全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(10): 1833−1838 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08002-001)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张增艳, E-mail: zhangzy@mail.caas.net.cn ** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-04-19; Accepted(接受日期): 2012-06-10; Published online(网络出版日期): 2012-07-27.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120727.0847.020.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01833
抗根腐病的转 GmPGIP3基因小麦扬麦 18的获得与鉴定
党 良 1,2,** 王爱云 1,3,** 徐惠君 1 祝秀亮 1 杜丽璞 1 邵艳军 2
张增艳 1,*
1 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部麦类生物学与遗传改良重点实验室 / 中国农业科学院作物科学研究所, 北
京 100081; 2 河北农业大学生命科学学院, 河北保定 071001; 3 中南林业科技大学生命科学与技术学院, 湖南长沙 410004
摘 要: GmPGIP3 是大豆的一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白, 能够特异性地抑制部分病原真菌内切多聚半乳糖醛酸
活性 , 从而减弱病原菌对植株的侵害。利用基因重组技术构建了 GmPGIP3 基因的单子叶植物表达载体
pA25-GmPGIP3, 通过基因枪介导法将 pA25-GmPGIP3 转入小麦品种扬麦18 中。对转 GmPGIP3 基因扬麦 18 的 T0
至 T2代植株进行 PCR、Southern 杂交、半定量 RT-PCR 和荧光定量 Q-RT-PCR 分析, 并对根腐病进行抗性鉴定。结
果表明, GmPGIP3已转入扬麦 18, 并在转基因小麦中遗传、转录和表达; 与受体材料相比, 5个 GmPGIP3过表达的
转基因小麦株系对根腐病的抗性有明显提高。
关键词: 多聚半乳糖醛酸抑制蛋白; GmPGIP3; 转基因小麦; 分子检测; 根腐病; 抗性
Development and Characterization of GmPGIP3 Transgenic Yangmai 18 with
Enhanced Resistance to Wheat Common Root Rot
DANG Liang1,2,**, WANG Ai-Yun1,3,**, XU Hui-Jun1, ZHU Xiu-Liang1, DU Li-Pu1, SHAO Yan-Jun2, and
ZHANG Zeng-Yan1,*
1 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops,
Ministry of Agriculture / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 College of Biology Science,
Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China; 3 College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Tech-
nology, Changsha 410004, China
Abstract: GmPGIP3 is a polygalacturonase-inhibiting protein from soybean, which can reduce the infection of fungal pathogen
through inhibiting the endo-polygalacturonase activity of pathogen fungi. Using genetic recombination technique, we constructed
the transformation vector of GmPGIP3 gene expressing highly in monocot plants, pA25-GmPGIP3, in which GmPGIP3 gene was
driven by maize ubiquitin promoter. Embryo callus of Yangmai 18 was bombarded by the particle containing pA25-GmPGIP3
vector DNA. The GmPGIP3 transgenic wheat plants from T0 to T2 generations were detected by PCR, Southern blot, RT-PCR,
and Q-RT-PCR analyses. The alien GmPGIP3 proved to be introduced into the transgenic wheat lines with heritability and expres-
sion events. We also evaluated the disease resistance in these GmPGIP3 transgenic plants through inoculating the common root
rot pathogen, Bipolaris sorokiniana. Compared to untransformated Yangmai 18, five GmPGIP3 transgenic lines showed signifi-
cantly-enhanced resistance to Bipolaris sorokiniana.
