全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(9): 1540−1550 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2007CB109006)和河南省基础与前沿计划项目(102300410127)资助。
第一作者联系方式: E-mail: liyouyong@163.com, Tel: 13803808607 ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2011-01-24; Accepted(接受日期): 2011-04-27; Published online(网络出版日期): 2011-06-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110628.1008.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01540
小麦 BNS雄性不育系及其转换系花药差异蛋白鉴定与分析
李友勇 茹振钢** 苏 晴 付庆云
河南科技学院 / 河南省高等学校作物分子育种重点学科开放实验室, 河南新乡 453003
摘 要: BNS是一个新发现的温敏核型小麦雄性不育系, 它有良好的不育性和转换性, 被认为在小麦杂种优势利用
上有重要价值。为探讨 BNS的不育机制, 以不育系及其转换系的单核早期、单核晚期到二核期花药为材料, 用 2-DE
和 MALDI-TOF-MS方法分离鉴定 2个系的差异蛋白。结果发现, 在转换系中, ATP合酶 α和 β亚基、胞质苹果酸脱
氢酶、线粒体醛脱氢酶亚基、Rubisco亚基等呼吸、光合能量代谢蛋白表达丰富, 但在不育系中这些蛋白缺失或下调。
在不育系中还分离出山梨醇脱氢酶、组蛋白 H2B.2、Harpin诱导子 1、延伸因子 TU等非小麦正常代谢蛋白。根据这
些差异蛋白的功能, 推测 ATP 合酶 α、β 亚基蛋白最可能是 BNS 不育的源头蛋白, 它的表达可能受其上游的温度感
应子调控。BNS的温度感应子隐性突变后转录启动温度阈值上调, 在较低温下, α、β亚基基因不表达或表达量小, 导
致ATP合酶数量减少, 继而影响ATP合成。ATP数量减少, 使小孢子ATP供应短缺, 进一步影响到小孢子的发育, 使
代谢异常, 花粉败育。
关键词: BNS小麦雄性不育; 花药差异蛋白; 双向凝胶电泳; MALDI-TOF-MS; ATP合酶
Identification and Analysis of Differentially Expressed Proteins of BNS Male
Sterile Line and Its Conversion Line of Wheat
LI You-Yong, RU Zhen-Gang**, SU Qing, and FU Qing-Yun
Henan Institute of Science and Technology / Key Discipline Open Laboratory on Crop Molecular Breeding of Henan Institute, Xinxiang 453003,
China
Abstract: BNS is a new type of thermo-sensitive nuclear male-sterile lines in wheat (Triticum aestivum L.). The mechanism of its
sterility was studied using two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF-MS methods. Anthers of the sterile line (SL) and
the conversion line (CL, fertile pollen rate higher than 50%) were obtained from plants with a series seeding dates, and two set of
samples were used to compare the differentially expressed proteins which was extracted from the anthers at early stage of
uninucleate and from late stage of uninucleate to binucleate stage of pollen development. The abundant expressions of proteins
involved in respiratory and photosynthetic energy metabolism were identified in the CL, such as ATP synthase α and β subunit,
NAD (P) Rossmann fold binding protein, cytoplasmic malate dehydrogenase, mitochondrial aldehyde dehydrogenase subunit, and
Rubisco subunit protein. However, they were absent or down-regulated in the SL. Besides, a few abnormal proteins were detected
in the SL, including sorbitol dehydrogenase, maturase K, histone H2B.2, Harpin-induced 1, and elongation factor TU. According
to the functions of these differentially expressed proteins, we inferred that ATP synthase α and β subunits were most likely the
source protein for the sterility of BNS. Their expressions are regulated by a temperature sensor that is located at upstream of the
subunit gene operon in BNS. Mutation of the temperature sensor is determined by the temperature higher than a threshold, which
may startup the transcriptions of α and β subunit genes. When the temperature is lower than the threshold, the expressions of α and
β subunits are in very low levels, which affect the assembly of ATP synthase, and result in deficiency of ATP supply for the growth
of microspore. This effect can be amplified in downstream physiological functions, such as development of respiratory and
photosynthetic enzymes, which finally causes abnormal metabolism and pollen sterility.
