全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(10): 1798−1805 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因植物研究与产业化专项基金(JY03-B-19-2)和河南省杰出人才创新基金(022100090)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 陈新建, E-mail: xinjian@371.net; Tel: 0371-63558722
Received(收稿日期): 2009-03-25; Accepted(接受日期): 2009-06-25.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01798
小麦成熟胚脱分化过程中生长素相关基因的表达分析
陈军营 马平安 赵一丹 朱雪萍 崔 琰 张艳敏 陈新建*
河南农业大学农学院, 河南郑州 450002
摘 要: 利用 Affymetrix小麦基因芯片研究了小麦成熟胚在 MS+2,4-D (2 mg L−1)培养基上脱分化过程种基因表达变
化, 用 NCBI、DATF 和 DRTF 等生物信息学相关网站对基因表达信息进行处理, 并针对生长素相关基因的变化情况
进行分析。结果表明, 有 80个生长素相关基因在小麦成熟胚脱分化过程中的 2、6、12、24和 72 h等不同时间点, 至
少发生了一次有意义的表达变化, 其中 41个在整个过程中上调, 29个下调; 10个在不同时点分别表现上调或下调。
这些基因涉及到生长素的运输、响应、诱导、合成和降解等多个生物学过程。对 BG906698、BQ281752、CD454626、
CD864552、CD938626、BJ233383和 AY543630基因的半定量 RT-PCR验证结果表明, 它们的表达变化与基因芯片的
结果基本一致。质膜 H+-ATPase基因(AY543630)在 2 h时间点即有较高强度表达, 然后下降, 24 h降至最低水平, 表
明该基因在小麦成熟胚脱分化的启动中可能有重要作用。
关键词: 生长素相关基因; 小麦成熟胚脱分化; 质膜 H+-ATPase基因; 基因芯片
Expression of Auxin-Related Genes during Dedifferentiation of Mature Em-
bryo in Wheat
CHEN Jun-Ying, MA Ping-An, ZHAO Yi-Dan, ZHU Xue-Ping, CUI Yan, ZHANG Yan-Min, and CHEN
Xin-Jian*
College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: The quality of dedifferentiation determines the capacity of callus regeneration. Mature embryo is considered to be of
the most potential for genetic transformation, but its transformation efficiency is still lower now. To elucidate the mechanism of
mature wheat embryo dedifferentiation, we studied the expression profile of genes in dedifferentiation using Affymetrix micro-
array technique in mature embryos of wheat cultivar Yumai 18 cultured on MS medium supplemented with 2 mg L−1 of
2,4-dichlorophenolxyacetic acid (2,4-D) at different time points of 2, 6, 12, 24, and 72 h. Using online tools at NCBI, DATF, and
DRTF websites, 80 auxin-related genes changed at least at one time point were detected with the 41 up-regulated and 29
down-regulated during the whole period. The remained 10 genes showed up-regulation or down-regulation at different time points.
Up-regulated genes were more than down-regulated genes, especially at 24 h and 72 h points. These genes were involved in seve-
ral biological processes, such as transportation, response, induction, synthesis, and degeneration of auxin. Using semi-quantative
RT-PCR technique, the expression changes of seven genes, coded as BG906698, BQ281752, CD454626, CD864552, CD938626,
BJ233383, and AY543630, were confirmed to be consistent with the result by microarray. Gene of plasma membrane (PM)
H+-ATPase (GenBank accession number: AY543630) expressed at a high level at the 2 h time point, and then decreased gradually
till the minimum at the 24 h time point. This result implied that PM H+-ATPase gene might be a trigger in dedifferentiation of
mature embryo in wheat.
