全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(6): 1097−1103 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家自然科学基金项目(30671288, 30730065); 教育部留学回国人员科研启动基金; 四川省小麦育种攻关项目
作者简介: 李光蓉(1974–), 女, 四川万源人, 在职博士研究生, 研究方向：植物分子细胞生物学。E-mail: ligr28@126.com
*
通讯作者(Corresponding authors): 任正隆(1949–), 男, 教授, 研究方向：植物遗传与小麦育种。E-mail: renzl@uestc.edu.cn；
杨足君(1971–), 男, 教授, 研究方向：植物分子细胞生物学。E-mail: yangzujun@uestc.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-10-17; Accepted(接受日期): 2008-01-25.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01097
多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的分离与序列分析
李光蓉 任正隆* 刘 成 周建平 杨足君*
(电子科技大学生命科学与技术学院, 四川成都 610054)
摘 要: 以多年生簇毛麦(Dasypyrum breviaristatum)基因组 DNA为模板, 用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行 PCR扩
增。扩增产物经克隆测序, 获得 999~1 018 bp的 7个序列(GenBank登录号为EU186102–EU186108), 分别编码 283~290
个氨基酸。序列比对结果表明, 它们具有α-醇溶蛋白基因的保守特征, 是α-醇溶蛋白基因家系成员。该 7个序列与乳
糜泻(celiac disease)病人毒性抗原相关序列的比对结果表明, 有 5个序列在 C末端具有 Glia-α-2型抗原序列的特征。
根据α-醇溶蛋白基因的编码氨基酸建立系统树, 发现来自多年生簇毛麦的α-醇溶蛋白基因序列单独聚为一类, 不能
与普通小麦 A、B 或 D染色体组的相关序列聚在一起。在序列分析的基础上设计了簇毛麦基因组α-醇溶蛋白基因的
特异引物 AS-V-gli-F和 AS-V-gli-R, 通过特异 PCR扩增, AS-V-gli-F和 AS-V-gli-R仅能对多年生簇毛麦、小麦-多年
生簇毛麦部分双二倍体进行特异性扩增, 而不能对小麦和其他小麦族物种进行扩增。因此, AS-V-gli-F和 AS-V-gli-R
可作为检测多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因向栽培小麦转移的分子标记。
关键词: 多年生簇毛麦; α-醇溶蛋白基因; 基因克隆; 特异 PCR
Isolation and Sequence Analysis of α-gliadin Genes from Dasypyrum
breviaristatum
LI Guang-Rong, REN Zheng-Long*, LIU Cheng, ZHOU Jian-Ping, and YANG Zu-Jun*
(School of Life Science and Technology, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610054, Sichuan, China)
Abstract: PCR was carried out on the genomic DNA from Dasypyrum breviaristatum using the conserved primers specific
forα-gliadin genes. The PCR products were cloned and sequenced. Total 7 sequences were obtained with length of 999 to 1 018 bp
containing coding regions from 283 to 290 amino acids and their GenBank accession number are EU186102 to EU186108 respec-
tively. BLAST search showed that these sequences belong to α-gliadin super-family. Searching for 4 different T cell stimulatory
epitopes for celiac disease patient, it is found that 5 of 7 sequences contained the Glia-α-2 epitopes at the C terminal region. The
phylogenetic trees indicated that all the sequences could not be clustered into the group of α-gliadin genes from the A, B, and D
genomes of wheat (Triticum aestivum), but presented in a new group. On the basis of the α-gliadin gene sequences, a pair of
AS-PCR primer was designed. PCR results indicated that the AS-PCR primers allow to specifically amplify the D. breviaristatum
and wheat-D. breviaristatum partial amphiploid, which thus can be used as a marker to trace the D. breviaristatum derived
α-gliadin genes in wheat-Dasypyrum introgression lines.
Keywords: Dasypyrum breviaristatum; α-gliadin gene; Gene cloning; Specific PCR
簇毛麦属(Dasypyrum, 又称Haynaldia)包括二倍体簇
毛麦[D. villosum (L.) Candargy]和四倍体多年生簇毛麦[D.
breviaristatum (Lindb. F.) Frederiksen] 2个种, 都是小麦育
种可利用的重要遗传资源[1-2]。在对二倍体簇毛麦的研究
和利用上, 以创制的小麦-簇毛麦异附加系与代换系为桥
梁, 分别将来自 6V染色体的抗白粉病基因和 4V染色体的
抗眼斑病基因、梭花叶病毒病基因导入小麦品种中 [3-5];
相比之下, 对多年生簇毛麦的研究利用报道较少。我们在
人工合成小麦-多年生簇毛麦双二倍体的基础上 [6], 开展
了将多年生簇毛麦优良基因导入小麦的研究 , 鉴定了一
1098 作 物 学 报 第 34卷