Keywords: Wheat BNS male-sterility; Anther differentially expressed proteins; Two-dimensional gel electrophoresis; MALDI-
TOF-MS; ATP synthase
第 9期 李友勇等: 小麦 BNS雄性不育系及其转换系花药差异蛋白鉴定与分析 1541


自 1979年 Sasakuma等[1]最早在 D2型细胞质雄
性不育中发现小麦光敏雄性不育以后, 世界各地相
继报道了一批质型、核型或质核互作型对光、温敏
感的小麦光温敏雄性不育(PTSMS)[2]。该不育类型的
发现, 意味着小麦杂种优势的利用在质—核互作模
式的基础上增添了一个新途径, 是杂交小麦研究的
一个重大进步。我国发现的小麦光温敏不育系, 如
ES[3]、C49S[4]、ZP 和 BS[5]、YS[6]、和最新发现的
BNS[7]等类型 , 已成为杂交小麦研究的重要试材 ,
部分甚或在生产中开始利用[4-6]。与此同时, 在近 10
余年的时间内 , 小麦光温敏雄性不育的遗传机制 ,
借鉴水稻光温敏雄性不育的研究经验, 在不育的发
生过程、生理机制、基因定位等方面也取得了重要
进展, 有力推动了小麦不育系的研究进程[5-10]。
BNS 普通冬小麦(Triticum astivum L.)不育系,
是茹振钢 1998年从品系 97A131在河南新乡种植的
自然群体中发现的 , 时年选出早期不育系 BNY。
2002 年, 在 BNY 的改良系中又获得了育性更好的
不育株, 命名 BNS (Bainong sterility, 百农不育系)。
经观察, BNS 的花粉发育对抽穗前温度敏感, 即当
减数分裂前(旗叶完全抽出)最低气温在 10℃以下时,
小孢子发育受阻, 花粉不育, 称不育系(sterile line,
SL); 当该时期的最低气温高于 10 , ℃ 小孢子开始
转化 , 花粉育性逐渐恢复 , 部分小花能够结实; 当
最低气温高于 13℃时, 大部分花粉发育正常, 并正
常结实, 称转换系(conversion line, CL) [7-8]。由于该
不育系对温度敏感 , 不育性主要受隐性核基因控
制[8], 因此属温度敏感型核雄性不育。BNS 不育系
经多年培育和改良, 在我国的黄淮小麦主产地区表
现不育性好、转换容易、有特定恢复性的优良特性,
且抗低温能力强 , 早熟 , 丰产性好 , 是一个非常有
利用价值的可用于杂交小麦的不育系材料。因此 ,
研究 BNS的不育性及发生机制, 对深入认识小麦温
敏雄性不育的产生和形成, 以及安全利用该不育系
有重要意义。
BNS等光温敏雄性不育是一种遗传上比较特殊
的不育类型, 其不育基因的作用依赖于一定的光照
或 (和 )温度条件 , 同一基因型种子通过播期调节 ,
可发育成不育和可育 2 种个体, 这使它成为研究育
性相关基因和蛋白质组的理想材料。在本研究中 ,
利用蛋白质组学方法和质谱鉴定技术, 分离、鉴定
BNS 不育系及其转换系的差异蛋白, 并根据差异蛋
白线索进一步分析 BNS 不育的发生过程及不育基
因的可能作用方式。
1 材料与方法
1.1 材料种植及取样
不育系 BNS由本实验室培育和保存。每年在河
南新乡河南科技学院小麦实验田种植, 自 9月 23日
到 12月 2日, 每 8 d播一期, 共播 12期。取材的小
孢子发育时期为单核早期(四分体至核在小孢子中
央, 样品 1)和单核晚期至二核期(小孢子细胞核靠边
至二核期, 样品 2), 该时期是 BNS 花粉的败育发生
期[8]。
选用 10 月 17 日以前播种的 4 个播期材料取不
育系花药样品, 该时期的植株属完全不育类型, 植
株花粉败育率在 99%以上, 自交结实率为 0。取材时
植株外部形态是旗叶与倒二叶叶环之间 4~10 cm。
通过镜检, 样品 1 取四分体到小孢子游离后的单核
早期材料, 此期花药颜色浅淡黄色, 长度约 1.0~1.2
mm。样品 2取小孢子单核后期到二核期花药, 此时
小孢子出现液泡, 细胞核靠边, 个别花药达二核期,
此期花药长度约 1.4~2.0 mm, 颜色绿色。每天上午
7:00 左右取穗, 在 15℃以下室温环境, 于冰块上剥
取中上部小穗第一、二小花的 6枚花药, 10 min收取
一次, 液氮冷冻 1 min, −70℃冰箱保存备用。
从 11月 2日以后播种的材料中取转换的可育系
花药样品。小孢子发育时期与不育系对应, 实际花
药长度比不育系长 0.1~0.2 mm, 花药颜色绿色较
重。该时期 BNS的育性已经转换, 可育花粉上升到
50%以上, 套袋自交结实率达 30%~70%。由于小孢
子不同发育时期的形态指标和花药长度因主茎和分
蘖有差别, 所以每次取材都必须通过镜检保证小孢
子发育时期准确一致。
1.2 花药总蛋白样品制备
按 TCA(三氯乙酸 )法提取样品的花药蛋白
质[11]。取花药 2 g, 加约 10% PVPP (交联聚乙烯吡
咯烷酮), 液氮研磨 15 min, 白色粉末置于 50 mL离
心管中, 加入 10% TCA丙酮溶液 12 mL和 30 mmol
L−1 的 DTT (二硫苏糖醇) 12 mL, 轻摇混匀后在
−20℃冰箱静置 2 h。于 4℃下 20 000×g离心 30 min,
沉淀悬浮于 3倍体积的纯丙酮和 10 mmol L−1 DTT
中, 振荡打碎沉淀并混匀, −20℃冰箱放置 0.5 h后重
复该步骤 2 次 , 直到上清液无色。再于 4℃下
20 000×g离心 30 min, 弃上清液, 加入相当于沉淀
体积 3倍的 80%丙酮和 10 mmol L−1 DTT, 振荡打碎
1542 作 物 学 报 第 37卷

沉淀并混匀, −20℃放置 0.5 h后, 4℃下 20 000×g离
心 30 min, 弃上清液。沉淀在真空冷冻干燥机中抽
干丙酮, 用含有硫脲和NP40的蛋白裂解液溶解; 之
后依次加入 PMSF (苯甲基磺酰氟, 终浓度 1 mmol
L−1)、EDTA (终浓度 2 mmol L−1)、DTT (终浓度 20
mmol L−1); 超声处理 10 min, 4℃下 35 000×g离心 30
min, 将上清液真空干燥。将干燥的晶体蛋白 3.0 mg,
加 300 μL裂解液(含 8 mol L−1尿素, 4% CHAPS, 50
mmol L−1 DTT, 0.5% pharmalyte, pH 8.5), 振荡 10
