全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(4): 587594 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30570995)，国家转基因植物研究与产业化专项(2008ZX08010-004)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目
(2006AA100101)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 万建民, E-mail: wanjm@caas.net.cn
Received(收稿日期): 2010-10-28; Accepted(接受日期): 2011-01-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00587
番茄冷诱导基因 SlCMYB1的克隆及其在水稻中异源表达研究
张 欣 1 程治军 1 林启冰 1 王久林 1 万建民 1,2,*
1 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 2 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 江苏省植物基因工程技术
研究中心, 江苏南京 210095
摘 要: 从番茄中克隆了一个编码 MYB转录因子家族 R2R3-MYB亚类基因 SlCMYB1。不同逆境胁迫下的表达模式
分析结果表明, 该基因受低温、高盐、干旱和 ABA胁迫诱导表达。洋葱表皮亚细胞定位研究表明, SlCMYB1为核定
位蛋白。为深入了解 SlCMYB1基因与非生物逆境应答的关系, 我们构建了 SlCMYB1基因过表达载体来转化水稻, 获
得了 16个转基因水稻株系。SlCMYB1在水稻中异源表达能显著提高转基因水稻植株的苗期抗冷性, 增加脯氨酸合成
的关键酶基因 OsP5CS1, 膜转运蛋白基因 OsWCOR413 等低温胁迫应答基因的表达水平, 这暗示着 SlCMYB1 与
OsP5CS1、OsWCOR413基因处于同一低温调控信号转导路径。本研究结果为通过遗传工程操控低温信号通路的方法
改良冷敏感植物抗冷性提供了理论基础。
关键词: R2R3-类型 MYB转录因子; SlCMYB1; 水稻; 抗冷性
Cloning of Cold-Inducible Gene SlCMYB1 and Its Heterologous Expression in
Rice
ZHANG Xin1, CHENG Zhi-Jun1, LIN Qi-Bin1, WANG Jiu-Lin1, and WAN Jian-Min1,2,*
1 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 State Key Laboratory of Crop Genetics and
Germplasm Enhancement / Jiangsu Plant Gene Engineering Research Center, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: We isolated a cDNA clone, designated SlCMYB1 (for Solanum lycopersicum Cold MYB1), from tomato by analyzing
the previous microarray data of the low temperature transcriptome of tomato. SlCMYB1 encodes a R2R3-MYB family gene,
which contains a conserved DNA-binding domain composed of two repeat motifs. The SlCMYB1-GFP fusion protein was localiz-
ed to the nucleus in a transient expression assay. Expression of SlCMYB1 was not only strongly induced by cold and salt, but also
by dehydration and abscisic acid (ABA). To understand function of SlCMYB1 in crop plants under stress conditions, we generated
transgenic plants in rice over-expressing SlCMYB1 under control of the CaMV 35S promoter. Preliminary results showed that
overexpression of SlCMYB1 in rice induced constitutive expression of the cold-responsive gene OsP5CS1 and OsWCOR413 and
might be conferred enhanced tolerance to cold treatments for non-acclimated transgenic plants, compared with wild type plants.
Our data suggest that SlCMYB1 might play an important role in plant responses to cold stress by regulating cold-responsive gene
