R 2) CATGCCATGGTCTTTGTGTGACTGAGGTTTGG 62
1961
1) 引物 Atrp-F在 5′端插入 BamH I位点; 2) 引物 Atrp-R在 5′端插入 Nco I位点。
1) BamH I site is introduced at 5′ terminal of primer Atrp-F; 2) Nco I site is introduced at 5′ terminal of primer Atrp-R.

2 结果与分析
2.1 拟南芥 RBCS-1A 在不同光照条件下的表达
模式分析
对野生型拟南芥 Col-0 幼苗进行持续光照和持
续黑暗、光转换、长日照及不同光照强度处理, 检
测成苗中 AtRBCS-1A的光及组织表达特异性。收集
不同条件处理的材料 , 分别提取其总 RNA, 用
RT-qPCR分析不同处理中 AtRBCS-1A相对表达量的
变化。结果显示, 持续白光下生长 5 d的拟南芥幼苗
中 AtRBCS-1A 表达量显著高于持续黑暗下生长 5 d
的表达量, 前者约是后者的 8 倍(图 1-A), 这暗示光
可以调控 AtRBCS-1A表达。将黑暗中生长的幼苗转
到光下后, AtRBCS-1A表达量迅速且持续增加。光照
1564 作 物 学 报 第 38卷

2 h后, AtRBCS-1A的表达量已大约增长为黑暗中的
2倍, 当光照 24 h后, 其表达量则大约增长为黑暗
中表达量的 35倍(图 1-B)。而光下生长幼苗转到黑
暗条件后, 其 AtRBCS-1A表达量迅速下降, 黑暗处
理 2 h后, 其表达量已经大约降低为光照条件下的
0.38。在黑暗处理 4 h和 12 h后, AtRBCS-1A的表
达量略有上升 , 但是在白光转黑暗整个过程中
AtRBCS-1A表达量整体呈下降趋势, 至黑暗处理 24
h 后 , 其表达量则大约降低为光照条件下的 0.12
(图 1-C)。以上结果说明, 光促进 AtRBCS-1A 转录,
而黑暗抑制其转录 , 并且对光照条件变换反应敏
感。
长日照条件下, 光照后 AtRBCS-1A 表达量迅速
上升, 而转为黑暗后表达量则迅速下降, 在 24 h中,
白天 AtRBCS-1A 表达量总体高于黑夜的表达量(图
1-D)。自然光条件下光照强度经常变化, 所以进一步
检测了不同光照强度[39]下 AtRBCS-1A 的表达量变
化。结果表明, 在所选定的光照强度范围内, AtRBCS-
1A表达量随光照强度增加而显著上升(图 1-E)。此
外 , AtRBCS-1A 表达还具有组织表达特异性。
AtRBCS-1A 在拟南芥地上部分的表达量显著高于地
下部分的表达量, 并且长日照条件下, 地上部分各
器官 AtRBCS-1A在光照中的表达量也显著高于在黑
暗中的表达量(图 1-F)。上述研究结果表明, AtRBCS-
1A 受光诱导高表达, 能随植物的生理节奏变化; 且
具组织表达特异性。

图 1 用实时荧光定量 PCR分析 AtRBCS-1A基因在不同光照条件下相对表达量
Fig. 1 Relative expression levels of AtRBCS-1A under different light conditions analyzed by RT-qPCR
A: 持续白光或黑暗条件下; B: 黑暗转白光条件下; WL: 白光, Dk: 黑暗; C: 白光转黑暗条件下; WL: 白光, Dk: 黑暗; D: 长日照(16
h白光/8 h黑暗)条件下 24 h内; E: 不同光照强度下; 弱光: 1.257 μmol m–2 s–1, 中度光强: 42.7 μmol m–2 s–1, 强光: 1235 μmol m–2 s–1; F:
不同器官中。Actin为内参对照。
A: under continuous white light or darkness; B: under the condition from darkness to white light; WL: under white light, Dk: under darkness;
C: under the condition from white light to darkness; WL: under white light, Dk: under darkness; D: under the condition of 16 h light and 8 h
darkness during 24 hours; E: under different light intensities; weak light: 1.257 μmol m–2 s–1, medium light: 42.7 μmol m–2 s–1, intense light:
1235 μmol m–2 s–1; F: in different organs of Arabidopsis. Actin was used as the control.