min, 4 ℃ 20 000×g离心 15 min。取上清液分装, 每
管 70 μL, −80℃保存, 同时按 Richard[12]的方法进行
蛋白质定量, 备上样。
1.3 双向电泳及胶图分析
双向电泳参照谢锦云等[13]的方法。2组样品各 3
次重复。采用 GE Healthcare Ettan IPGphor 3 (美国)
等电聚焦电泳系统 , 按照操作说明进行第一向电
泳。水化液成分为 2.0 mg DTT和 700 μL水化液储
液(含 8 mol L−1尿素, 2 mol L−1硫脲, 4% CHAPS, 40
mmol L−1 Tris-base)。经预实验, 取最佳电泳条件,
上样量 150 μg, 18 cm Immobiline DryStrip gels, pH
4~7, 温度 20 , ℃ 总功率(总电压时间积) 44 110 V h,
时间为 19.5 h。第二向电泳按 Sheorana 等[9]的方法。
用 0.05 mol L−1 Tris-HCl (pH 8.8)、6 mol L−1尿素、
30%甘油和 2% (W/V) SDS平衡液平衡胶条后, 转移
到 13% SDS-PAGE凝胶上分离。电泳条件为, 温度
15 , ℃ 功率 1 W, 1 h后 10 W。常规 R-250染色。
将考染后的凝胶使用 UMAX PowerLook
2100XL扫描仪, 在 300 dpi的分辨率下扫描成 TIFF
格式的图像文件, 用 ImageMaster 2D Platinum5.0软
件分析差异蛋白点。
1.4 MALDI-TOF-MS分析
使用 UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF FLEX II
代质谱仪(德国 Bruker Daltonic Inc.)进行一级质谱
分析。按系统指南和 Richard[12]的方法预处理样品和
设置进样程序。质谱分析检测模式为正离子(positive
ion), 氮激光器波长 337 nm, 激光频率 50 Hz。反射
检测方式飞行管长 320 cm, 质谱累计扫描离子源 1
电压 25.00 kV, 离子源 2 电压 21.90 kV, 聚焦电压
9.50 kV, 反射电压 1 为 26.30 kV; 反射电压 2 为
13.90 kV, LIFT 1为 19.00 kV; LIFT 2为 2.70 kV。质
谱累计扫描 300~500次, 使用 Bruker Dalt onics flex
analysis TM 214软件分析处理扫描结果。
对获得的混合物肽片段数据(PMF)用 Mascot软
件在 NCBI上(http://www.matrixscience.com/)搜索真
核细胞的非冗余蛋白库 [NCBInr], 物种为 Green
Plant。搜库参数 Type of search 选择 Peptide Mass
Fingerprint, Enzyme 选择 Trypsin, Fixed modifica-
tions选择 Carbamidomethy l (C), Variable modifica-
tions 选择 Gln- > pyro-Glu (N-term Q)和 Oxidation
(M), Mass values选择 Monoisotopic, Protein Mass选
择 Unrestricted, Peptide Mass Tolerance 选择±200
μmol L−1, Peptide Charge State选择 1+, Max Missed
Cleavages选择 1, Number of queries为 38。
在样品 2 的一级质谱结果中选取 5 个有重要功
能的蛋白质点(点 38、147、184、205 和 245, 对应
的蛋白质是肌动蛋白、胞质苹果酸脱氢酶、线粒体
醛脱氢酶、类钙网蛋白和胞质苹果酸脱氢酶)进行二
级质谱分析, 质谱累计扫描为 800~1 000次, 其余方
法同一级质谱。
2 结果与分析
2.1 2-DE检测的差异蛋白数
样品 1 的不育系中检测到蛋白质点 223 个, 转
换系中检测到 284 个, 3 个胶图相互匹配率最低
81.18%; 样品 2 中检测到的蛋白质点分别为 193 个
和 241个, 3个胶图相互匹配率最低 77.78%。样品 1
和样品 2 检测出的 2 倍表达量以上的差异蛋白总数
分别是 31 个和 23 个(图 1 和图 2), 用于 PMF 分析
的点数分别是 26 个和 16 个, 获得的阳性蛋白点数
分别是 13个和 14个, 阳性率分别是 50%和 87.5%。
2.2 一级质谱鉴定结果
样品 1中得到 13个阳性蛋白, 根据其功能可分
为 4类, 分别是对温度敏感的 23.5 kD热激蛋白、参
与呼吸和能量代谢的功能蛋白(包括烯醇化酶、乙醇
脱氢酶 ADH1A 和线粒体醛脱氢酶 ALDH2)、与光
合作用有关的蛋白(包括叶绿体放氧增强蛋白 1 和
Rubisco 的亚基结合蛋白 α 亚基前体)以及其他功能
蛋白(包括有山梨醇脱氢酶、组蛋白 H2B.2、Harpin
诱导子 1、延伸因子 TU)和 2个未知蛋白。这些蛋白
中, 7个来源于转换系, 4个来源于不育系(表 1)。
样品 2中得到 14个差异蛋白, 根据其功能也分
为 4 类。第一类是 8 个参与呼吸和能量代谢的功能
蛋白, 其中 2个胞质苹果酸脱氢酶, 1个线粒体醛脱
氢酶小亚基 ALDH2, 1个 NAD(P) Rossmann折叠结
合蛋白, 1个 ATP1酶亚基, 1个 ATP酶 β亚基, 1个
腺嘌呤 α核苷水解酶超家族(AANH-like); 第二类是
第 9期 李友勇等: 小麦 BNS雄性不育系及其转换系花药差异蛋白鉴定与分析 1543



图 1 样品 1和样品 2差异蛋白的 2D胶图
Fig. 1 2-DE gel maps of differentially expressed proteins of Sample 1 and Sample 2
C-1: 样品 1的转换系; S-1: 样品 1的不育系; C-2: 样品 2的转换系; S-2: 样品 2的不育系。
C-1: conversion line of Sample 1; S-1: sterile line of Sample 1; C-2: conversion line of Sample 2; S-2: sterile line of Sample 2.

图 2 图 1中部分差异蛋白的放大图