批携带多年生簇毛麦染色质的中间材料[7-9]。进一步从多
年生簇毛麦基因组中鉴定功能基因和建立分子标记 , 可
以为辅助多年生簇毛麦遗传物质向小麦的导入。
麦醇溶蛋白(gliadin)是小麦胚乳贮藏蛋白的重要组成
部分之一 , 其组成和含量对小麦烘烤品质具有重要作用
[10]。麦醇溶蛋白在较低的pH值条件下, 通过聚丙烯酰胺凝
胶电泳分离, 按电泳迁移率的不同, 可以分为α、β、γ和ω 4
种类型。麦醇溶蛋白的等位性变异在栽培小麦及其近缘属
物种中极为丰富, 已经被用在小麦遗传资源的鉴定之中[11]。
醇溶蛋白基因在结构上具有一定的保守性, 并且α-醇溶蛋
白基因编码的氨基酸序列包括信号肽、多聚谷胺酰胺区域、
重复区和非重复区, 以及有利于蛋白质形成二硫键的 6 个
半胱氨酸残基等典型的特征, 为进行醇溶蛋白基因的克隆
和从基因序列水平上阐释其遗传变异的分子机制提供了依
据 [12-14]。目前已有从六倍体普通小麦(Triticum aestivum,
AABBDD)[13]、四倍体硬粒小麦(T. durum, AABB)[15]、斯卑
尔脱小麦(T. spelta, AABBDD)[16]、栽培小麦的A、B、D染
色体供体物种一粒小麦(T. monococcum, AA)[17-18]、斯卑尔
脱山羊草 (Aegilops speltoides, SS)[17-18]和节节麦 (Ae.
tauschii, DD)[17]基因组中克隆α-醇溶蛋白基因序列的报道,
但是未见在簇毛麦属物种基因组中克隆α-醇溶蛋白家系的
报道。本研究对多年生簇毛麦的α-醇溶蛋白的序列进行了
克隆与序列分析, 为研究α-醇溶蛋白基因在小麦族植物中
的进化打下了基础, 获得的簇毛麦α-醇溶蛋白基因的特异
性分子标记为正在进行的多年生簇毛麦遗传物质向小麦转
移的后代鉴定提供了新的检测手段。
1 材料与方法
1.1 植物材料
多年生簇毛麦(D. breviaristatum)PI564517、偏凸山羊草
(Ae. ventricosa)、二倍体长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)、
拟鹅观草(Pseudoroegneria spicata)和新麦草(Psathyrostachys
fragilis)由美国National Plant Germplasm System (NPGS)提供,
小麦-多年生簇毛麦部分双二倍体(TDH2, AABBVbVb)、普通
小麦中国春(Chinese Spring)、节节麦(Ae. tauschii)由四川农业
大学植物遗传育种重点实验室保存并提供。