Keywords: Polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP); GmPGIP3; Transgenic wheat; Molecular detection; Common root rot;
Resistance
多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-
inhibiting protein, PGIP)是一种富含亮氨酸重复区域
的细胞壁结合蛋白, 能特异性结合和抑制真菌内切
多聚半乳糖醛酶(endopolygalacturonase, PG)活性[1]。
Albersheim 和 Anderson[2]首先在蚕豆和番茄的细胞
壁中发现 PGIP。后来发现 PGIP 在健康组织细胞壁
中以低水平存在, 当病原真菌侵染植物组织后, 真
菌分泌的 endo-PG 大量进入植物组织中 , 使内源
PGIP 含量增加, 阻止真菌进一步侵染植株[3]。植物
PGIP 抑制 PG 活性的能力与植物相应抗病性呈正相
1834 作 物 学 报 第 38卷
关[4]。截至 2011 年底, 美国国家生物技术信息中心
(National Center of Biotechnology Information, NCBI)
网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已注册的 PGIP蛋
白达 266种。大豆的 PGIP蛋白分为 4个家族, 分别
被命名为 GmPGIP1~4。只有 GmPGIP3 基因在植株
受到真菌侵染后上调表达, 其编码蛋白对多种植物
病原真菌的 PG表现出抑制作用[5]。
小麦根腐病是一种难以防治的世界性土传病害,
近年来, 在一些地区已经由次要病害上升为主要病
害。我国华北麦区、黄淮麦区和东北麦区 2009年均
发现部分田块因根腐病造成枯白穗。小麦根腐病是
全生育期典型的多阶段性病害, 从苗期到抽穗结实
期都能发生。一般减产 5%~10%, 严重地块减产
20%~50% [6]。小麦根腐病是多元性复合侵染的病害,
主要病原菌为禾旋孢腔菌 [无性世代为 Bipolaris
sorokiniana (Sacc. ex Sorok.) Shoem., 有性世代为
Cochliobolus sativus (Ito et Kurib.) Drechsl]。目前,
生产上缺乏对小麦根腐病有效的化学药剂, 化学防
治效果较差。小麦根腐病的抗性遗传机制复杂, 缺
乏高抗或免疫的小麦种质资源 [7], 致使抗根腐病小
麦常规育种进展缓慢。因此, 发掘、利用重要的抗
病相关基因, 开展抗根腐病的小麦基因工程育种非
常重要。
本研究构建了大豆 GmPGIP3 基因的高效植物
表达载体, 通过基因枪介导方法转化小麦品种扬麦
18, 并对转基因小麦 T0至 T2代植株进行分子检测和
抗病性鉴定, 以期获得根腐病抗性提高的转基因小
麦新种质。
1 材料与方法
1.1 GmPGIP3基因的植物表达载体构建
根据 GmPGIP3 基因的 mRNA 序列设计引物
(GmPGIP3-F: 5′-ATGTCAAAGTTAAGCATTCT-3′;
GmPGIP3-R: 5′-TTAAGTGCATGGTGGAAGAG- 3′)。
使用 TRIZOL 试剂盒(Invitrogen)提取普通大豆叶片
总 RNA, 用 cDNA 合成试剂盒(Invitrogen)反转录合
成 cDNA。以该 cDNA 为模板, 用高保真 Taq 酶
(TaKaRa) PCR扩增得到 GmPGIP3基因全长编码序
列, 将其连接到 pMD18-T载体(TaKaRa)的多克隆位
点间, 转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞, 通过菌落
PCR 筛选出阳性克隆, 经测序分析, 选出测序正确
的 GmPGIP3 基因质粒 DNA 为模板, 利用引物(Gm-
PGIP3-SMAF: 5′-ATCCCGGGATGTCAAAGTTAAGC
ATTCT-3′, 方框指示 Sma I酶切位点, GmPGIP3-SACR:
5′-GTGAGCTCTTAAGTGCATGGTGGAAGAG-3′,
方框指示 Sac I酶切位点)进行 PCR扩增, 在GmPGIP3
基因的 5′端和 3′端分别添加 Sma I和 Sac I酶切位点,
然后用 Sma I和 Sac I消化 PCR产物以及载体 pAHC25
切下目的片段 ; 琼脂糖凝胶电泳后回收所需片段 ,
利用 T4连接酶将 Sma I、Sac I双酶切的 GmPGIP3
基因片段连接到 Sma I、Sac I 酶切处理的 pAHC25
载体上, 构建成 GmPGIP3 基因的表达载体 pA25-
GmPGIP3 (图 1), 转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞,
进行菌落 PCR筛选、测序分析, 以确定成功构建了转
基因表达载体 pA25-GmPGIP3。该载体中 GmPGIP3
基因表达受玉米 Ubiqutin启动子控制, 另外Bar基因
由另一个 Ubiqutin 启动子控制, 可为后续选择利用
Bialaphos筛选转化再生植株提供抗性筛选标记。
1.2 转 GmPGIP3基因小麦植株的获得
小麦受体为推广品种扬麦 18, 由江苏里下河农
业科学研究所程顺和课题组提供。按照徐惠君等[8]
报道的基因枪介导法转化小麦幼胚, 经组织培养和
Bialaphos 筛选后, 将再生植株移栽至花盆中。从成
活的 GmPGIP3基因 PCR呈阳性的 T0代抗病小麦植
株上收获种子, 单株播种, 获得 T1 植株, 并进行转
基因的分子检测和抗病性鉴定; 收获 GmPGIP3 基
因 PCR 呈阳性的抗病小麦植株种子, 单株播种, 获
得 T2植株进行分子与抗病鉴定。转基因植株的种植
与抗病性鉴定在中国农业科学院作物科学研究所
(北京)网室和温室内完成。
1.3 转基因植株中外源GmPGIP3基因的分子检测
1.3.1 PCR分析 采用改进的CTAB抽提法[9], 从 T0
至 T2 代植株幼苗叶片中提取基因组 DNA。为减
少小麦自身同源基因的干扰 , 根据转基因载体
pA25-GmPGIP3 的序列设计 PCR 引物进行巢式
PCR。第 1轮特异引物为 PUBI-1910U (5′-GCTCTG
CCTTCATACGCTA-3′, 位于载体启动子 3′端)和 TNOS-
TR4 (5′-TGCGGGACTCTAATCATAAA-3′, 位于载
体 TNOS终止序列); 以转 GmPGIP3基因小麦 DNA
为模板进行 PCR扩增检测, 扩增条件为 94℃预变性
3 min, 94℃ 45 s, 58℃ 45 s, 72℃ 90 s, 30个循环;
72℃延伸 5 min。第 2 轮 PCR 引物为 GMPG-OU
(5′-CCTAATCGGTCAAATCCCCT-3′, 位于GmPGIP3基
因读码框上游)和 GMPG-OL (5′-GACAAGTCCACG
AACGCCA-3′, 位于 GmPGIP3 基因读码框下游 ),
以第 1轮 PCR产物作为模板进行第 2轮 PCR, 扩增
条件为 94℃预变性 3 min, 94℃ 40 s, 58℃ 40 s, 72℃
35 s, 35个循环; 72℃延伸 5 min。用含 EB的 1.8%
第 10期 党 良等: 抗根腐病的转 GmPGIP3基因小麦扬麦 18的获得与鉴定 1835
图 1 GmPGIP3基因转化载体 pA25-GmPGIP3构建流程
Fig. 1 Construction of pA25-GmPGIP3 expression vector
琼脂糖凝胶电泳分析, 预期从转GmPGIP3基因载体
质粒 pA25-GmPGIP3 和转 GmPGIP3 基因小麦阳性
植株中扩增出约 350 bp产物。
1.3.2 Southern杂交 用限制性内切酶 EcoR I和
Dra I分别消化 20 μg基因组 DNA, 0.8%琼脂糖凝胶
电泳分离后将其转移到尼龙膜上, 65℃下预杂交后,
用 α-32P-dCTP标记的 GmPGIP3基因 PCR扩增片段
为探针进行杂交, 最后洗膜和压磷屏。