Fig. 2 Enlarged maps of partial differentially expressed protein spots in Fig. 1
成对的图中, 箭头示差异蛋白点位置, 差异蛋白序号同表 1。
In paired maps, arrows show the differentially expressed protein spots, which numbers are the same as the spot numbers given in Table 1.
表 1 不育系(SL)和转换系(CL)差异蛋白信息
Table 1 Information of differentially expressed proteins between sterile line (SL) and conversion line (SL)
点序号
Spot
gi 序号
gi No.
同源蛋白名称
Protein name
分子量
Mw (Da)
等电点
pI
同源蛋白来源
Species
分值
Score
覆盖率
s.c. (%)
样品
Sample
样品 1 Sample 1
89 gi/186886556 23.5 kD heat-shock protein 23548 5.38 Triticum turgidum subsp. durum 72 27 CL 1)
183 gi/3172345 alcohol dehydrogenase ADH1A 28541 7.01 Hordeum vulgare 123 30 CL
237 gi/195619804 enolase 48390 5.59 Zea mays 150 39 CL
201 gi|15128580 mitochondrial aldehyde dehydrogenase ALDH2 59644 6.25 domesticated barley 95 27 CL 1)
246 gi|15128580 mitochondrial aldehyde dehydrogenase ALDH2 59644 6.25 domesticated barley 74 20 CL
15 gi/31193919 Rubisco subunit inding-protein alpha subunit precursor 61477 5.36 Oryza sativa japonica group 95 23 CL
122 gi/147945622 chloroplast oxygen-evolving enhancer protein 1 34722 6.08 Leymus chinensis 71 28 SL
129 gi/15242240 sorbitol dehydrogenase 40028 5.67 Arabidopsis thaliana 73 24 SL
31 gi/195606696 histone H2B.2 16156 10.05 Zea mays 71 47 CL 1)
35 gi/26189890 elongation factor TU, 29972 5.01 Caulerpa lanuginosa 73 28 CL 1)
187 gi/218200738 hypothetical protein OsI_28391 33801 9.31 Oryza sativa indica group 80 21 SL
18 gi/124360038 harpin-induced 1 20556 10.13 Medicago truncatula 74 38 SL
135 gi/116788868 unknown 73624 8.83 Picea sitchensis 71 22 CL 1)
样品 2 Sample 2
184 gi|15128580 mitochondrial aldehyde dehydrogenase ALDH2 59644 6.25 Hordeum vulgare 137 31 CL
136/147 gi|49343245 cytosolic malate dehydrogenase 35805 5.75 Triticum aestivum 85/141 37/61 CL
30 gi|37928995 cytosolic malate dehydrogenase 24560 6.60 Triticum aestivum 78 57 CL
15 gi|115475922 Rossmann-fold (+)-binding proteins 39277 8.81 Oryza sativa 110 30 CL
96 gi|238014256 AANH_like 16038 7.88 Zea mays 87 64 CL
188 gi|166165274 ATP 1 (ATP synthase subunit alpha, mitochondrial) 53979 6.01 Secale strictum 228 50 CL
245 gi|149384751 ATP synthase beta subunit 24248 5.52 Heterogonium pinnatum 82 57 CL
86 gi|11990897 Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit 19733 8.80 Triticum aestivum 187 70 CL 1)
179 gi|62176930 putative Rubisco small subunit 19323 8.59 Triticum turgidum subsp. durum 179 79 CL
94 gi|131394 oxygen-evolving enhancer protein 2 27424 8.84 Triticum aestivum 229 72 CL 1)
205 gi|56606827 calreticulin-like protein 47404 4.49 Triticum aestivum 78 29 CL 1)
38 gi|6103623 actin 41792 5.30 Caragana korshinskii 122 54 CL
142 gi|62870821 maturase K 28952 9.74 Spergula arvensis 72 40 CL
1) 表示 2倍量表达。1) Indicates twice expression.