1.2 基因组 DNA的提取及α-醇溶蛋白基因 PCR扩增
采用SDS法提取DNA[9]。根据小麦α醇溶蛋白基因的
全 序 列 U08287 及 其 和 小 麦 - 山 羊 草 EST 序 列 库
(http://wheat.pw.usda.gov)的比对结果, 设计 1对简并引物,
P1 为 5′-ACCACAAATCCAACATG(A/T)AGACCTT(C/T)
(A/C)TCAT-3′; P2 为 5′-CCCATG(C/T)TTGAACTA(G/C)
TATAGGT(C/A)G-3′, 并在PTC-200 PCR仪上对中国春和
PI564517的基因组DNA进行扩增。
扩增反应体积为 20 μL, 含 50 ng基因组DNA; 1 U Taq
聚合酶; 10 nmol L−1 Tris-HCl (pH 8.3); 50 mmol L−1 KCl; 1.5
mmol L−1 MgCl2; 每个引物 0.2 μmol L−1。扩增程序为 94℃
预变性 3 min; 94℃变性 1 min; 62℃复性 1 min, 72℃延伸 1
min, 38个循环; 72℃延伸 10 min。在含有 0.5% EB和 1%琼
脂糖凝胶上, 以 1×TAE缓冲液为介质电泳, 电压 100 V。
1.3 PCR产物克隆测序
PCR扩增产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分离、回收, 并
连接到载体 pMD18T上, 通过蓝白斑筛选, 将获得的阳性
克隆送上海英骏生物公司测序。测序得到的核苷序列在
NCBI的 GenBank中登录。
1.4 序列对比及进化分析
将获得的序列在NCBI GenBank中进行BLAST搜索, 并
选取代表性物种的α-醇溶蛋白基因家族的序列, 用ClustalX
软件进行序列比对, 使用MEGA[9], 运用Neighbor- Joining法,
重复分支搜寻 2 000次, 构建Bootstrap Tree, 进行系统分析。
1.5 AS-PCR分析
根据多年生簇毛麦的 N 端和 C 端编码区序列, 设计特
异引物 AS-V-gli-F: 5′-CCACAAATCCAACATGAAGAC-3′,
AS-V-gli-R: 5′-ATACCGATGCTTCCAAATGG-3′进行 PCR
扩增, 扩增反应体系与条件同 1.2 节, 仅复性温度增加为
63℃。
2 结果与分析
2.1 醇溶蛋白基因的 PCR扩增
P1、 P2 引物对的扩增结果表明 , 在中国春和
PI564517中均获得了约 1 kb的产物(图 1)。