1.3.3 半定量 RT-PCR 和 Q-RT-PCR 分析 用
TRIZOL 试剂(Invitrogen)提取叶片总 RNA, 按 RNA
kit ver.3.0 cDNA合成试剂盒(TaKaRa)说明书合成第
一链 cDNA, 并以此为模板, 首先用 Actin 基因特异
引物(ACT-A: 5′-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3′;
ACT-B: 5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′)对各样
本 cDNA扩增, 使各样本 cDNA模板量均一化, 然后
用 GmPGIP3特异引物(GMPG-QF: 5′-CCTAATCGG
TCAAATCCCCT-3′; GMPG-QR: 5′-GACAAGTCCA
CGAACGCCA-3′)进行半定量 RT-PCR表达分析。扩
增条件为 94℃预变性 3 min; 94℃ 30 s, 50℃ 30 s,
72℃ 30 s, 35个循环; 最后 72℃延伸 5 min。
用ABI PRISMR 7300实时荧光定量 PCR仪(ABI,
美国)进行实时荧光定量 RT-PCR (Q-RT-PCR)分析。反
应体系 25 μL, 按照 SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)反
应 系 统 , 以 GMPG-QF/GMPG-QR 为 引 物 进 行
GmPGIP3 的特异扩增, 以 Actin 为内参照。反应程
序为 94℃预变性 1 min; 94℃变性 15 s和 60℃退火
31 s进行 45个循环。
上述实验进行 3次独立的重复。
1.4 小麦根腐病的抗性鉴定
参照 Dong 等[10]报道的麦粒菌和菌牙签法进行
病菌接种。在小麦分蘖盛期用消毒镊子夹取长满菌
丝的牙签段, 轻轻地嵌入麦苗叶鞘内, 每个叶鞘嵌
入一段即可; 同时将长满菌丝的煮熟麦粒, 放入接
菌叶鞘的牙签旁, 用以加深发病程度。于蜡熟期进
行发病调查, 按Dong等[10]介绍的 0~4级系统进行病
级分级。以未转基因的扬麦 18为对照。每个株系鉴
定 20株。
1.5 农艺性状调查
调查转 GmPGIP3基因小麦的株高、穗长、穗数
和小穗数, 以未转基因的扬麦 18为对照。每个株系
调查 20株。
2 结果与分析
2.1 转基因植株中 GmPGIP3基因 PCR检测
从存活转 GmPGIP3 基因小麦 T0代组培苗 386
1836 作 物 学 报 第 38卷
株中, PCR检测出转 GmPGIP3基因阳性植株 71株。
挑选出 7 个抗性较好(1 级)的转 GmPGIP3 基因扬麦
18 T1代株系 130单株进行 PCR检测, 获得检测阳性
株 119 株。收获种子后于温室种植 T2代, 并选出抗
性较好的转基因扬麦 18的 T2代 5个株系 50株, PCR
检测均为阳性(图 2)。上述结果表明外源 GmPGIP3
基因在这些株系中能够遗传。
图 2 转 GmPGIP3基因扬麦 18的 T2代 PCR检测
Fig. 2 PCR analysis on T2 plants of GmPGIP3 transgenic
wheat Yangmai 18
M: 100 bp DNA ladder; CK: ddH2O; P: 转基因载体质粒
pAHC25-GmPGIP3; WT: 未转基因扬麦 18; 1: 转基因株系 T908;
2: 转基因株系 T909; 3: 转基因株系 T910; 4: 转基因株系 T912;
5: 转基因株系 T913。
M: 100 bp DNA ladder; CK: ddH2O; P: GmPGIP3 transformation
vector pAHC25-GmPGIP3; WT: wild-type Yangmai 18; 1: trans-
genic line T908; 2: transgenic line T909; 3: transgenic line T910; 4:
transgenic line T912; 5: transgenic line T913.