Keywords: Auxin-related gene; Dedifferentiation of mature embryo; Wheat; Plasma membrane H+-ATPase gene; Microarray
利用生物技术对小麦进行遗传改良进展相对缓
慢, 其主要原因是作为遗传转化受体材料的小麦幼
胚或成熟胚分化和再生能力差[1]。Dudits等[2-3]认为,
愈伤组织胚性再生能力的获得主要取决于脱分化过
程。从已分化、静止的细胞到脱分化、分裂和胚生
状态的细胞的启动很可能涉及到基因表达的“重新
编程”, 说明细胞在脱分化中可能已经获得了决定再
生的相关信息, 脱分化的质量直接决定了愈伤组织
第 10期 陈军营等: 小麦成熟胚脱分化过程中生长素相关基因的表达分析 1799


的再生能力。小麦成熟胚是最具应用潜力的转化受
体, 具有发育状态一致、取材方便、操作简单、不
受季节限制等优点, 但转化效率仍然很低。因此, 揭
示小麦成熟胚脱分化的机制, 提高其组培的再生能
力, 有望解决小麦遗传转化率极低这一瓶颈问题。
然而鉴于细胞脱分化机制的复杂, 加之研究手段相
对落后等原因, 这一问题至今尚未解决。基因芯片
的研制与应用, 为揭示脱分化过程中大规模基因的
表达变化提供了技术平台。利用基因芯片技术, Che
等 [4-5]对拟南芥根外植体诱导芽发育过程中的基因
表达进行了分析, 发现约 8 000个基因中有 2%~3%
的基因表现为上调。芽发育过程中的一些基因在任
何一个阶段都上调 4 倍以上, 其中一些激素响应基
因如 Aux/IAA 基因和 Cytokinin 响应基因分别在
CIM (callus induction medium, 愈伤组织诱导培养基)
和 SIM (shoot induction medium, 芽诱导培养基)上
表现上调。生长素是植物器官脱分化的主要诱导激
素 [6], 其相关基因在小麦成熟胚脱分化过程的变化
尚未见报道。本研究利用 Affymetrix 的小麦基因芯
片研究了脱分化过程中生长素相关基因的表达, 并
用半定量 RT-RCR 技术对部分基因表达丰度进行确
证, 为揭示小麦成熟胚脱分化的可能机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
在超净工作台上, 剥取普通小麦品种豫麦 18种
子成熟胚, 于 MS+2,4-D (2 mg L−1)培养基上培养[1],
根据本实验室对小麦成熟胚脱分化过程中外部形态
和内部结构的前期研究结果(另文发表), 确定取样
时间点为 0、2、6、12、24和 72 h。取样后经液氮
处理并于−80℃保存备用。
1.2 总 RNA提取与纯化
按 Trizol 试剂盒(Invitrogen 公司, 美国)使用说
明提取总 RNA, 并用 RNeasy mini试剂盒(QIAGEN
公司, 荷兰)纯化。用 1%琼脂糖凝胶电泳(180 V, 0.5
h)检测总 RNA的 28S和 18S比例; 其亮度约为 2∶1;
在 260/280 nm波长下测定总RNA的吸光值, 计算其
浓度和纯度[7]。
1.3 基因芯片数据的获得
1.3.1 cDNA 和 cRNA 合成 合成 cDNA 时, 模
板量为总 RNA 1~8 μg。合成生物素标记的 cRNA时,
取 12 μL 上述 cDNA 溶液作模板。纯化 cDNA 和
cRNA按基因芯片分析样品纯化操作程序[8]。两者的
浓度、纯度和质量检测方法同上[7]。
1.3.2 cRNA片段化和芯片检测 取 15 μL cRNA
(1 μg μL−1), 加 6 μL 5×片段化缓冲液和 9 μL无RNA
酶水混匀, 94 ℃温浴 35 min, 得到长度为 35~200 bp
的 cRNA 片段。按 Affymetrix 公司提供的配方配制
杂交液, 将杂交液加至经预杂交处理的 Affymetrix
wheat Gene Chip中, 于 45℃、60 r/min条件下杂交
16 h, 吸去杂交液, 用 Gene Chip全自动洗涤工作站
450 (Affymetrix 公司, 美国)对芯片洗涤和染色。用
高分辨芯片扫描仪 3000 (Affymetrix 公司, 美国)扫
描芯片, 用GCOS1.2软件读取、处理信号值数据, 获
得归一化后的信号值、信号检出(P, A, M)以及实验和
对照组的比值[9]。
1.3.3 生长素相关基因的确认 利用 NCBI (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/)、 DATF (http://datf.cbi.pku.