图 1 多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的 PCR 分析
Fig. 1 PCR amplification of D. breviaristatum α-gliadin genes
M: DL4500 marker; 1: 中国春; 2: 多年生簇毛麦。
M: DL4500 marker; 1: Chinese Spring; 2: D. breviaristatum.

2.2 多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因序列分析
将目的片段回收纯化后连接到 pMD18-T载体上并转
化到大肠肝菌中, 对菌落进行 PCR 扩增, 确认为阳性克
隆后进行双向测序, 获得 7个序列的长度为 999~1 018 bp
(图 2)。序列分析表明, 5′端第 14 个核苷酸之前为非编码
区, 开放阅读框从第 15 个核苷酸起, 序列的末端具有加
尾信号。7个序列核苷酸水平的同源性为 72.6%~98.4%。
将序列输入 NCBI 进行同源性检索, 发现这 7 个基因序列
与已公布的α-醇溶蛋白基因的同源性高达 70%以上, 最高可
达 85%(表 1)。因此认为本试验克隆的这 7 个序列属于α-醇
溶蛋白基因家族, 被分别命名为 DbGli2~1~DbGli2-7, Gen-
Bank注册号分别为 EU186102~EU186108。
第 6期 李光蓉等: 多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的分离与序列分析 1099


EU186104 ACCACAAATCCAACATGAAGACCTTTATCATCCTTTCCCTTCTTGCTATTGTGGCGACCACCGCCACAACCGCAGTTAGAGTTCCAGTGCCACAATTGCA 100
EU186103 ............................................................................C..................C.... 100
EU186105 .................................................................................................... 100
EU186108 .........................C.......................................................................... 100
EU186106 ..........................C....................................................................C.... 100
EU186107 .........................CC.................................................C..................C.... 100
EU186102 .........................CC......................................................................... 100

EU186104 GCCGCAAAATCCATATCAACAACAACCACAAGAACAAGTTCCATTGATGCAACAACAACAATTTCCAGGGCAGCAACAACCAATTCCACCACAACAGCCA 200
EU186103 ........T.....T...........................................G......................................... 200
EU186105 ...................G................................................................................ 200
EU186108 .................................................................................................... 200
EU186106 ..............T..........................................GG......................................... 200
EU186107 ........T.....T...........................................G......................................... 200
EU186102 .................................................................................................... 200

EU186104 TATCCGCAGCCACAACCATTTCCATCACAACAACCATATCCACAGCCGCAACCATTTTCACCACAACAACTATTTCCGCAGCCGCAACCATTTCCGCCAC 300
EU186103 ...........G...T.........................................C....................................T..... 300
EU186105 ...........G.............................................C....................................T..... 300
EU186108 ...........T.........T......................A............C..............................T.....T..... 300
EU186106 ...........G...T.........................................C....................................T..... 300
EU186107 ...........G...T.........................................C....................................T..... 300
EU186102 ....A..................................................................................G.....T...... 300

EU186104 AACTACCATATCCGCAGCCGCAGCCATTTCCACCACAACAATCATATCCACAACCGCAACACCAGTATACGCGACAGCAACAACTAATTTTGCAGCAACA 400
EU186103 ......................A......................................A......C.A.A...A.......C......A........ 400
EU186105 ......................A................................A.....A......C...A...A.......C......A........ 400
EU186108 .............................................................A......C...A...A.......C............... 400
EU186106 ......................A......................................A......C.A.A...A..C....C......A........ 400
EU186107 ......................A......................................A......C.A.A...A.G.....C......A........ 400
EU186102 .............................................................A..........A........................... 400

EU186104 AGAGCAACAAATCCTTGAACGACTTCTACAACAACAGCTGAATCCATGCAGGGATGTCGTCTTGCAACAACACAACATTGCACATGGAAGCTCACAAGTA 500
EU186103 ...A............C...A......G.......G.T..........T................................G.......A.......... 500
EU186105 ...A............C...A......G......TG......................A......................G.......A.......... 500
EU186108 ...A............C...A......G.......G.........T...C...............................G.................. 500
EU186106 ...A............C...A......G.......G.T..........T................................G.......A.......... 500
EU186107 ...A............C...A......G.......G.T..........T................................G.......A.......... 500
EU186102 ...A............------------.....................................................G.................. 488

EU186104 TTGCAACAAAGTAGTTACCAGGTGTTGCAACAACTGTGTTGTCAGCAGCTGTGGCAGATCCCCGAGCAGTCGCGGTGCCAAGCCATCCACAGTGTTGTTC 600
EU186103 ...............................................................A...................TG............... 600
EU186105 ....................................................................................G............... 600
EU186108 .................T...............T..................................................G............... 600
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EU186107 ...............................................................A...................TG............... 600
EU186102 ....................................................................................G............... 588

EU186104 ACGCTATTATTCTGCATCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACTATTGAGCCAAGGCTCGTTTCAACAACCTCAACAACAATATCCGTCAGG 700
EU186103 ...........T................G...................---.G........G...................................... 697
EU186105 ............................------..............---.G.C......G...................................... 691
EU186108 .......................................------------.G........G...................................... 688
EU186106 ............................G...................---.G........G...................................... 697
EU186107 ............................G...................---.G........G...................................... 697
EU186102 ..........................................---------...............T................................. 679