第 9期 李友勇等: 小麦 BNS雄性不育系及其转换系花药差异蛋白鉴定与分析 1545


2个与光合作用有关的蛋白, 包括 1个 Rubisco的亚
基结合蛋白和 1 个叶绿体放氧增强蛋白 1; 第三类
是结构蛋白、类钙网蛋白和肌动蛋白, 该类蛋白在
单核早期没有出现; 第四类是其他功能蛋白, 即成
熟酶 K。该 14个蛋白全部来源于转换系, 其中 3个
是 2倍表达量蛋白(表 1)。
2.3 二级质谱鉴定结果
在样品 2中选取的 5个蛋白质点中, 4个点的蛋
白质信息与一级质谱鉴定结果相同, 说明一级质谱
鉴定结果可信。点 245的一级质谱鉴定结果是“胞质
苹果酸脱氢酶”, 但同时有较多的未知推定蛋白平
行结果 ; 二级质谱鉴定结果是“推定蛋白”(83分)
和“ATP 合酶 β 亚基”(82 分)。综合分析认为, 该
差异蛋白是 ATP合酶 β亚基。
3 讨论
3.1 差异蛋白与不育性的关系
3.1.1 植物雄性不育特有的光合类蛋白 在 2组
样品中都鉴定出 2类与光合作用有关的差异蛋白 ,
一类是叶绿体类囊体膜上的氧增强蛋白 1 (chloro-
plast oxygen-evolving enhancer protein 1), 另一类是
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)。但单核早期分离
得到的是叶绿体氧增强蛋白 1 和 Rubisco 的亚基结
合蛋白 α 亚基前体, 单核后期该 2 个酶的形式是叶
绿体氧增强蛋白 2和二磷酸核酮糖羧酶/氧化酶小亚
基。这 2个酶或仅在转换系中存在, 或在转换系中 2
倍量高表达。该结果一方面说明花药的光合机能是
在进入单核期后发育的, 检测的 2 个差异蛋白从前
体到亚基与发育时间顺序吻合; 另一方面揭示了植
物雄性不育与光合酶系的关系, 尤其是与 Rubisco
的诸亚基关系密切。该类蛋白的差异表达普遍存在
于植物雄性不育系和保持系或不育系和转换系之间,
在水稻[13]、萝卜[14]、小麦[15]、甘蓝[16]、番茄[9]等植
物雄性不育中都检测到 Rubisco 的功能缺陷。光合
作用是绿色植物的最基本功能, 正常细胞见光后会
很快产生光合功能, 酶系统建立。不育系的花药是
败育的器官, 敏感的 Rubisco 酶系统首先受到抑制,
因此在正常的转换系中可分离出该 2个敏感酶蛋白,
不育系中低表达或缺陷。
3.1.2 与呼吸和能量代谢有关的差异蛋白 本研
究中分离鉴定的与呼吸和能量代谢有关的差异蛋白
数量最多, 达 11 个, 占总差异蛋白的 40.7%。主要
有烯醇化酶、苹果酸脱氢酶、线粒体醛脱氢酶
ALDH2、乙醇脱氢酶 1A、ATP合成酶类等(表 1)。
烯醇化酶是糖酵解的关键酶之一, 催化 2-磷酸
甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸。烯醇化酶在盐
胁迫[17]、冷害[18]以及缺氧胁迫[19]下, 起初表达量上
升, 但后来消失。苹果酸脱氢酶是植物呼吸系统三
羧酸循环中的重要功能酶, 并以 NAD 作为电子受
体。张龙雨等 [20]在对黏类雄性不育小麦花药组织
cMDH 基因表达定量分析中发现, 不育株二核期和
三核期花药中 cMDH 基因的表达量急剧下降; 贾晋
和张鲁刚 [21]在大白菜花蕾败育过程中也分离到
cMDH 差异 mRNA, 基因表达量明显下降。梁承邺
等[22]在农垦 58光温敏不育系酶活性测定中发现不
育系的 MDH 比保持系低 10%以上; 张明永等[23]在
水稻中也发现不育系的二核期花药中 cMDH的活性
仅为保持系的 22%。我们在转换系中分离到烯醇化
酶和苹果酸脱氢酶 , 说明它们在不育系中功能缺
陷。
乙醇脱氢酶和线粒体醛脱氢酶是植物非正常呼
吸链的 2 个重要水解酶, 在植物缺氧、水分胁迫下
表达量显著升高, 但在正常植物个体中, 它们被认
为是催化有毒的醛类氧化 , 形成对应的无毒羧酸 ,
维持生物机体中醛类物质的微量平衡的重要酶系 ,
尤其是醛脱氢酶 [24]。Budar等[25]研究表明, 在配子
发育时期不但正常呼吸作用有关酶表达水平显著提
高, 同时乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶等酶在花粉中都
特异性表达。Op den Camp和 Kuhlemeier [26]、危文
亮等[16]在烟草和油菜花器官中发现 ALDH2 高丰度
表达, 且保持系远高于其不育系, 黄方等[27]克隆了
大豆醛脱氢酶基因 GmALDH3-1, 也是在生殖器官
中高水平表达。Cui 等[28]分离的玉米 T 型不育恢复