edu.cn/)和 DRTF (http://drtf.cbi.pku.edu.cn/)网站的相
关资料在小麦基因芯片检测结果中查找生长素相关
的基因并获取其各点的表达信号值。以不同时间点
的表达信号值除以 0 h (对照)表达信号值并取以 2为
底的对数 , 正值为上调表达 , 负值为下调表达 , 数
值 ≤ −1或 ≥ +1为有意义下调或上调差异表达。
根据基因的序列同源性 , 利用 NCBI 网站的在线
BLAST分析工具对本实验所获得的基因进行分类。
1.4 半定量 RT-PCR验证
为了验证基因芯片数据的可靠性, 将 1.2 节中
提取的 RNA反转录成 cDNA, 根据基因芯片数据对
BG906698 等 7 个基因(表 1)进行半定量 RT-PCR 验
证, 以 β-actin为内参, PCR条件为 94℃预变性 5 min,
94℃变性 30 s, 55℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 40个循
环, 72℃延伸 5 min, 4℃保存。其他 7个待测基因的
PCR条件除退火温度与内参的不同外(表 1), 均保持
一致。
2 结果与分析
2.1 小麦成熟胚脱分化过程中生长素相关基因
的数目及整体表达
Affymetrix 小麦芯片检测结果表明, 小麦成熟
胚脱分化过程中有 80个生长素相关基因发生有意义
变化, 其中 41 个在整个过程中上调, 29 个下调; 10
个在不同时点分别表现上调或下调(表 2)。在 2、6、
12、24 和 72 h 时不同时点上调的基因分别有 22、
1800 作 物 学 报 第 35卷

表 1 用于半定量 RT-PCR分析的 7个基因及其引物序列、退火温度和扩增产物
Table 1 Seven genes analyzed by semi RT-PCR and their primer sequence, annealing temperature and, product size
引物 Prime (5′–3′) GenBank登录号
GenBank acces-
sion number Forward Reversed
退火温度
Annealing temperature
( )℃
扩增产物
Product size
(bp)
BG906698 GATTCTCCCAGCCAGCAC ATAGTTTGTTTCGCCCTCC 56 102
BQ281752 CTTGCTTTGTTACCCACT AAATCACTGCCTACTTGC 50 385
CD454626 GTGCCGTTCTGTTTGTTT TTGCCTCGGTGGTGCTG 56 162
CD864552 TTCACATCGCATCCAAAC TGAGGAGGCTGTCGGTA 53 106
CD938626 TGTTGCTCAGCCTTTCTT CTTTGCCATTGTCCAGTC 53 158
BJ233383 TCCGTTGTAAACATCCAC CACTTCACATCGGTCTCA 50 158
AY543630 TCGTCCCTGCTGATGCT GAGACGAGCATCAGCAGGG 55 225
β-actin (control) GTTCCAATCTATGAGGGATAC GAACCTCCACTGAGAACAACA 55 421

23、25、26、27个, 下调的基因分别有 17、15、20、
15、14个, 上调的基因多于下调的基因, 尤其在 24 h
和 72 h时点更为明显。
2.2 生长素相关基因的功能分类
经 BLAST 分析, 所获得的 80 个基因可分为 7
类 , 分别涉及生长素运输蛋白(auxin transport pro-
teins)、生长素响应因子(auxin response factors)、生
长素诱导蛋白(auxin induced proteins)、生长素响应
蛋白(auxin responsive protein)、生长素代谢相关蛋白
(auxin metabolism related protein)、生长素合成相关
基因(auxin synthesis related genes)等功能。在其他类
别的 18 个基因中, 生长素调节蛋白(auxin-regulated
protein)基因 8 个, 生长素相关家族蛋白(auxin asso-
ciated family protein)基因 6个, 推定的不依赖生长素
的生长促进因子 (putative auxin-independent growth
promoter)基因 4个(表 2)。
2.3 生长素相关基因的表达
2.3.1 生长素运输相关基因 检测到 6 个编码生
长素运输蛋白基因, 其中, 2个编码生长素输出载体
家族蛋白(auxin efflux carrier family protein)基因中
AJ614863在 6~24 h上调, BQ161911在 2 h和 24~72
h 上调 ; 编码类生长素输出载体蛋白(auxin efflux
carrier protein-like) CD491389在 12 h下调, 72 h上调;
2 个生长素运输蛋白(auxin transport protein)基因中
CD938626在 6 h和 72 h上调; CA605718在 6~12 h
和 72 h上调; 1个编码推定生长素运输蛋白(putative
auxin transport protein)基因分别在 6 h和 72 h上调。
2.3.2 生长素响应因子(ARFs)基因 小麦成熟胚
脱分化过程中, 发现 10 个编码 ARFs 的基因, 其中,