EU186104 CCAGGGCTCCTTCCAGTCATCTCAGCAAAACCCTCAGGGCCAAAGCTTTATCCAACCTCAACAACTACCCC-AGTTCGAGGAAATAAGGAGGTTAGCGCT 799
EU186103 ................C.........................G......G.....................-......................G..... 796
EU186105 ...........C....C.........................G......G.....................C.T........................T. 791
EU186108 ................C.............G...........G......G.....................-...........T................ 787
EU186106 ................C.........................G......G.....................-......................G..... 796
EU186107 ................C.........................G......G.....................-......................G..... 796
EU186102 ..........................................G............................-............................ 778

EU186104 GCAGACACTACCAGCAATGTGCAATGTCTATGTCCCTACATATTGTTCGACCACCATCGTGCCATTTGGAAGCATCGGTATTAACTGAGAAGAGAAGAAC 899
EU186103 ......G......A................C..................................................................... 896
EU186105 ......G......A................C.............................C...............A....................... 891
EU186108 ......G....................G.....G..........................................A....................... 887
EU186106 ......G......A................C.............................................A.............-.......-. 894
EU186107 ......G......A................C.............................A...............A.............-....-..-. 893
EU186102 .................................................................................................... 878

EU186104 TCTAGTACCAGATATATGGGAACACCGTTTCTTAGTCCATGGTTTGG-TCGT-GTAGCGGGTGAAAAAATAAAGTGA-ATGCACTATCATGTAA-AACCC 995
EU186103 ...................-...........................-....T.......TGA..............C................A..... 994
EU186105 ...................-...........................-....T.......TGA....-.........T................G..... 988
EU186108 ..................A-...........................-....T.......TGA..............C................G..... 985
EU186106 ..................--.....-A.....-....-...-....--....-......-TGA....T.---.....C.-.............GA--... 978
EU186107 ...................-............-.............--....-......-TGA....T.---.....C...............GA--... 982
EU186102 ...................-...........................G....T........................C...............G..-... 975

EU186104 GACCTATACTAGTTCAAACATGGG 1019
EU186103 ........................ 1018
EU186105 ........................ 1012
EU186108 ........................ 1009
EU186106 ...-.........C--........ 999
EU186107 ...-.................... 1005
EU186102 ........................ 999

图 2 分离的多年生簇毛麦的α-醇溶蛋白基因的核苷酸序列比较
Fig. 2 Comparison of the nucleotide sequences of D. breviaristatum α-gliadin genes
起始和终止密码子以阴影表示; 方框表示 EU186105唯一的核苷酸插入位点; 下画线示加尾信号区。
The putative start and stop codons are shaded. The boxed nucleotide is a unique insertion of EU186105. The polyadenylation element was underlined.
1100 作 物 学 报 第 34卷

表 1 多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的预测氨基酸序列
Table 1 The deduced amino acid sequence of the cloned D. breviaristatum α-gliadin gene sequences
基因
Gene
序列号
Accession
number
序列长度
Length of
nucleotide (bp)
氨基酸数目
Number of
amino acid
N-端序列
N-terminal
sequence
C-端序列
C-terminal
sequence
预测分子量
Predicted molecular
weight (kD)
预测 pI值
Predicted
pI
DbGli2-1 EU186102 999 284 VRVPVPQLQPQ CSTTIVPFGSIGIN 30.35 6.50
DbGli2-2 EU186103 1019 291 ARVPVPQLQPQ CSTTIVPFGSIGIN 31.10 7.82
DbGli2-3 EU186104 1019 291 VRVPVPQLQPQ CSTTIVPFGSIGIN 31.28 7.12
DbGli2-4 EU186105 1012 287 VRVPVPQLQPQ FDHHRPIWKHQY 31.04 7.20
DbGli2-5 EU186106 999 290 VRVPVPQLQPQ CSTTIVPFGSISIN 31.16 6.62
DbGli2-6 EU186107 1005 290 ARVPVPQLQPQ CSTTIVPFGSISIN 31.16 8.30
DbGli2-7 EU186108 1009 287 VRVPVPQLQPQ CSTTIVPFGSISIN 30.75 7.77