基因 Rf2a实际上就是玉米醛脱氢酶基因。这些研究
表明, 植物雄性不育与乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶关
系也十分密切。我们也从 2 个样品的转换系中分离
到较高表达量的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶, 说明在
不育系中缺乏该 2种酶类。
在单核中后期的转换系中, 质谱鉴定出 3个与
ATP合酶有关的差异蛋白, 分别是 ATP合酶 1 (ATP
synthase subunit alpha, mitochondrial), ATP合酶 β亚
基(ATP synthase beta subunit)和腺嘌呤 α核苷水解酶
超家族(AANH-like)。ATP合酶是高等植物细胞内最
大的酶系之一, 是 ATP 形成的组织者, 合成的 ATP
是代谢活动能量供应的主要载体形式。植物雄性不
育与能量供应关系密切, 这几乎是所有植物雄性不
1546 作 物 学 报 第 37卷

育发生机制研究的一致结论。Bergman 等[29]在烟草
质核互作雄性不育中发现 ATP 供应量减少; 王秀珍
等[30]也发现玉米和高粱保持系花药中ATP的含量均
高于不育系, 在高粱中甚至差异可达 7 倍; 邓继新
等[31]在水稻农垦 58 系列的不育系中发现长光照下
不育花药中的 ATP 含量仅为短光照花药的 1/7~1/4;
姚雅琴等[32]利用组织化学方法检测小麦雄性不育系
和其保持系花药 ATP 酶活性, 发现在小孢子母细胞
到单核花粉粒时期各种组织中的活性分布基本相同,
但二核期保持系花粉粒的营养细胞和生殖细胞的细
胞核和核仁中均有 ATP 酶活性, 而不育系花粉粒中
部分有, 部分没有; Singh 和 Brown[33]最早把油菜
CMS 的遗传控制靶向到线粒体 atp6 位点上; Wang
等[34]在油菜不育系 Shaan 2A 的基因组中也克隆了
orf224-1/atp6 基因, 并发现在不育系 Pol 中, orf224
与 atp6 共转录(cotranscribe); 向俊蓓等[35]也把油菜
CMS 基因定位在线粒体的 atp6 位点上; 王台等[36]
分析水稻农垦 58 光温敏雄性不育系隐性不育基因
是 ATP合酶 β亚基基因; 曹双河等[37]克隆了小麦光
温敏核雄性不育系农大 3338 的 ATP β 亚基 mRNA
部分序列, 与叶绿体 ATP β 基因序列同源性高达
96%; 韩艳芬等 [38]最新研究发现, 黏类小麦细胞质
雄性不育是线粒体 atp6基因不同编辑的结果。这些
研究结果一再表明, ATP 合酶与植物雄性不育有直
接关系。我们的试验结果也支持这一结论。在样品
2 中, 我们检测出 14 个差异蛋白, 其中 3 个是 ATP
酶亚基蛋白。
NAD＋(P) Rossmann折叠结合蛋白形成的 NAD
＋(P)辅酶在有氧呼吸、无氧呼吸和光呼吸中都是重
要的能量载体, 如是乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶质子
传递体和能量接受体。在 BNS不育系中检测不到这
些蛋白, 说明 BNS不育系中这些酶功能缺陷。我们
还推测, NAD＋(P) Rossmann折叠结合蛋白的异常影
响了乙醇脱氢酶和醛脱氢酶的功能, 加剧了有害产
物的积累, 从而加速小孢子凋亡和败育。
3.1.3 肌动蛋白 (actin)和类钙网蛋白 (calreticulin-
like protein) 肌动蛋白构成细胞骨架中的微丝系
统, 是动物细胞结构的关键成分, 但近些年又发现
在植物正常花粉中也含有丰富的肌动蛋白, 并且具
有调控和信号转导作用[39]。朱昀等[40]在小麦 T型不
育系的保持系中检测到肌动蛋白的高表达; Yan等[41]
将反义豌豆肌动蛋白基因与花粉特异启动子连接构
建“雄性不育基因”。钙网蛋白(calreticulin)是一种定
位在内质网中的钙结合蛋白, 有凝集素和分子钙结
合伴侣作用[42]。Imin 等[43]利用 2-DE 技术分离了水
稻叶鞘伤害反应后的差异蛋白, 在 19个表达量下调
蛋白中发现 2 个是钙网蛋白, 这 2 个蛋白在赤霉素
信号传递调节叶鞘伸长中有重要功能。这些研究说
明肌动蛋白和钙网蛋白与植物雄性不育有密切关
系。在本研究中, 这 2个蛋白仅在 BNS转换系中发
现, 而在不育系中表达缺陷。
3.1.4 对温度敏感的热激蛋白 热激蛋白在动物
中称热休克蛋白(heat shock proteins), 是生物体受
到高温、缺氧、饥饿、重金属离子胁迫时诱导合成
的一类应激蛋白。根据分子量大小, 植物热激蛋白