expression and might be a useful gene for improving cold tolerance in crop plants.
Keywords: R2R3-type MYB transcriptional factor; SlCMYB1; Rice; Cold tolerance
MYB 基因是植物基因组中最大的转录因子家族
之一, 参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的
应答, 对细胞分化、细胞周期、器官形态建成具有
重要的调节作用[1-9], 在植物低温等逆境胁迫应答过
程中也起着重要的调控作用[10-14]。Zhu等[10]利用一个
与低温、干旱、盐胁迫应答有关的突变体 hos10 克
隆了HOS10基因, 该基因编码一个 R2R3-类型MYB
转录因子。在低温胁迫时, 突变体中与低温响应有
关的基因 CBF1、CBF2、CBF3 表达量没有改变 ,
HOS10在低温胁迫条件下可控制ABA合成, 影响植
物抵御渗透胁迫的能力。另一个 R2R3类型 MYB转
录因子 AtMYB15, 受低温诱导表达, 可以通过调控
CBF 基因提高拟南芥植株的抗寒性[11]。Tian 等[12]和
Liao等[13]对 156个大豆 MYB基因进行低温、干旱、
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盐及 ABA胁迫转录谱分析, 发现其中 6个基因对所
有胁迫均有应答, 43个基因至少受一种胁迫诱导表达,
3 个基因 GmMYB76、GMMYB92 和 GmMYB177 在拟
南芥中过表达, 可以提高转基因植株抗寒性或抗盐
性。Dai 等[14]从抗冷性水稻 Yuedongdao 中克隆到
R1R2R3-MYB转录因子基因 OsMYB3R-2, 其过量表
达提高了拟南芥转基因植株对冻害、干旱和高盐的
耐受性。
番茄是茄科重要的经济作物, 有关逆境胁迫的
MYB类基因的克隆和功能分析还鲜有报道。在前期
分析番茄低温转录谱时, 我们发现了一个受低温高
度诱导而不受CBF调控的MYB转录因子 SlCMYB1。
生物信息学分析发现 , SlCMYB1 编码一个 R2R3-
MYB转录因子, 在辣椒、茄子、拟南芥中具有其高
度同源的未知功能基因。本文对 SlCMYB1基因进行
了结构和功能分析, 并转化到水稻品种 Kitaake 中,
研究了过表达转基因植株的耐冷性, 探讨了利用该
基因改良作物抗冷性的可能途径。
1 材料与方法
1.1 试验材料及逆境胁迫处理
普通番茄(Solanum lycopersicum var. D. Huang)
由黑龙江省农业科学院园艺分院郭亚华研究员提
供。采用 20%的 Bleach溶液处理 20 min表面消毒种
子 , 用蒸馏水冲洗 4 遍后 , 将番茄种子播种在
Murashige and Skoog (MS)培养基上 , 置生长箱中
(温度 26℃, 昼夜时数 16 h/8 h)培养 3周后, 分别进
行低温(4℃)、干旱、高盐(250 mmol L1 NaCl)等不
同胁迫及植物激素 ABA (100 μmol L1)处理, 具体
处理方法参照 Zhang等[15]进行。分别在处理 0、1、
2、4、8、16、24 h取样, 其中对冷处理材料分别在
0、2、24、168 h取样。同时对未经胁迫处理的番茄
苗在相应时间点平行取样作为对照。取样小苗经液
氮冷冻后贮于80℃, 用于提取总 RNA。
1.2 试剂、质粒和菌株
限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、逆转录酶
AMV、pMD18-T 载体、Taq DNA 聚合酶均购自
TaKaRa公司; 凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购
自天根生物公司。大肠杆菌 DH5α、农杆菌菌株
EHA105由本实验室保存。氨苄青霉素、卡那霉素、
利福平购自上海生工公司。LB 培养基含 1% tryp-
tone、0.5% yeast extract、0.5% NaCl, pH 7.0 (固体培
养基另加 1.5%的琼脂粉)。
1.3 全长 cDNA的获得及过表达载体构建
为验证从番茄低温表达谱中鉴定出的受低温上
调表达的基因 , 从 Clemson University Genomics
Institute订购了若干个 EST克隆, 经测序发现其中 1
个 EST 克隆(AW218933/TC233483)含有 1 个完整的
开放阅读框。构建过表达载体所用引物为前引物
5′-ATCTAGAATGGCTCTTGAAGCTTTGAATTC- 3′,
加 Xba I 酶切位点 ; 后引物 5′-GAGCTCCTAAT
CGAATTTGCTTAGTC-3′, 加 Sac I 的酶切位点, 用
高保真酶从番茄 EST clone (登录号为 AW218933)扩
增出包含全部编码区的目的基因片段, 构建携带有
SlCMYB1基因的质粒载体 pMD18-B。用 Xba I和 Sac
I酶切后, 将片段连接到经同样酶切 pBI121, 经酶切
和测序鉴定, 新构建的过表达载体被命名为 PXIN3,
由 35S启动子驱动。
1.4 SlCMYB1序列生物信息学分析
通过 BLAST 程序进行同源序列搜索 , 采用
DNASTAR、DNAMAN对序列进行比对及氨基酸序
列分析。R2R3-MYB 家族的氨基酸同源序列比对分
析, 下载 GenBank已有的与抗逆相关的 R2R3-MYB
蛋白同源序列 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), 加入
SlCMYB1 序列后运用 ClustalW 程序(http://www.
ebi.ac.uk/clustalw/)进行氨基酸序列的多重比对。然
后使用 MEGA 软件 (Version 4.0) (http://www.