2.3 氨基酸序列分析
从表 1 可见, 氨基酸序列之间的预测 pI 值有较大变
异, 说明虽然 7 个核苷酸同源性较高, 但是其编码的氨基
酸序列又有较高的多态性。α-醇溶蛋白基因编码的氨基酸
序列具有的典型的特征, 包括信号肽、N-端重复区、2 个
多聚谷胺酰胺区域、中部和 C 末端非重复序列区以及位
于非重复序列区的 6个半胱氨酸残基等(图 3), 对获得的 7
个序列与小麦的氨基酸序列 AAZ73728进行比对(图 4), 发
现在重复序列区, 特别是在 2 个多聚谷胺酰胺区域, 表现
较大的变异。在多聚谷胺酰胺区域 I 具有 6 个谷胺酰胺,
且被 E 隔开, 多聚谷胺酰胺区域 II, 具有 7~11 个谷胺酰
胺。其中, DbGli2-5 EU186105的 C末端具有特殊性, 核
苷酸的 763处插入 C导致移码突变(图 2), 而在 C末端则
少 1个半胱氨酸残基, 也表现出较大的变异。
2.4 毒性多肽位点的分析
禾谷类作物面筋中特有的多肽, 与对谷蛋白敏感肠
病(乳糜泻, celiac disease, CD)病人的T细胞结合会产生小
肠黏膜损伤和吸收不良症状[19]。图 3 给出了在α-醇溶蛋
白基因编码序列中的 4个对乳糜泻病人的T细胞具有毒性
的多肽序列 , 分别为位于N端重复序列区的Glia-α-9、
Glia-α-2、Glia-α-20以及在C末端的非重复序列区的Glia-α
序列[18]。将这 4 个抗原序列对照多年生簇毛麦的 7 个α-
醇溶蛋白基因序列和来自野生二粒小麦的序列
AAZ73728[15]进行分析(图 4), 结果发现, 多年生簇毛麦的
7 个序列在N末端重复序列区中与Glia-α-9、Glia-α-2 和
Glia-α-20序列对应, 发生了 1~4个氨基酸的缺失和替换。
然而在C末端的非重复序列区, 我们观察到EU186105 不
具有Glia-α序列, 其他 6 个序列中均有Glia-α序列, 表明
毒性的多肽序列在多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因中的分
布具有多样性。
2.5 系统树分析
将序列与 NCBI基因库中登录的小麦属、山羊草属物
种的种子醇溶蛋白序列进行同源性分析, 并构建系统发育
树(图 5), 从序列间的遗传距离分析, 发现多年生簇毛麦的
α-醇溶蛋白序列与小麦的 A 染色体组的α-醇溶蛋白序列
较近, 与 B染色体组来源的α-醇溶蛋白序列距离较远。聚
类分析发现来自栽培普通小麦(T. aestivum)、二粒小麦(T.
dicoccoides)及其染色体组供体一粒小麦(T. monococcum,
A 染色体组)、斯卑尔脱山羊草(Ae. speltoides, B 染色体
组)、粗山羊草(Ae. tauschii, D染色体组)的α-醇溶蛋白基
因序列被分别聚成 3大类, 而本研究获得的多年生簇毛麦
序列被单独聚为一大类 , 与小麦的醇溶蛋白基因亲缘关
系较远。因此推测所获得的多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因
序列可能为α-醇溶蛋白基因家族中的新类型。



图 3 α-醇溶蛋白的结构图
Fig. 3 Schematic structure of a α-type gliadin protein
上框表示 T型细胞抗原的序列和在序列中的位置; 图下的箭头表示半胱氨酸残基的位置。
The boxed T cell epitopes show the sequences and their approximate position in the sequences. Six conserved cysteine residues
are indicated by upward arrows.