家族通常分为 HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和
小分子量的热激蛋白。植物以小分子量蛋白为主 ,
核基因编码, 多个 HSP 的表达常受一个转录因子控
制[44]。陈建南等[45]将高粱不育系经 43~45℃诱导, 不
育系转变为可育系并结出种子; 曾维英等[46]在大豆
不育系NJCMS2A花药中发现 22 kD热激蛋白, 保持
系中则没有。本试验中发现 23.5 kD 的热激蛋白在
不育花药中下调表达, 而在转换系上调表达, 这可
能是热激蛋白的另一种作用方式。热激蛋白对温度
敏感, 有“分子伴侣”功能, 参与受体蛋白质的折叠、
伸展、转运、解聚等, 在小孢子发育早期分离到该
蛋白, 说明热激蛋白参与了 BNS的不育过程。
3.1.5 其他功能蛋白 我们获得的差异蛋白中还
有几个特殊蛋白, 如单核早期样品中可在不育系中
表达的山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase, SDH)
和 Harpin-induced 1, 在转换系中上调表达的延伸因
子 TU、组蛋白 H2B.2 (Histone H2B.2)和未知蛋白,
以及单核后期样品中转换系表达的成熟酶 K
(maturase K)。
山梨醇脱氢酶降解山梨醇, 其代谢为蔷薇科木
本植物所特有, 在禾本科作物中少见。Harpin 是一
种能够诱导植物过敏性反应的激活蛋白, 也叫过敏
性激发子。延伸因子 TU 是蛋白质合成中的一个转
胺酰-tRNA 功能蛋白, 组蛋白 H2B是核小体的组成
成分。这些酶在植物雄性不育研究中虽有报道 [21],
但数量较少。本研究在不育系中检测出这些蛋白质,
正反映了 BNS 不育系在不育发生过程中的代谢紊
乱, 产生了较多非正常代谢的蛋白质。
3.2 不育的发生进程
比较 2 组样品的差异蛋白, 可看出 2 个不同发
育时期花药的蛋白差异能反映小孢子发育的阶段
第 9期 李友勇等: 小麦 BNS雄性不育系及其转换系花药差异蛋白鉴定与分析 1547


性。在可育系中, 前期有 23.5 kD 热激蛋白高表达,
而后期没有发现该蛋白; 前期有乙醇脱氢酶、烯醇
化酶和 ALDH2, 是呼吸链前端酶系 , 后期主要是
ALDH2 和胞质苹果酸脱氢酶, 是呼吸链末端酶系;
前期 Rubisco亚基结合蛋白是 α亚基前体, 后期是 α
亚基。这些结果说明小孢子呼吸和光合机能的建立
是在单核期以后发生的, 这些酶体系在转换系中发
育是完善的, 在不育系中由于小孢子的退化, 各主
要酶系表达量下调甚至消失, 检测到的差异蛋白多
数也是非正常酶类。
3.3 BNS不育的关键蛋白
植物的雄性不育发生过程是一个不育基因表达
后引发的连续遗传和代谢异常过程, 这个过程也常
认为是细胞程序性死亡[47]。对于 BNS, 这个过程从
四分体期开始, 二核期完成[7-8]。在这一生理过程中,
BNS 温度敏感基因是不育基因, 它影响其下游的关
键基因。关键基因在 BNS中没有改变, 因为温度升
高, 育性能够恢复, 应是关键基因的表达量或者功
能发生了变化, 并且它能影响到其他代谢因子活动,
通过逐级放大最终导致小孢子发育受阻而败育。我
们认为, BNS不育的关键蛋白最有可能是 ATP合酶
亚基蛋白。ATP 合酶是合成 ATP 的关键酶, ATP 合
酶的数量和活性直接影响 ATP 的产生数量, ATP 的
产生数量决定其供应数量, 供应数量直接影响小孢
子发育的代谢活动。ATP 合酶亚基在不育系中的缺
陷, 意味着 BNS中 ATP合酶数量不足, 导致 ATP供
应不足。许多研究都发现, 在不育系中普遍存在ATP
酶活性降低和 ATP 数量减少[30-38]。因此, ATP 的供
应数量与 BNS的不育性有紧密联系。
ATP 合酶, 不论是 F1-F0, 还是 CF1-CF0, 均有
8 种以上亚基[48], 任一种亚基的缺少或功能异常都
会影响 ATP 酶的装配和活性, 并且 F1-F0 在结合状
态才有合成功能[49], 因此, 亚基的正常转录和翻译
成为 ATP 合酶是否正常组装的前提。我们推测, 这
些 ATP合酶亚基操纵子上游有温度感应子, 在 BNS
中, 该温度感应子是隐性突变, 突变后对转录活化
温度感应的阈值提高了, 因此在较低的温度下, 感
应子不活化, 操纵子控制下的关键基因, ATP合酶亚
基基因表达量减少或不表达。当温度升高时, 感应
子活化性能提高, 亚基基因表达量提高。正是 ATP
合酶亚基的合成量引起 ATP 酶的数量改变, 其效应
逐级放大, 导致小孢子不育。