第 9期 习雨琳等: 拟南芥 RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价 1565


2.2 拟南芥 RBCS-1A 启动子片段的生物信息学
分析
通过 PLACE 和 PlantCARE 数据库对选取的启
动子片段序列分析预测。显示, AtRBCS-1A启动子片
段中含有 16类共 35个光应答的顺式作用元件(图 2),
这些元件对 AtRBCS-1A的表达可能起重要作用。其
中, GT1-motif、I-box和 G-box是常见的受光调节启
动子中的顺式作用元件[40]。根据前人的结果和以上
分析, 我们推测 AtRBCS-1A 启动子可以启动外源基
因受光诱导表达。


G-Box: CACGTG15, 28, 29, CTTCCACGTGGCA24, CACGTGG30 GT1-motif: GGTTAA10, GGTTAAT34
I-box: GATAGGG12, GATAAGATT23, GATAAGGGT32 ACE: TCCACGT27
Box I: TTTGAAA1, 7, 16, TTTCAAA2, 8, 17 rbcS-CMA7a: GTCGATAAGG31
RBCSCONSENSUS: AATCCAA4, 18, 35 GATA-motif: GATAGGG11, AAGATAAGATT21
Gap-box: CAAATGAA(A/G)A6 ATCT-motif: AATCTAATCT3, CGATAAGATT22
TCT-motif: TCTTAC5 Box II: TCCACGTGGC25, CCACGTGGC26
SORLIP1: GCCAC33 SORLIP2: GGCCC13, 19
GA-motif: AAGGAAGA14, ATAGATAA20 MRE: AACCTAA9

图 2 拟南芥 RBCS-1A启动子序列分析
Fig. 2 Sequence analysis of Arabidopsis RBCS-1A promoter

2.3 拟南芥 RBCS-1A启动子的植物表达载体构建
首先将报告基因GUS融合到AtRBCS-1A启动子
下游, 再将 AtRBCS-1A 启动子插入到 pCAMBIA-
1301 的相应位置, 对培养出的单菌落提质粒后进行
PCR和 BamH I和 Nco I双酶切鉴定, 以 pCAMBIA-
1301 质粒作为对照。结果表明, 经 PCR 或酶切的
pAtRBCS-1A:GUS质粒均能够获得约 1 700 bp的目
的片段, 而 pCAMBIA1301 质粒则不能(图 3), 证明
AtRBCS-1A 启动子已正确插入 pCAMBIA1301 中,
替换了原来的 CaMV35S启动子, AtRBCS-1A启动子
和 GUS 基因融合的表达载体 pAtRBCS-1A:GUS 构
建成功(图 4)。
1566 作 物 学 报 第 38卷


图 3 植物表达载体 pAtRBCS-1A:GUS的检测
Fig. 3 Detection of plant expression vector pAtRBCS-1A:GUS
M: trans5K DNA marker; 1: 以 pCAMBIA1301质粒为模板扩增
AtRBCS-1A; 2: 以 pAtRBCS-1A:GUS质粒为模板扩增
AtRBCS-1A; 3: BamH I和 Nco I双酶切 pCAMBIA1301质粒;
4: BamH I和 Nco I双酶切 pAtRBCS-1A:GUS质粒。
M: trans5K DNA marker; 1: amplicon of AtRBCS-1A promoter
from pCAMBIA1301 plasmid; 2: amplicon of AtRBCS-1A promoter
from pAtRBCS-1A:GUS plasmid; 3: BamH I and Nco I digestion of
pCAMBIA1301 plasmid; 4: BamH I and Nco I digestion of
pAtRBCS-1A:GUS plasmid.

2.4 转基因植株的获得及 GUS组织化学染色
携带表达载体 pAtRBCS-1A:GUS 的农杆菌
GV3101采用浸花法侵染野生型拟南芥 Col-0, 得到 T0
代种子。用 25 mg L–1 Hyg筛选 T0代种子, 共筛选出
48 个 T1代转基因株系, 对其后代抗性植株的 PCR 检
测和 GUS染色显示, 所得转基因株系中 29个为阳性;
选取3个GUS染色有代表性的株系进行持续抗性筛选,
至得到 T4代转基因纯合株系。对转基因植株的幼苗和
成株进行不同光照条件处理, 以野生型拟南芥 Col-0
为对照, 观察不同处理转基因植株的 GUS 染色情况,
以确定启动子表达特性。
结果显示, 在黑暗与白光中生长 4 d 的转基因
拟南芥幼苗中均能观察到显示 GUS活性的蓝色, 并
且与持续黑暗生长 4 d 的转基因拟南芥幼苗子叶中
的蓝色相比, 持续白光生长 4 d的颜色更深, 甚至其
下胚轴中也能观察到较深的蓝色(图 5-A~B)。以持
续黑暗生长 4 d 的拟南芥幼苗为对照, 持续黑暗生
长 3 d的拟南芥幼苗转至光照条件下 1 d后, 转基因
幼苗子叶中的蓝色加深不明显, 但是其下胚轴显著
变蓝(图 5-A); 而以持续白光生长 4 d的拟南芥幼苗
为对照, 持续白光生长 3 d 的拟南芥幼苗转至黑暗
条件下 1 d 后, 转基因幼苗子叶中的蓝色显著变浅
(图 5-B)。进一步观察长日照条件下生长的成苗期转
基因拟南芥各组织器官的 GUS染色情况表明, 在黑
暗和白光中, 根系组织都没有观察到显示 GUS活性
的蓝色; 而地上部分的绿色组织, 包括茎、叶、花和
果荚均有蓝色显示(图 5-C)。另外, 白光中绿色组织
染色所显示的蓝色明显深于黑暗条件下的染色结果,
尤其以叶中表现的突出(图 5-C)。以上的结果说明虽
然 GUS 在黑暗中也有表达, 但光诱导能增强 GUS
表达; 并且从组织特异性看, GUS 在拟南芥地上部
分绿色组织中特异性表达。