第 6期 李光蓉等: 多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的分离与序列分析 1101




图 4 多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因序列与小麦的 AAZ73728 的推导氨基酸序列比较
Fig. 4 The deduced amino acid sequences of D. breviaristatum α-gliadin genes compared with wheat derived sequence AAZ73728
“–”表示氨酸残基的缺失; 下方短序列为 T型细胞抗原序列; 方框内为保守半胱氨酸。
“–” represents deletions of amino acids residues. The under short sequences are T cell epitopes. The boxed letters are conserved cystein residues.



图 5 α-醇溶蛋白基因的聚类分析
Fig. 5 Phylogenetic analysis of α-gliadin genes
2.6 多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因特异标记的建立
用小麦中国春和小麦-多年生簇毛麦部分双二倍体
(TDH-2)、荆州黑麦、偏凸山羊草、二倍体长穗偃麦草、
拟鹅观草、新麦草等小麦族近缘属物种的 DNA为模板进
行AS-PCR分析(图 6), 结果表明, 引物仅在多年生簇毛麦
和小麦-多年生簇毛麦部分双二倍体中得到扩增, 而在其
他小麦和小麦族近缘属物种中均不能得到扩增 , 说明获
得 AS-PCR 可以作为多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因导入
小麦的分子标记。
3 讨论
小麦族植物种子醇溶蛋白位点上存在大量的等位性
1102 作 物 学 报 第 34卷



图 6 多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因 AS-PCR 分析
Fig. 6 AS-PCR of D. breviaristatum α-gliadin genes
M: DL4500 marker; 1: 中国春; 2: 多年生簇毛麦; 3: 小麦-多年生簇
毛麦部分双二倍体 TDH-2; 4: 荆州黑麦; 5: 偏凸山羊草; 6: 二倍体
长穗偃麦草; 7: 拟鹅观草; 8: 节节麦; 9: 新麦草。
M: DL4500 marker; 1: Chinese Spring; 2: D. breviaristatum; 3:
Wheat-D. breviaristatum partial amphiploid TDH-2; 4: Secale cereale
cv. Jingzhou Heimai; 5: Aegilops ventricosa; 6: Lophopyrum elongatum;
7: Pseudoroegneria spicata; 8: Ae. tauschi; 9: Psathyrostachys fragilis.