2.2 部分转基因株系的 Southern blot分析
以转 GmPGIP3 基因的特异性 PCR 扩增片段为
探针, 用限制性内切酶 Dra I和 EcoR I分别酶切转
基因扬麦 18的 T1代株系 T908和 T909, 以未转基因
扬麦 18 受体为阴性对照。Southern 杂交结果显示,
转入 GmPGIP3基因在株系 T908中以 2个拷贝形式
存在, 在株系 T909中以单拷贝形式存在(图 3)。
2.3 转基因植株中 GmPGIP3基因转录水平
以半定量 RT-PCR分析转基因扬麦 18的 T2代植
株中 GmPGIP3 基因的转录水平, 结果表明 T908、
T909、T910、T912 和 T913 抗病植株中 GmPGIP3
基因的转录水平均高于未转基因的扬麦 18。进一步
利用 Q-RT-PCR定量分析上述抗病单株中 GmPGIP3
基因的表达量, 结果这些抗病植株中GmPGIP3转录
水平明显高于未转基因扬麦 18, 不同植株中的表达
量存在差异(图 4)。
2.4 转基因植株的抗根腐病的抗性鉴定
根腐病抗性鉴定结果表明(表 1), 与未转基因的
受体小麦扬麦 18 相比, 5个转 GmPGIP3 基因株系
(T908、T909、T910、T912和 T913)的 T1和 T2代群
体均对根腐病抗性显著提高(P<0.05), 说明 GmPGIP3
过表达显著提高了转 GmPGIP3 基因小麦对根腐病
抗性。
图 3 部分 T1代转 GmPGIP3基因小麦株系 Southern blot图谱
Fig. 3 Southern blotting profile of GmPGIP3 transgenic wheat
lines in T1 generation
WT1和 WT2: 扬麦 18; 1和 3: 转基因株系 T908; 2和 4: 转基因
株系 T909; P: 转基因载体质粒 pAHC25-GmPGIP3 (对照); M:
λDNA/Hind III marker。泳道 WT1、1和 2用 EcoR I酶切, 泳道
WT2、3和 4用 Dra I酶切。
WT1 and WT2: wild-type Yangmai 18; 1 and 3: transgenic line
T908; 2 and 4: transgenic line T909; P: GmPGIP3 transformed
vector plasmid pAHC25-GmPGIP3 as control; M: λDNA/Hind III
marker. Lanes WT1, 1 and 2 show these digested with EcoR I; lanes
WT2, 3, and 4 show these digested with Dra I.
图 4 转 GmPGIP3基因株系中 GmPGIP3基因表达的
RT-PCR(A)和定量 RT-PCR(B)分析
Fig. 4 RT-PCR (A) and Q-RT-PCR (B) assays on GmPGIP3
transcript in transgenic wheat plants
WT为未转基因的扬麦 18, 其他为转基因株系。
WT is the wild-type Yangmai 18, and others are transgenic lines.
2.5 转基因株系农艺性状调查
方差分析显示, 所有转 GmPGIP3 基因小麦的
农艺性状均与未转基因对照扬麦 18 差异不显著
(P>0.05), 表明外源 GmPGIP3 基因的转入对小麦的
正常生长没有明显影响(表 2)。
第 10期 党 良等: 抗根腐病的转 GmPGIP3基因小麦扬麦 18的获得与鉴定 1837
表 1 转 GmPGIP3基因小麦株系的根腐病病情指数
Table 1 Disease index of wheat root rot in GmPGIP3 transgenic wheat lines
转基因株系 Transgenic lines 世代
Generation T908 T909 T910 T912 T913
扬麦 18 (对照)
Yangmai 18 (receptor)
T1 25.0* 20.0* 22.0* 20.0* 22.3* 42.0
T2 20.0* 22.0* 26.6* 18.5* 20.0* 45.5
T1代每个株系调查 20株, T2代每个株系调查 10株, 表中数值为其平均值。* 表示在 0.01
cant difference between the transgenic line and the receptor variety at 0.01
表 2 转 GmPGIP3基因小麦株系的农艺性状
Table 2 Agronomic traits of GmPGIP3 transgenic wheat lines
转基因株系
Transgenic line
株高
Plant height (cm)
分蘖数
Number of tillers
穗长
Spike length (cm)
小穗数
Number of spikelets
T908 72.7±4.5 7.4±1.4 9.1±0.6 18.5±1.2
T909 73.5±6.1 4.9±1.3 9.2±0.6 18.5±1.3
T910 76.7±5.0 7.8±1.6 10.0±0.4 18.2±2.1
T912 73.0±4.7 8.3±0.9 9.4±0.3 19.0±1.9
T913 69.5±6.4 6.4±1.8 8.5±0.6 18.5±1.7
扬麦 18 (对照) Yangmai 18 (receptor) 68.1±4.9 6.3±1.1 9.6±0.5 19.0±1.5
每个株系调查 20株, 表中数值为平均值±标准误。
Twenty plants were investigated for each line, and data are indicated as mean±SE.