megasoftware.net/index.html)[16]构建进化树。
1.5 亚细胞定位
采用GFP标签技术, 通过平末端与 Spe I酶切片
段构建目的基因 cDNA与 GFP融合基因的植物表达
载体 pSlCMYB1-GFP, 通过基因枪转化法转化洋葱
表皮细胞, 研究目的蛋白 SlCMYB1的亚细胞定位。
利用 Primer Premier 5 软件, 设计一对特异性引物
5′-CGCTCTAGAATCAATCACATGGCTTTGGA-3′
(含 Xba I酶切位点)和 5′-CGCGGATCCTATTGACC
AGTATTGAGGGATTTC-3′ (含 Bam HI 酶切位点),
扩增 SlCMYB1 的开放阅读框(ORF), PCR 产物经
Xba I和 Bam HI双酶切后, 插入到 pBI121 (Clontech,
USA)载体中, 产生 SlCMYB1::GFP融合蛋白。以融
合载体热激转化大肠杆菌 DH5α, 阳性克隆经 PCR
验证, 进一步提取质粒, 转化农杆菌 EHA105。利用
农杆菌介导法将目标基因转化至洋葱表皮细胞中 ,
用激光共聚焦显微镜观察, 不含目的基因的空载体
为对照。
1.6 农杆菌介导的水稻转化
将已构建的包含 35S::SlCMYB1 过表达转基因
第 4期 张 欣等: 番茄冷诱导基因 SlCMYB1的克隆及其在水稻中异源表达研究 589


载体 PXIN3, 通过农杆菌介导法转化水稻。以农杆
菌菌株 EHA105为介导, 将重组基因的 cDNA序列
导入受体材料 Kitaake中[17]。
1.7 转基因植株 PCR检测
取水稻转化植株叶片, 以 CTAB 法提取 DNA,
TE 溶解后贮存于80℃冰箱备用; 根据 SlCMYB1-
cDNA 序列设计特异性引物 , 对上述植物基因组
DNA进行特异性 PCR扩增, 1.0%凝胶电泳鉴定扩增
产物。引物组合 F: 5′-ATCTAGAATGGCTCTTGAA
GCTTTGAATTC-3′; R: 5′-GAGCTCTTAAATGGCT
CTTGAAGCTTTGAATTC-3′
1.8 转基因植株 Northern blot杂交分析
选择野生型和经 PCR 检测确认的转 SlCMYB1
基因水稻阳性植株, 分别提取幼嫩叶片总 RNA, 以
SlCMYB1 全长 cDNA 为探针, 对转基因植株进行过
表达水平分析。参考 Zhang等[15]的 Northern blot转
膜、预杂交、杂交和探针制备方法。
1.9 半定量 RT-PCR分析
分别取水稻野生型及高表达 SlCMYB1转基因株
系的叶片, 使用 RNeasy Plant Total RNA Isolation
Kit (Qiagen, Germany)提取总 RNA, 对受 SlCMYB1
调控的下游胁迫应答基因进行 RT-PCR 分析, 基因
信息及特异引物见表 1。RT-PCR 扩增程序为 95℃
预变性 5 min; 95℃变性 30 s, 55℃复性 30 s, 72℃延
伸 1.5 min, 共 28个循环; 最后 72℃延伸 10 min。
PCR 产物经 2%凝胶电泳后定量。独立反转录 2 次,
每次 3个重复。
1.10 水稻转基因植株苗期抗冷性鉴定
将 SlCMYB1过表达株系和野生型播种培养水稻
秧苗, 在正常条件生长 4 周后, 将这些水稻苗转移
到 4℃生长箱(16 h光照和 8 h黑暗, 光照强度为 100
μmol m2 s1)处理 6 d, 再转移至正常温度, 恢复生
长 6 d后分别照相和统计存活率。
2 结果与分析
2.1 SlCMYB1基因的克隆与序列分析
通过筛选番茄 EST克隆分离得到 1 个 R2R3 型
MYB类基因 SlCMYB1。测序结果表明, 该 EST的长
度为 1 366 bp, 含有 1个 1 119 bp的 ORF, 编码 372
个氨基酸。在 MYB 域的下游有 1 个富含赖氨酸(K)
和精氨酸(R)的结构域 KRK(推测是 1 个核定位信号
区), 在 C-末端 158~254氨基酸处存在 1个富含丝氮
酸(S)的酸性活化区域。将 SlCMYB1 氨基酸序列与
拟南芥中同源基因 A t M Y B 4 4、A t M Y B 7 0 和
AtMYB77 的蛋白进行比对(图 1), 发现该蛋白的 2
个 MYB 结构域-R2R3 非常保守, 分别由 45 个氨基
酸和 47 个氨基酸组成 R2 和 R3 重复单位。这些结
果表明, SlCMYB1 具有典型转录因子结构特征, 为
含 2个 MYB结构的 R2R3-MYB亚类成员。该亚类
是 MYB 基因家族中的主要类型, 广泛参与植物的

表 1 水稻逆境胁迫诱导基因和受水稻 CBF/DREB调控表达基因信息及 RT-PCR特异引物
Table 1 Information about rice stress-responsive genes and respective primers for RT-PCR used in this work
引物序列 Primer sequence (5′–3′) 基因名称