变异, 这已被认识并被广泛运用于品种鉴定、遗传资源评
价和遗传多样性分析[11,17]。对不同类型的醇溶蛋白基因结
构的解析, 发现它们均具有保守的结构, 因而有利于对种
子醇溶蛋白家系进行分离与序列分析工作。目前对α-醇溶
蛋白基因的克隆与序列分析主要集中在含A、B、D染色体
组供体物种的小麦属物种上[12-18]。本研究利用位于小麦醇
溶蛋白编码区上游和下游区的保守序列设计引物 , 对多
年生簇毛麦的基因组DNA进行扩增, 获得了多年生簇毛
麦的α-醇溶蛋白基因序列。由于研究认为α-醇溶蛋白主要
存在于小麦属(Triticum)和山羊草属(Aegilops)的近缘属中,
不存在于大麦属 (Hordeum)和黑麦属 (Secale)之中 [10], 而
本研究从多年生簇毛麦中分离到了α-醇溶蛋白基因序列,
说明多年生簇毛麦物种的Vb染色体组和小麦的A、B、D
染色体组的亲缘关系较近, 离黑麦属的R染色体组、大麦
属的H染色体组相对较远, 这也与我们对多年生簇毛麦的
系统学分析结果相一致[7,9]。聚类分析发现, 多年生簇毛
麦不能与小麦的A、B、D染色体组的α-醇溶蛋白基因聚成
一类。多年生簇毛麦的α-醇溶蛋白基因与小麦的B染色体
组上的α-醇溶蛋白基因距离较远, 与A染色体组的蛋白较
近。
醇溶蛋白基因家系在不同小麦品种和祖先物种中
α/β-醇溶蛋白基因变化显著, 有 25~150个拷贝[13-14,21], 但
蛋白质电泳分析结果发现α/β-醇溶蛋白基因表达的较
少 [22], 其原因在于这个基因家族的许多成员产生于染色
体片段的复制和不平等交换或基因转换 , 在基因组扩增
中产生了许多假基因, 导致小麦中 50%以上醇溶蛋白基
因为假基因 , 而且这些假基因在不同染色体组中的分布
具有较大的差异[23-24]。本研究在多年生簇毛麦中分离的 7
个α-醇溶蛋白基因, 均具有α-醇溶蛋白基因的典型特征,
仅EU186105 在C末端区域与其他 6 个相比具有一个核苷
酸插入, 导致半胱氨酸的数目减少为 5 个, 可能会增加分
子间二硫键的产生 , 这类基因序列的表达将增加种子蛋
白变异的多样性。我们正在分离更多的多年生簇毛麦α-
醇溶蛋白基因序列 , 以期明确多年生簇毛麦和小麦染色
体组中α-醇溶蛋白基因的假基因的分布与基因组进化的
关系。
在小麦的α和γ型的醇溶蛋白中发现了对乳糜泻病人
具有毒性的多肽, 可以激活病人体内免疫系统中的T细胞,
刺激产生炎症 , 因而在临床上常常要求乳糜泻病人远离
具有麦醇溶蛋白或相关蛋白的食品 , 如选择没有过敏源
的小麦品种为乳糜泻病人制造食物[19-20]。最近, 在对A、
B和D组的供体物种进行分析时发现不同染色体组上的
Glia-α-2、9、20和α的分布均有不同的比例[18]。本研究表
明多年生簇毛麦的α-醇溶蛋白序列中不具有Glia-α-2, 20
序列, 而其中的 5 个序列仅具有Glia-α序列, 说明在多年
生簇毛麦的Vb染色体组上分布着醇溶蛋白毒性序列。因此,
进一步从小麦族更多物种中分离醇溶蛋白基因 , 可以阐
明醇溶蛋白基因毒性肽段序列的产生与自然、人工进化的
关系。
小麦族植物的种子醇溶蛋白 , 特别是α-醇溶蛋白 ,
不如高分子量谷蛋白亚基容易在聚丙烯酰胺胶上分离 ,
因而在外源基因转移育种中建立醇溶蛋白的分子标记较
为重要。同时由于α-醇溶蛋白常常由特定的染色体控制,
因而醇溶蛋白的特异分子标记可以用来跟踪相应的染色
体或染色体片段。Shewry等对二倍体簇毛麦的醇溶蛋白进
行了染色体定位, 其中α-醇溶蛋白存在于染色体 4V和 6V
上 , 与小麦的α-醇溶蛋白基因位于第 1 和 6 同源群不
同[25]。本研究对多年生簇毛麦的α醇溶蛋白基因序列进行
了分析, 并设计了AS-PCR引物, 能在多年生簇毛麦和小
麦-多年生簇毛麦部分双二倍体中得到扩增。我们将在小
麦-多年生簇毛麦异附加系分离的基础上, 对源自多年生簇
毛麦的α-醇溶蛋白基因进行染色体定位, 并将该AS-PCR
标记与建立的多年生簇毛麦其他标记相结合[7,9], 用于辅助
多年生簇毛麦优异基因向小麦中导入的群体分析工作中。
更多的来自多年生簇毛麦等小麦近缘属物种的醇溶
蛋白基因的克隆与序列测定工作的开展 , 将有助于了解
麦醇溶蛋白基因的系统进化、结构与功能。这些基因的分
子标记与已发现的重复序列分子标记相结合将对小麦品
质改良具有重要意义。
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