3个编码 ARF1, 其表达方式分别是 CA737158上调,
BQ162721下调, CA486187在 24~72 h时点上调、在
2~6 h时点下调; 编码 ARF2的 AL828593在 12~24 h
下调; 编码 ARF6 的 CD452606 在 2~12 h 上调,
BQ802572在 2~6 h上调; 编码推定 ARF7a (putative
ARF7a)的 BJ248097在 12~24 h上调, 但 24 h略有下
降; 编码 ETTIN-like ARF的 AY376129和 AY376130
均在 24 h 上调; 编码推定的 ARF 家族转录因子
(putative auxin response factor)的 BJ301830在 12 h
上调。
2.3.3 生长素诱导蛋白基因 检测到 4 个生长素
诱导的 AIR3 基因表达变化 , 其中 BQ166698 和
CA728210上调, BJ260418下调, CA716340既有上调
又有下调, 编码 AIR12的 CK196827在 2~6 h上调。
10 个推定的生长素诱导蛋白(putative auxin-induced
protein)基因中 CA666109、CD864552、CD878995
和 CK195090 上 调 , CA595102 、 CA650100 、
CD882215、BJ224115和 BQ161632下调, BJ318995
既有上调又有下调。质膜 H+-ATPase基因(AY543630)
在脱分化过程中表现为上调, 其中在 2 h 时间点达
最大值, 然后表现下降。
2.3.4 生长素早期响应蛋白(Aux/IAA)基因 共
检测到 22 个 Aux/IAA 基因, 它们包含 Aux/IAA 家
族中的 3 个成员(Aux/IAA4、Aux/IAA8 和 Aux/
IAA16)。其中 , 2 个编码 Aux/IAA4 的基因中 ,
CD454626在 2~12 h中上调; CD933821在 72 h下调。
3 个编码 Aux/ IAA8 的基因中 , CA 593391 和
CA730177分别在 24 h和 72 h下调; CA617064在 2 h
上调, 72 h 下调。7 个编码 Aux/IAA16 的基因中
CA627383、CA632713、CA641371、CA644589 和
CD874934在整个过程上调; BJ237083和 CA617850
既有上调又有下调。同时还检测到 4 个 GH3 基因
BJ257699、BQ161714、CA594339 和 CK200357 均
为上调。此外, 类生长素响应蛋白(auxin-responsive
protein-like)基因 CA608508 和 BG906698 均为下调;
第 10期 陈军营等: 小麦成熟胚脱分化过程中生长素相关基因的表达分析 1801


表 2 小麦成熟胚脱分化中生长素相关基因的功能分类及表达方式
Table 2 Function classification and expression pattern of auxin-related genes in dedifferentiation of mature embryos in wheat
GenBank登录号
GenBank accession
number
0 h vs 0 h 2 h vs 0 h 6 h vs 0 12 h vs 0 h 24 h vs 0 h 72 h vs 0 h 描述
Description
Auxin transport protein related genes
AJ614863 0 0.6 1.4 1.0 1.5 0.8 auxin efflux carrier family protein
BQ161911 0 2.2 0.7 0.1 2.3 2.3 auxin efflux carrier family protein
CD491389 0 0.2 0.7 –1.8 0.6 1.5 auxin efflux carrier protein-like
CD938626 0 0.7 1.6 0.8 0.6 1.8 auxin transport protein
CA605718 0 0.8 1.5 1.3 0.9 1.9 auxin transport protein
CA653575 0 0.57 1.51 0.67 0.31 2.17 putative auxin transport protein
Auxin response factor related genes
BQ162721 0 –5.1 –0.7 –3.3 –1.5 0.2 auxin response factor 1
CA486187 0 –0.5 –1.0 –0.5 1.7 2.5 auxin response factor 1
CA737158 0 2.5 2.2 2.3 2.8 3.2 auxin response factor 1
AL828593 0 –0.3 –0.6 –1.0 –1.3 –0.2 auxin response factor 2
CD452606 0 1.60 1.45 1.00 0 –0.15 auxin response factor 6
BQ802572 0 1.5 1.4 0.9 0 –0.7 auxin response factor 6
BJ248097 0 0.1 0.9 1.3 1.1 0.7 putative auxin response factor 7
BJ301830 0 –0.6 –0.6 3.4 0.3 0.6 putative auxin response factor