Gene name F R
序列号 1)
Accession number1)
OsWCOR413-like GAGGTGGAGGAGGCTAG GGGGATAATCACATAAGAG AF283006
OsGOLS3 ACTGGAAGGGCGTCGTG TTGGGGATGGGCTTGTAC AK107065
OsUSP1 CTCCATCTCGCCACATTCG GCCACTACGGTAAGCTCCAA AK063881
OsCOR410 AGAAGAAGGGGCTCAAGGAGAAG CCATGATCTTGCCCAGTATACCC NM_001054224
OsDhn1 AGCTCAAACAAGTCAAGAGC AAGCACCAAACTAACACACG AY786415
Os14-3-3 CGATGGTATCCTGAAGTTGCTTG CTTGGAGGCTTCTTTCACCTCAT U65957
OsLEA14-2 ATGGACAAGGCGAAAGGG GATCGGAGTTGGTTGATGAGA AK061818
OsMAT2 GGAGTCTGTGAACGAGGGC GACACCGATGGCGTATGAT AK103157
OsLip5 GGAAGACGAGCACAAGAAGG TGCATCACGTATTGCACAGA AB011368
OsLip9(Dip1) AGAAGGGCTTCCTCGACAAGAT TACCCCACACGAAACACAAACTT AY587109
OsLEA4 TCGAGCAAAATCCATCAGAGTTC ATGGCAGAGTCCTTGGTGTACTG AK119713
OsLit6a AGCTGGGAACAAGCAGAAGA AAGGTACCCCGGAAGAACAG AY607689
OsLit6b AATACTGCGAGAGAAATTAATCA TAAGAGGGGAGCTTATTCACAC AY607690
OsRD22 CTAGGTCTCTCGCTGCTCTCCT GCGCAGTAGTGCTTGTGCTTG NM_001061473
OsP5CS TGGATGTCTCGTCATCTCAACT AAGCCAAGACAGCAGCCTTCAC D49714
Actin TGGAACTGGTATGGTCAAGGC AGTCTCATGGATACCCGCAG D87740
1) 基因序列号为本研究涉及到相关基因全长 cDNA序列 GenBank登录的序列号。
1) GenBank accession numbers for full-length cDNA sequences of corresponding genes.
590 作 物 学 报 第 37卷

各种生命活动, 如植物次生代谢的调控、对激素和
环境因子的应答[18-20]。
将 SlCMYB1 氨基酸序列与来自其他植物的逆
境胁迫相关 MYB 基因进行同源性比较及系统进化
分析, 结果显示 SlCMYB1 与来自青椒的 CaMYB1,
大豆的 GmMYB112、 GmMYB50 及拟南芥的
AtMYB73、AtMYB44 等具有高度同源性。在氨基
酸水平上, SlCMYB1与 CaMYB的同源性达 95.3%,
与 GmMYB112 的同源性为 73.2%, 与拟南芥
AtMYB73 和 AtMYB44 的同源性分别为 64.7%和
64.2%。系统进化树分析表明, SlCMYB1与拟南芥的
AtMYB44、AtMYB70、AtMYB72 和 AtMYB73 等
基因同属于第 22 亚族, 其保守氨基酸为 GEFMtVV
QEMlkEVRSYM(图 2)。



图 1 SlCMYB1与拟南芥 AtMYB44、AtMYB70、AtMYB77的序列比对分析
Fig. 1 Alignment of the deduced amino acid sequence of tomato SLCMYB1 with Arabidopsis AtMYB44, AtMYB70, and AtMYB77
R2和 R3保守域以黑线标出, 三角符号标注表示 MYB结构域中保守的色氨酸(W)残基。
Boxes and lines indicate R2 and R3 domain, and the triangles indicate the W sites.



图 2 SlCMYB1和其他 MYB家族蛋白的氨基酸序列的系统进化树分析
Fig. 2 Phylogenetic analysis of SlCMYB1 with those of the related plant MYB proteins
CaMYB1 (Capsicum annuum, AAR83899); soybean GmMYB112 (Glycine max, ABH02852), GmMYB50 (ABH02824); CsMYB1 (Citrus
sinensis, ABQ10817); Arabidopsis thaliana AtMYB73 (NP_195443), AtMYB70 (CAA90809), AtMYB44 (CAA90809).