BNS 不育系的花粉不育率支持该推测。在对
BNS 花粉育性的观察中发现, BNS 不育系自交结实
率为 0, 花粉不育率为 97.57%~100%, 在结实率达
到 98%以上的转换系的花药内, 可育的花粉最高为
68.4%[7]。这说明 BNS不育系的花粉不育率, 是以一
种非绝对的基因效应形式表达的, 在“完全不育”
温度下, 不育系花药内还有少量小孢子能正常发育,
在“完全可育”温度下, 转换系的花粉也不能够全
部转为可育。这意味着温度调控了 BNS中关键酶的
数量, 但不是绝对控制。较低温度下不产生 ATP 亚
基 , 但可能有少量本底组成型合成 , 或外部输入 ,
使少量 ATP 酶正常装配, 结果可维持小孢子发育前
期能量供应和少量小孢子正常发育, 绝大多数小孢
子得不到充足能量供应而败育。当温度升高, 温度
感应子活性增强, ATP酶关键亚基合成量增大, 小孢
子育性比例提高, 达到阈值以上温度时, 亚基基因
转录正常, 所有的功能转为正常。
4 结论
在 BNS 不育系和转换系中分离鉴定了多种差
异蛋白, 不育性主要与ATP合酶 α和 β亚基、23.5 kD
热激蛋白、苹果酸脱氢酶、线粒体醛脱氢酶亚基、
肌动蛋白和类钙网蛋白等功能蛋白关系密切。在这
些差异蛋白中, ATP合酶 α、β亚基最有可能是源头
蛋白。α 亚基由核基因和 mtDNA 共同编码, β 亚基
由核 DNA编码, ATP合酶 α、β亚基在 BNS中缺陷
表达, 说明 α 亚基基因和 β 亚基基因在核、或质中
转录和表达受控。α 亚基基因和 β 亚基基因转录的
调控者可能是上游的转录温度感应子, 该感应子在
BNS 中是隐性突变, 突变的温度感应子活性温度阈
值提高, 因而能弱化 ATP 合酶亚基的正常形成。因
此, 在较低温度下, ATP 合酶亚基基因表达量下调,
这影响到 ATP合酶数量组装减少, 致使 ATP合成不
足、供应不足, 小孢子发育因能量供应不足而败育。
分离鉴定的其他种类蛋白, 应是在 ATP 供应不足的
放大影响下不育系中异常代谢的缺陷蛋白或下调蛋
白。
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[49] Zhang J-B(张吉斌), Liu Y-P(刘月平), Fang M-Y(方美英). Ad-
vance on gene components and biochemical mechanism of mito-
chondrial ATPase. Chin J Animal Sci (中国畜牧杂志), 2010,
46(7): 64−67 (in Chinese with English abstract)




欢迎订阅 2011年《中国水稻科学》、《水稻科学(英文版)》
《中国水稻科学》(ISSN 1001-7216，CN 33-1146/S)为中国水稻研究所主办的全国性学术期刊，主要报
道以水稻为研究对象的未经发表的原始论文。所设栏目包括研究报告、研究简报、研究快报、研究简讯、
实验技术、学术专论、文献综述等。读者对象为国内外从事水稻科研、教学、生产和管理的有关人员。同
时，还办有姊妹刊《Rice Science》(水稻科学，英文版)(ISSN 1672-6308，CN 33-1317/S)。
《中国水稻科学》为中文核心期刊、中国科学引文索引数据库核心期刊、中国科技核心期刊，也是国
内外 20 余种数据库和检索期刊的文献源。据《中国科技期刊引证报告(核心版)》2010 年版的统计，《中国
水稻科学》影响因子为 1.383，总被引频次为 1752，影响因子和总被引频次分别位居农艺学、园艺学类期刊
第 2名和第 4名，总分居农艺学、园艺学类期刊第 2名。在全国和地方期刊评比中，《中国水稻科学》多次
获优秀期刊奖，曾两度被评为全国优秀科技期刊，荣获第三届国家期刊奖百种重点期刊奖，并入选中国期
刊方阵双百期刊、中国精品科技期刊和百种中国杰出学术期刊。
《中国水稻科学》为双月刊，大 16开，112页，每期定价 20.00元(全年 120.00元)，邮发代号 32-94，
国外代号 Q6533。读者可在各地邮政局订阅，也可向编辑部订阅。
《水稻科学(英文版)》为季刊，大 16开，80页，每期定价 10.00元(全年 40.00元)，自办发行，请读者
直接向编辑部订阅。
编辑部通讯地址：杭州市体育场路 359号中国水稻研究所内，邮政编码 310006
电话: 0571-63370278(63371017) E-mail: cjrs@263.net; crrn@fy.hz.zj.cn
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