AY376129 0 0.2 0.6 0.7 1.2 0.5 ETTIN-like auxin response factor
AY376130 0 –0.5 0.6 0.8 1.2 0.8 ETTIN-like auxin response factor
Auxin-induced protein related genes
BJ260418 0 –1.3 –0.5 –4.3 –0.1 –0.3 subtilisin-like proteinase AIR3
BQ166698 0 3.2 0.7 2.9 1.9 1.7 subtilisin-like proteinase AIR3
CA716340 0 –3.2 1.6 1.9 4.7 4.0 subtilisin-like proteinase AIR3
CA728210 0 2.5 2.6 2.2 2.3 2.0 subtilisin-like proteinase AIR3
CK196827 0 1.8 1.7 0.8 0.8 –0.4 auxin-induced protein AIR12
BJ224115 0 0.6 –0.3 –1.9 –0.1 –2.0 putative auxin-induced protein
BJ318995 0 1.23 –0.067 –1.033 –0.5 –1.33 putative auxin-induced protein
BQ161632 0 –2.9 –0.3 –2.0 –0.7 0.6 putative auxin-induced protein
CA595102 0 –4.0 –3.8 –2.6 –3.6 –1.4 putative auxin-induced protein
CA650100 0 –0.9 –0.9 –1.3 –1.7 –0.5 putative auxin-induced protein
CA666109 0 –0.1 2.3 0 1.5 2.8 putative auxin-induced protein
CD864552 0 0.2 0.3 1.3 0.6 0.5 putative auxin-induced protein
CD878995 0 3.0 –0.3 –0.6 0.4 0 putative auxin-induced protein
CD882215 0 –4.1 –1.2 –5.0 –4.5 –1.3 putative auxin-induced protein
CK195090 0 0.2 0.3 1.3 0.6 0.4 putative auxin-induced protein
AY543630 0 1.5 0.6 0.4 0.1 0.4 plasma membrane H+-ATPase
Auxin-responsive protein related genes
CA593391 0 –0.2 –0.4 0.3 –1.5 –0.2 auxin-responsive protein IAA8
CA617064 0 1.9 –0.9 –0.6 –0.8 –1.0 auxin-responsive protein IAA8
CA730177 0 0 –0.6 0.5 0.3 –2.1 auxin-responsive protein IAA8
CD454626 0 1.2 1.1 1.1 0.6 –0.9 auxin-responsive protein IAA4
CD933821 0 –0.65 –0.30 –0.55 –0.30 –1.35 auxin-responsive protein IAA4
BJ237083 0 1.7 0.5 0.9 0.4 –1.0 auxin-responsive protein IAA16
CA617850 0 –0.5 –0.6 2.0 –1.5 1.2 auxin-responsive protein IAA16
1802 作 物 学 报 第 35卷

(续表 2)
GenBank登录号
GenBank accession
number
0 h vs 0 h 2 h vs 0 h 6 h vs 0 12 h vs 0 h 24 h vs 0 h 72 h vs 0 h 描述
Description
Auxin–responsive protein related genes
CA627383 0 1.3 2.8 2.7 2.2 0.5 auxin-responsive protein IAA16
CA632713 0 0.7 1.3 1.8 1.4 0.7 auxin–responsive protein IAA16
CA641371 0 1.1 1.3 1.8 1.2 0.7 auxin–responsive protein IAA16
CA644589 0 1.2 0.7 1.1 0.7 0 auxin-responsive protein IAA16
CD874934 0 1 1.2 1.7 0.7 1.0 auxin-responsive protein IAA16
BJ257699 0 1.3 –0.4 2.7 2.7 3.3 putative auxin-responsive GH3
BQ161714 0 2.9 5.0 5.5 5.1 4.9 putative auxin-responsive GH3
CA594339 0 2.1 1.4 1.4 1.0 1.4 putative auxin-responsive GH3
CK200357 0 –0.1 1.2 0.2 1.7 2.3 putative auxin-responsive GH3