第 4期 张 欣等: 番茄冷诱导基因 SlCMYB1的克隆及其在水稻中异源表达研究 591


2.2 SlCMYB1-GFP融合蛋白的亚细胞定位
根据全长 cDNA推测出的 SlCMYB1蛋白, 含有
一个潜在的核定位信号(NLS, nuclear localized sig-
nal)。为了研究 SlCMYB1 蛋白的亚细胞定位, 将去
掉终止密码子的 SlCMYB1 编码框连接在绿色荧光
蛋白GFP的N端, 构建 pSlCMYB1-GFP融合蛋白表
达载体, 使之在 35S 启动子驱动下表达。以基因枪
方法转化洋葱表皮细胞, 激光共聚焦显微镜观察结
果表明, 在融合蛋白表达载体转化的洋葱表皮细胞
中, 绿色荧光集中分布在细胞核中; 而仅转 GFP 的
对照洋葱表皮细胞中, 绿色荧光在细胞核和细胞质
中均有分布(图 3)。



图 3 SlCMYB1蛋白的亚细胞定位
Fig. 3 Nuclear localization of the SlCMYB1 protein
CaMV35S::GFP(上图)为空载体对照, CaMV35S::SlCMYB1-GFP(下图)为 SlCMYB1-GFP融合载体。
Constructs carrying 35S-GFP (upper panel), or 35S-SlCMYB1-GFP (lower panel) was introduced into onion epidermal cells. Transformed
cells were observed by fluorescence microscopy (left), optical (middle), and merged (right).

2.3 SlCMYB1在不同逆境胁迫下的表达模式分析
为了解 SlCMYB1基因对非生物胁迫和外源植物
激素处理的表达特性, 对番茄品种组培大黄 4 周龄
幼苗进行了低温(4℃)、高盐(250 mmol L1)、干旱以
及 ABA等胁迫处理。在不同处理时间, 分别提取其
总 RNA, 用 Northern杂交技术分析冷处理不同时序
SlCMYB1 表达量的变化。结果显示, 低温处理 2 h
后, SlCMYB1 表达水平迅速提高, 随着处理时间的
延长, 表达量迅速增加, 到 24 h 达到最大值, 之后
开始下降, 但直至 168 h表达量仍明显高于对照, 同
LeCBF1相比, SlCMYB1受低温诱导无论在表达水平
及持续的时间上, 均明显强于 LeCBF1 (图 4-A)。此
外, SlCMYB1 的表达还受到 NaCl、干旱胁迫以及
ABA诱导。在高盐胁迫诱导下, SlCMYB1在处理 1 h
时就开始表达, 表达水平在 2 h达到最高峰, 并维持
高表达水平至 8 h, 然后迅速下降, 到 24 h基本恢复
到初始 1 h的表达水平; 在干旱处理时, SlCMYB1在
处理 1 h开始表达, 在 2~4 h达到最高水平, 然后开
始下降, 到 8 h则回到初始表达状态(图 4-B); 在ABA
处理条件下, SlCMYB1在 1~2 h开始表达, 到 8 h达到
最高水平, 然后迅速下降, 到 16 h 又回到不表达状
态。上述研究结果表明, SlCMYB1不仅受低温、高盐
胁迫诱导高表达, 也受干旱和 ABA 诱导微弱表达,
说明 SlCMYB1在应答低温、高盐、干旱胁迫时的表
达可能是依赖于 ABA途径的。



图 4 SlCMYB1基因不同逆境胁迫表达模式 Northern分析
Fig. 4 Accumulation of SlCMYB1 transcripts in response to
abiotic stresses
A: SlCMYB1低温不同时序表达谱分析; B: SlCMYB1在干旱、盐
及 ABA条件下时序表达谱分析
A: Accumulation of SlCMYB1 transcripts in response to cold.
LeCBF1: a positive control for cold treatments; B: Accumulation of
SlCMYB1 transcripts in response to drought, NaCl and ABA. For
the control samples, the plants were transferred to filter paper satu-
rated with MS solution and incubated in parallel with the experi-
mental samples. RNA gel blots were prepared from total RNA and
hybridized with gene probes for SlCMYB1. rRNA served as a con-
trol for RNA loading.