3 讨论
自从 1993年 Willamson等[11]首次将 PGIP基因
用于果实的耐贮藏育种, PGIP基因就作为一种植物
抗病防卫基因应用于多种植物的转基因抗病育种研
究中[12-14]。现已证明PGIP在植物体内具有防御作用[15],
可以减少 PG 对植物细胞壁的降解, 有助于维护植
物细胞壁的完整性, 使植物细胞壁不易被病原真菌
分泌的水解酶所渗透, 以减慢细胞壁的降解, 使病
原真菌可以利用的营养物质减少, 进而减缓病原真
菌的生长繁殖速度 [ 1 6 ]。D’Ovidio 等 [ 5 ]发现大豆
GmPGIP3参与其抗病原菌 PG反应, 推测 GmPGIP3
基因可能在植物抗病作用中起重要作用。但尚未见
该基因在植物体内抗病功能的国内外报道。为了研
究其在小麦中的抗病作用, 本研究构建了 GmPGIP3
转基因载体, 利用基因枪介导法将GmPGIP3基因转
入推广小麦品种中。对转 GmPGIP3 基因小麦 T0至
T 2 代植株的 P C R 检测和转录表达分析表明 ,
GmPGIP3 基因在转基因小麦中可以遗传, 并整合到
转基因小麦基因组的不同部位, 5个抗根腐病的转基
因小麦株系可以在 R N A 水平超量表达。对转
GmPGIP3基因小麦持续 2代的根腐病抗性鉴定发现,
有 5个转GmPGIP3基因小麦株系对根腐病抗性有明
显提高。Janni 等[13]曾证明转入扁豆的 PvPGIP2 基
因可以提高小麦对根腐病主要致病菌的抑制, 但其
抗病鉴定是将病菌孢子液喷至叶片, 其表型与鉴定
标准不同于本文。本研究接种位点于根茎部, 表型与
鉴定时期及标准更接近于根腐病发生的实际情况。
Q-RT-PCR 结果显示 , 不同转基因株系的
GmPGIP3 基因表达量不同 , 对其中 2 个株系的
Southern 杂交实验结果揭示, 其原因可能在于不同
转基因株系 GmPGIP3 基因处于不同的转化子之中,
由于外源基因插入小麦基因组位置不同、拷贝数不
同等因素的影响, 很容易发生不同程度的基因沉默
现象, 减弱了部分转 GmPGIP3 基因小麦的表达量,
甚至出现双拷贝 GmPGIP3基因的 T908株系表达量
比单拷贝的 T909株系的高的情况。综合以上因素, 造
成了不同转基因株系表现出的抗病性提高程度不一。
4 结论
通过基因枪转化、多种分子检测和抗病性鉴定,
创制和选育出抗根腐病的转 GmPGIP3 基因扬麦 18
新种质 5份。转入的 GmPGIP3基因能够遗传并表达,
表达量与抗病性正相关。
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