CA608508 0 –1.95 –1.00 –0.85 –0.50 –0.95 auxin-responsive protein-like
BG906698 0 –1.70 –1.60 –1.15 –0.50 –1.95 auxin-responsive protein-like
CA684972 0 –0.1 –2.9 2.3 3.5 2.9 putative auxin-responsive protein
CD863459 0 0.300 –0.467 1.067 1.767 1.867 putative auxin-responsive protein
CK212409 0 –0.3 –2.2 –1.8 0.9 0.9 putative auxin-responsive protein
CA642408 0 –1.3 –1.0 –0.6 0.1 –0.9 auxin-responsive protein-related
Auxin metabolism related genes
CA735632 0 0.25 0.4 0.7 0.7 1.1 IAA-Ala hydrolase
BJ260859 0 0.2 0.8 0.7 1.1 1.0 IAA-Ala hydrolase
BQ166750 0 –0.1 0.9 1.2 2.0 1.9 putative indole-3-acetate beta-glucosyltransferase
BQ281752 0 1.1 1.2 0.1 0.9 0.1 putative indole-3-acetate beta-glucosyltransferase
Auxin synthesis related genes
CK205869 0 –2.7 –2.6 0.6 –2.5 –2.0 tryptophan synthase alpha 1-like protein
AB094060 0 –0.2 1.3 0.4 1.3 –0.7 indole synthase
BE426396 0 –0.9 1.3 –1.3 1.0 0.9 indole-3-glycerol phosphate synthase
BJ266589 0 –0.4 –1.5 –0.7 0.1 –1.5 indole-3-glycerol phosphate synthase
Other categories related genes
BQ172145 0 –0.7 –0.6 –0.6 –1.8 –0.5 putative auxin-regulated protein
CA619768 0 –1.1 –0.6 –0.8 –0.5 0.3 putative auxin-regulated protein
CA623026 0 –2.1 0.3 –2.1 –0.1 –3.2 putative auxin-regulated protein
CA632541 0 –1.9 0.2 –0.2 0.3 1.5 putative auxin-regulated protein
CA659496 0 –0.15 –1.65 0.8 –0.1 –1.8 putative auxin-regulated protein
CA667105 0 –0.1 –0.9 –1.1 –0.3 –0.7 putative auxin-regulated protein
CD933359 0 –0.5 0.7 0.8 0.5 1.0 putative auxin-regulated protein
BJ263123 0 –0.5 1.9 1.9 –0.3 –0.8 putative auxin-regulated protein
CA499661 0 –1.6 –1.5 –1.7 –1.0 0 auxin associated family protein
CA622584 0 –1.60 –1.65 –1.50 –1.40 –0.25 auxin associated family protein
CA680203 0 –0.85 –0.95 –0.55 –1.7 –0.6 auxin associated family protein
CA737124 0 0.35 –0.15 0.50 1.55 2.60 auxin associated family protein
BJ212747 0 –1.6 –1.4 –1.5 –1.3 –1.1 auxin associated family protein
BJ233383 0 –2.05 –1.55 –1.75 –1.4 –0.1 auxin associated family protein
CA639823 0 1.8 –0.2 –0.3 1.9 2.3 putative auxin–independent growth promoter
CA679813 0 0.3 –0.7 –1.2 –0.1 0.6 putative auxin–independent growth promoter
CD491135 0 –0.1 –0.8 0.5 –1.4 –0.4 putative auxin–independent growth promoter
BJ238885 0 –0.1 –0.4 –0.4 –0.8 1.3 putative auxin-independent growth promoter
有意义上调用粗体字标示; 有意义下调用下画线标示。
Significant up-regulation is shown in bold. Significant down-regulation is underlined.