592 作 物 学 报 第 37卷

2.4 SlCMYB1基因在水稻中的表达研究
将 35S::SlCMYB1 双元表达载体通过农杆菌介
导的方法转化水稻(Kittake), 获得 20株 T0代独立转
化个体 , 经 PCR 分子检测 , 有 16 株阳性植株。
Northern 杂交结果表明, 这 16 个植株都不同程度地
表达外源基因 SlCMYB1 (图 5-A), 其中第 1、第 6、
第 8、第 11、第 15和第 20转基因株为高表达植株。
我们选用后代种子量较多的第 1、第 15 和第 20 转
基因植株进行纯系筛选, 发现转基因植株和对照植
株株型类似, 没有明显的农艺性状差别(图 5-B)。
不同逆境胁迫 Northern 分析结果表明, SlCMYB1
基因是受低温、干旱以及高盐等逆境诱导的, 推测
其可能参与逆境的应答反应, 在逆境应答过程中起
重要的调控作用。因此, 我们首先对水稻过表达植
株的 T2 代纯系也进行了苗期低温胁迫鉴定, 将正
常条件下生长 4周的野生型水稻和过表达 SlCMYB1
水稻 4℃低温处理 6 d, 然后在 28℃正常条件下恢
复生长约 6 d。结果表明, 低温胁迫处理前, 转基因
植株和对照株相比没有明显表型差异, 当将经冷处
理的水稻恢复到正常生长条件 1周后, 转 SlCMYB1
的水稻能很快地恢复生长发育, 而对照植株逐渐枯
萎死亡(图 5-C)。转基因株系 1、15、20 的成活率
分别为 79.6%、83.0%和 90.2%, 而对照的成活率仅
为 12.6%(图 5-D)。这些结果表明, SlCMYB 在水稻
中异源表达能够显著提高苗期对低温胁迫的耐受
能力。
为了明确过表达 SlCMYB1提高植株抗冷性的分
子机制, 进一步分析了水稻逆境胁迫应答基因的表
达, 在转基因植株中观察到了 OsP5CS1 (AK063881)
和 OsWCOR413 (AF283006)的表达增加(图 6), 其他
基因的表达水平没有明显变化(data not shown)。
3 讨论
在植物响应和传递逆境胁迫的信号传导系统中,
转录因子起着相当重要的作用, 它通过接受信号级
联的某种刺激而调控下游逆境胁迫相关基因的表达,



图 5 转 SlCMYB1基因水稻株系的分子检测和耐冷性鉴定
Fig. 5 Identification and cold-tolerance testing of SlCMYB1-overexpressing rice
A: 转基因植株和野生型的 Northern杂交分析; B: 处理前转基因植株和对照株表型; C: 经冷处理(4℃, 6 d)后恢复 6 d的植株表型, 对
照明显受害; D: 成活率调查结果。
A: RNA gel-blot analysis of part of the transgenic plants and the wild type. B: transgenic and wild-type plants before cold treatment.
C: performance of cold tolerance of three transgenic lines and wild-type plants after cold treatment (4℃ for 6 d) and recovery (25℃ for 6 d).
D: survival rate of three transgenic lines and the wild type after cold treatment. Both wild-type and SlCMYB1-expressing lines 1, 15, and 20
were incubated at 4℃ for 6 d and recovery at 26℃.
第 4期 张 欣等: 番茄冷诱导基因 SlCMYB1的克隆及其在水稻中异源表达研究 593




图 6 SlCMYB1转基因水稻植株逆境胁迫诱导相关基因
RT-PCR分析
Fig. 6 RT-PCR analysis of 15 stress-responsive genes in
SlCMYB1 transgenic rice plants
OsP5CS1和 OsWCOR413正常生长条件下在野生型植株和转基
因植株中的表达。WT: 野生型; 1、15和 20为转基因株系, Actin
为内参对照。
Expression of OsP5CS1 and OsWCOR413 in WT and SlCMYB1
transgenic rice plants under normal condition. Actin was used as an
internal control. WT: wild type; 1, 5, and 20: SlCMYB1-overex-
pressing lines. The experiments were repeated three times. The results
shown were representative of the three replicates.