图 4 植物表达载体 pAtRBCS-1A:GUS的构建图谱
Fig. 4 Construction map of plant expression vector pAtRBCS-1A:GUS

综上所述, 在转基因拟南芥中 AtRBCS-1A 启动
子能够驱动外源基因受光诱导表达, 并且能够较强
地驱动外源基因在植物绿色组织中表达, 这与利用
野生型拟南芥 Col-0进行的 RT-qPCR分析结果基本
一致。
3 讨论
基因的转录调控非常复杂, 涉及到转录因子与
启动子中顺式作用元件的相互作用[41], 因而启动子
的活性在很大程度上影响基因的表达情况。获得一
个受环境诱导、强度适宜并具组织特异性的启动子,
是植物基因工程育种应用于农业生产实践的关键。
AtRBCS-1A 启动子具有光诱导表达特性和组织
表达特异性。本研究发现 AtRBCS-1A的表达除受光
诱导和受黑暗抑制之外, 还与光强相关, 在光强由
弱至强的变化过程中, AtRBCS-1A表达量持续上升。
过去的研究表明, 在很大范围内, 光强是影响植物
光合作用的主要限制因子, 光合速率随光强的增加
而呈正比例迅速上升[42]。因此, AtRBCS-1A转录随光
合速率发生变化, 暗示该启动子在应用时能更好地
利用植物体内自身存在的调节机制控制外源基因适
时、适度表达, 使外源基因表达与植物生长状态协调
第 9期 习雨琳等: 拟南芥 RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价 1567



图 5 转基因拟南芥的 GUS组织化学染色
Fig. 5 Histochemical GUS assay of transgenic Arabidopsis
A: 黑暗转白光; B: 白光转黑暗; C: 转基因拟南芥成苗各组织
器官; WL: 白光, Dk: 黑暗; 标尺: 1 mm。
A: shift from darkness to white light; B: shift from white light to
dark; C: in different organs at mature stage of transgenic Arabidop-
sis; WL: white light, Dk: darkness; Bar: 1 mm.

统一。多数植物的光饱和点为 500~1 000 μmol m–2 s–1,
当光强达到光饱和点时, 光合速率不再增加[42]。对于
光强值达到拟南芥生长的光饱和点及光饱和点以上
时 AtRBCS-1A表达量的变化情况将在后续实验中进
一步研究。组织特异性启动子所调控的下游基因往
往只在某些特定的器官或组织部位表达, 并表现出
发育调节的特点。通过对其具体作用机制的深入研
究 , 可以根据需要选择或人工构建合适的启动子 ,
实现对外源基因表达的定时、定点、定量三维精确
调控[43]。本实验表明 AtRBCS-1A启动子具有较强的
驱动下游基因在植物地上部分绿色组织中特异表达
的特点。根据这一特点, 可将它用于提高植物的抗
病性和抗虫性, 并且通过开发生物反应器, 还可用
于生物制药等等, 这又为植物遗传转化提供了一个
可参考使用的启动子。
一般来讲, 转录调节因子通过与启动子中的正
负调控元件相互作用来调控基因的转录, 基因的表
达特性是这些元件综合调控的结果[44]。本研究发现
AtRBCS-1A 启动子片段中含有多个光应答元件(图 2),
但其具体的作用区段 , 关键调控顺式作用元件等 ,
还需进一步实验验证。植物能通过感知多种环境信
号(如光、温度、水分等)来调节其自身正常的生长
发育, 种子萌发和开花诱导等, 各种信号转导途径
呈网络状存在于植物体中[45], 因此一个基因的表达
可能响应于多个因素。我们发现 AtRBCS-1A启动子
序列中除了光应答顺式作用元件外, 还含有多个与
生物和非生物胁迫相关的元件, 如 ERE、CGTCA-
motif、ABRE、HSE、MYBCORE和MYCCONSENSUS
等。近些年来, 一些研究也表明高等植物 RBCS 基因
启动子不仅响应光应答反应, 而且对于糖[46]、ABA[46]、
干旱[47-48]、低温[49]和盐[50]也均表现出应答反应。因此,
对AtRBCS-1A启动子顺式作用元件的深入研究对了解
其具体作用, 解析其转录调控的分子机制, 具有重要
理论和实践意义。
4 结论
AtRBCS-1A 启动子是光诱导型启动子, 其活性
随植物生理节奏的变化而变化; 该启动子具有组织
表达特异性, 在植物绿色组织中特异表达。这些特
点一方面有利于外源基因在植物体内适量表达, 避
免外源基因在夜晚仍持续大量表达而增加植物代谢
负担 ; 另一方面也有助于转基因植株的健康生长 ,
更好体现外源基因的作用效果。本研究认为, 该启
动子应用于植物遗传转化具有可行性, 其潜在价值
值得进一步探讨。
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