第 10期 陈军营等: 小麦成熟胚脱分化过程中生长素相关基因的表达分析 1803


3 个推测生长素响应蛋白(putative auxin-responsive
protein)基因中 CD863459 上调 , CK212409 下调 ,
CA684972 先下调后上调; 1 个推测生长素响应相关
蛋白(auxin-responsive protein-related)基因(CA642408)
呈下调走向。
2.3.5 生长素代谢相关基因 2 个 IAA 丙氨酸水
解酶(IAA-Ala hydrolase)基因中 BJ260859在 24~72 h
上调; CA735632在 72 h上调。2个推定的吲哚-3-乙
酸-β-葡萄糖苷转移酶(putative indole-3-acetate beta-
glucosyltransferase)基因中 BQ281752在 2~6 h上调,
BQ166750在 12-72 h上调。
2.3.6 内源生长素合成相关基因 有 4 个生长素
合成相关蛋白基因, 其中色氨酸合酶基因(CK205869)
下调; 吲哚-3-磷酸甘油合酶基因(BJ266589)在 6 h和
72 h下调; 吲哚合酶基因 AB094060和 BE426396均
在 6 h和 24 h上调, 但后者在 12 h表现下调。
2.3.7 其他类别基因 还检测到一些未知功能的
基因, 它们在成熟胚脱分化中也发生了有意义变化。
如 6个编码生长素相关蛋白家族的 EST (CA499661、
CA622584、BJ212747、BJ233383、CA680203 和
CA737124), 8 个编码生长素调节蛋白的 EST
(BJ263123、BQ172145、CA619768、CA623026、
CA632541、CA659496、CA667105和 CD933359), 4
个编码假定生长素不依赖性启动子的 EST(BJ238885、
CA639823、CA679813和 CD491135), 它们在不同时
点有不同的表达趋势, 多以下调表达为主。
2.4 半定量RT-PCR验证目的基因在脱分化过程
中的表达变化
7个基因的半定量RT-PCR分析结果与基因芯片
检测结果基本一致(图 1), 反映了基因芯片检测的准



图 1 部分基因的基因芯片结果(左)和半定量 RT-PCR验证结果(右)
Fig. 1 Gene chip results of some genes (left) and their verifications by semi RT-PCR (right)
X轴为小麦成熟胚脱分化过程, Y轴为各时点基因表达信号值与对照(0 h)比值的对数(log2); M为 DL2000 DNA marker。
X-axis represents the times course, Y-axis shows log2 ratio of the signal values of genes at different time point to control (0 h).
M: DL2000.