从而使植物适应或抵御环境胁迫。我们通过分析番
茄低温转录谱, 从中筛选出 1 个受低温高度诱导的
MYB类型转录因子 SlCMYB1, 并通过筛选 EST克隆,
获得该基因的全长 cDNA。序列分析表明, SlCMYB1
与其他MYB家族转录因子在 DNA结合域具有很高
的保守性, 属于典型的 R2R3类型 MYB转录因子。
系统进化分析表明 , SlCMYB1 与 AtMYB44、
AtMYB70、AtMYB77和 AtMYB73同属于第 22亚族。
该亚族的 MYB 转录因子的功能多数与逆境胁迫相
关。如 AtMYB44 受低温、干旱、ABA、NaCl 的诱
导, 而 AtMYB70 受 ABA、乙烯、茉莉酸、NaCl 的
诱导[22-23], AtMYB73 受低温诱导[24]。因此我们推测
SlCMYB1 也可能与低温、干旱、高盐等非生物胁迫
有关。
SlCMYB1基因在不同逆境胁迫下的 Northern表
达分析表明, SlCMYB1 在低温胁迫下, 诱导表达水
平明显高于 LeCBF1 基因, 并且其表达持续时间也
明显长于 LeCBF1[15]。与 LeCBF1不同, SlCMYB1基
因不仅受低温、高盐和干旱的诱导, 而且也受外源
激素 ABA 的诱导。并且 SlCMYB1 基因的转录水平
受低温、NaCl 诱导的变化明显强于干旱和 ABA 诱
导。结合以往研究发现, LeCBF1在番茄上过表达不
能激活 SlCMYB1 基因的表达, 说明 SlCMYB1 不是
LeCBF1的下游靶基因[15]。因此, 我们推测, SlCMYB1
基因很有可能参与低温、盐渍和干旱等多种胁迫应
答途径, 并且 SlCMYB1对低温信号诱导是不受 CBF
调控的[15]。然而, SlCMYB1是否位于 LeCBF1的上游,
能否调控 LeCBF1基因的表达, CBF1和 SlCMYB1 在
调控冷信号转导途径上是否各自处于平行独立的路
径还需要进一步的工作来确证。
进一步利用过表达 SlCMYB1基因验证该基因的
功能。过量表达 SlCMYB1基因可显著提高水稻苗期
对低温胁迫的耐受能力, 对转基因植株与胁迫相关
的几个基因初步分析发现, 水稻中过表达 SlCMYB1
可以提高 OsP5CS1 和 OsWCOR413 基因的表达。
P5CS1(Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶基因)是脯氨酸合成
过程中的 1 个限速酶[25-26]; COR413 基因编码膜转运
蛋白, 可感应外界信号, 对稳定原生质膜起作用[27-28]。
这些结果表明, SlCMYB1可能通过调节 P5CS基因和
OsWCOR413 基因的表达, 控制植物体内脯氨酸的
积累及改善膜通透性以提高植物的抗冷性。研究还
发现, 转基因植株和对照植株无论在正常条件和胁
迫条件下, SlCMYB1 过表达都没有影响农艺性状的
表型, 推测 SlCMYB1是一个与植物抗冷相关的正调
节因子, 可以应用于作物的抗冷性遗传改良上。有
关 SlCMYB 基因在抗盐、抗旱等其他逆境胁迫方面
的作用尚有待进一步研究。
4 结论
从番茄中分离得到 1 个 MYB 类新基因
SlCMYB1。它是典型的植物 R2R3型 MYB转录因子,
不含内含子, 含有 2个典型的 MYB结构域, 定位在
细胞核中。它的表达受高温、干旱、盐和 ABA胁迫
的诱导。SlCMYB1 基因过表达可显著提高水稻苗期
对低温胁迫的耐受能力。转 SlCMYB1基因植株中低
温胁迫应答基因 OsP5CS1、OsCOR413 等表达水平
明显增加, 推测 SlCMYB1 可能通过调节 P5CS 基因
和 OsWCOR413的表达以提高植物的抗 冷性。
References
[1] Rubio V, Linhares F, Solano R, Martín A C, Iglesias J, Leyva A,
Paz-Ares J. A conserved MYB transcription factor involved in
phosphate starvation signaling both in vascular plants and in
unicellular algae. Genes & Dev, 2001, 15: 2122–2133
[2] Paz-Ares J, Ghosal D, Wienand U, Peterson P A, Saedler H. The
regulatory CI locus of Zea mays encodes a protein with homo-
logy to myb oncogene products and with structural similarities to
transcriptional activators. Eur Mol Biol Organi J, 1987, 6: 3553–
3558
[3] Golay J, Basilico L, Loffarelli L, Songia S, Broccoli V, Introna M.
Regulation of hematopoietic cell proliferation and differentiation
by the myb oncogene family of transcription factors. Int J Clin
Lab Res, 1996, 26: 24–32
[4] Loguerico L L, Zhang J Q, Wilkins T A. Differential regulation
594 作 物 学 报 第 37卷

of six novel MYB-domain genes defines two distinct expression
patterns in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum L.). Mol
Gen Genet, 1999, 261: 660–671
[5] Miyake K, Ito T, Senda M, Ishikawa R, Harada T, Niizeki M,
Akada S. Isolation of a subfamily of genes for R2R3-MYB tran-
scription factors showing up-regulated expression under nitrogen
nutrient-limited conditions. Plant Mol Biol, 2003, 53: 237–245
[6] Waites R, Selvadurai H R, Oliver I R, Hudson A. The
PHANTASTICA gene encodes a MYB transcription factor in-
volved in growth and dorsoventrality of lateral organs in Antir-
rhinum. Cell, 1998, 93: 779–789
[7] Stracke R, Werber M, Weisshaar B. The R2R3-MYB gene family
in Arabidopsis thaliana. Curr Opin Plant Biol, 2001, 4: 447–456
[8] Rabinowicz P D, Braun E L, Wolfe A D, Bowen B, Grotewold E.