1804 作 物 学 报 第 35卷

确性与可靠性。
3 讨论
3.1 生长素相关基因在小麦成熟胚脱分化中的
表达
在组织培养中, 生长素是诱导愈伤组织形成的
主要植物激素, 对小麦胚脱分化形成愈伤组织起着
关键作用, 期间涉及众多基因表达的重新编程。基
因芯片技术可以“记录”此过程的基因差异表达。Che
等[4-5]在研究拟南芥芽的诱导发育过程时发现, 根外
植体在富含生长素的培养基上诱导时, 许多 Aux/IAA
基因上调。在本研究中, 小麦成熟胚脱分化过程中
的 Aux/IAA 基因, 表达方式也发生了显著变化, 大
量的 ARF 表达上调或下调, 多数 Aux/IAA 基因和
GH3基因在成熟胚脱分化中表达上调。
生长素在不同细胞间运输调节着细胞的发育命
运 [10]。本研究中检测到一些生长素运输相关基因 ,
生长素输入载体 AXR1, 生长素输出载体家族蛋白、
生长素运输蛋白等, 其多数基因发生了有意义的差
异表达, 因此推测它们在小麦成熟胚脱分化过程中
可能有重要作用。
生长素在脱分化中的作用是通过生长素信号传
导途径来实现的, 其中涉及生长素信号的感受、转
导和放大过程 , 表现为相应基因的表达调控。
Dharmasiri等[11]、Kepinski和 Leyser[12]均证明 TIR1
是生长素受体, 它的作用底物是 AUX/IAA蛋白, 生
长素能够促进它们间的相互作用。AUX/IAA蛋白通
过其 N端的 DNA结合结构域 (DNA-binding domain,
DBD) 结合生长素早期响应基因启动子区的生长素
响应元件, 抑制或激活基因表达 [13-14], 目前发现的
生长素早期基因主要包括 Aux/IAA、GH3和 SAUR
(small auxin-up RNA) 3类[15]。本研究中, 生长素响
应因子、生长素诱导的早期基因和诱导蛋白基因表
达活跃; 色氨酸是内源生长素合成的前体, 脱分化
过程中内源生长素代谢也非常活跃, 如色氨酸合酶
基因分别在成熟胚脱分化的 6 h 和 24 h时间点明显
上调; IAA-Ala 水解酶基因和吲哚-3-乙酸-β-葡萄糖
苷转移酶基因(除BQ166750在 2 h 略有下调外)在脱
分化的各时间点不同程度上调, 说明生长素通过代谢
及其信号传导途径等参与了小麦成熟胚脱分化过程。
此外, 生长素诱导的小麦胚脱分化中, 许多功
能未知蛋白如类生长素调节蛋白等基因的一些复杂
变化及这些下调的基因与脱分化的关系, 也值得深
入研究。
3.2 质膜 H+-ATPase 基因在小麦成熟胚脱分化
中的表达
Hager等 [16-17]提出 “酸生长理论 ”(acid-growth
theory)来解释生长素诱导的细胞伸长生长机制, 认
为活化态的生长素激活质膜 H+-ATPase, 提高细胞
壁中的 H+浓度, 导致“软化细胞壁的酶”活性提高,
从而引起细胞的伸长生长。生长素诱导的植物组织
脱分化的机制迄今还没有一个令人信服的学说给以
合理的解释。本研究表明, 在生长素诱导的脱分化
过程初期质膜 H+-ATPase 基因(AY543630)的表达异
常活跃, 并在 2 h达到最大值, 因此, 质膜 H+-ATPase
参与了生长素诱导的脱分化过程。在脱分化初期
(2 h), 生长素通过某种信号传导途径诱导了 PM H+-
ATPase 基因的强烈表达和酶活性增加, 引起细胞壁
酸化; 同时导致细胞质碱化, 从而可能刺激控制细
胞分裂周期的关键酶或蛋白因子的变化, 启动细胞
基因表达的“重新编程”, 使脱分化得以进行。所以生
长素诱导的 PM H+-ATPase 基因表达可能对脱分化
具有启动作用。
脱分化是细胞由相对静止的分化状态向剧烈运
动状态裂变的过程, 这个过程需要启动细胞内一系
列重要的生化反应。这些生化反应又发生在细胞内
不同部位, 而催化这些不同生化反应的蛋白质或酶
的激活需要特定的 pH。由于细胞内不同部位所进行
的生化反应不同, 要全面启动、统一协调这些蛋白
质的活性, 最简单有效的方式是改变细胞内不同区
域的 pH, 而其主要调节者是 PM H+-ATPase。目前,
本课题组正在对小麦成熟胚脱分化过程中细胞内外
pH的变化进行研究, 以期为揭示脱分化的分子机制
提供更有利的证据。
4 结论
小麦成熟胚脱分化涉及生长素运输、响应、诱
导、合成和降解等相关基因的表达变化, 其中, PM
H+-ATPase基因对脱分化的启动可能有重要作用。
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