Maize R2R3-Myb genes: sequence analysis reveals amplification
in the higher plants. Genetics, 1999, 153: 427–444
[9] Cedroni M L, Cronn R C, Adams K L, Wilkins T A, Wendel J F.
Evolution and expression of MYB genes in diploid and polyploid
cotton. Plant Mol Biol, 2003, 51: 313–325
[10] Zhu J, Verslues P E, Zheng X, Lee B H, Zhan X, Manabe Y,
Sokolchik I, Zhu Y, Dong C H, Zhu J K, Hasegawa P M, Bressan
R A. HOS10 encodes an R2R3-type MYB transcription factor
essential for cold acclimation in plants. Proc Natl Acad Sci USA,
2005, 102: 9966–9971
[11] Agarwal M, Hao Y, Kapoor A, Dong C H, Fujii H, Zheng X, Zhu
J K. A R2R3-type MYB transcription factor is involved in the
cold-regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance.
J Biol Chem, 2006, 281: 37636–37645
[12] Tian C, Wan P, Sun S, Li J, Chen M. Genome-wide analysis of
the GRAS gene family in rice and Arabidopsis. Plant Mol Biol,
2004, 54: 519–532
[13] Liao Y, Zou H F, Wang H W, Zhang W K, Chen S Y. Soybean
GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tol-
erance in transgenic Arabidopsis plants. Cell Res, 2008, 18:
1047–1060
[14] Dai X, Xu Y, Ma Q, Xu W, Wang T, Xue Y, Chong K. Overex-
pression of an R1R2R3 MYB gene, OsMYB3R-2, increases tol-
erance to freezing, drought, and salt stress in transgenic Arabi-
dopsis. Plant Physiol, 2007, 143: 1739–1751
[15] Zhang X, Fowler S G, Cheng H, Lou Y, Rhee S Y, Stockinger E
J, Thomashow M F. Freezing sensitive tomato has a functional
CBF cold response pathway, but a CBF regulon that differs from
that of freezing tolerant Arabidopsis. Plant J, 2004, 39: 905–919
[16] Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) Software Version. Mol Biol Evol,
2007, 24: 1596–1599
[17] Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T. Efficient transformation
of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and se-
quence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J, 1994, 6:
271–282
[18] Singh K, Foley R C, Onate-Sanchez L. Transcription factors in
plant defense and stress response. Curr Opin Plant Biol, 2002, 5:
430–436
[19] Abe H, Yamaguchi-Shinozaki K, Urao T, Iwasaki T, Hosokawa
D, Shinozaki K. Role of Arabidopsis MYC and MYB homologs
in drought- and abscisic acid-regulated gene expression. Plant
Cell, 1997, 9: 1859–1868
[20] Urao T, Yamaguchi-Shinozaki K, Urao S, Shinozaki K. An
Arabidopsis MYB homolog is induced by dehydration stress and
its gene product binds to the conserved MYB recognition se-
quence. Plant Cell, 1993, 5: 1529–1539
[21] Kranz H D, Denekamp M, Greco R, Jin H, Leyva A, Meissner R
C, Leyva A, Meissner R C, Petroni K, Urzainqui A, Bevan M,
Martin C, Smeekens S, Tonelli C, Paz-Ares J, Weisshaar B. To-
wards functional characterization of the members of the R2R3-
MYB gene family from Arabidopsis thaliana. Plant J, 1998, 16:
263–276
[22] Jung C, Seo J S, Han S W, Koo Y J, Kim C H, Song S I, Nahm B
H, Choi Y D, Cheong J J. Overexpression of AtMYB44 enhances
stomatal closure to confer abiotic stress tolerance in transgenic
Arabidopsis. Plant Physiol, 2008, 146: 623–635
[23] Kirik V, Kolle K, Misera S, Baumlein H. Two novel MYB
homologues with changed expression in late embryogenesis-
defective Arabidopsis mutants. Plant J, 1998, 13: 729–742
[24] Fowler S, Thomashow M F. Arabidopsis transcriptome profiling
indicates that multiple regulatory pathways are activated during
cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway.
Plant Cell, 2002, 14: 1675–1690
[25] Yoshiba Y, Klyosue T, Katagiri T, Ueda H, Mizoguchi T,
Yamaguchi-Shinozaki K, Wada K, Harada Y, Shinozaki K. Cor-
relation between the induction of a gene for Δ1-pyrroline-
5-carboxylate synthase and the accumulation of praline in Arabi-
dopsis thaliana under osmotic stress. Plant J, 1995, 7: 751–760
[26] Martinez C A, Maestri M, Lani E. In vitro salt tolerance and
proline accumulation in Andean potato (Solanum spp.) differing
in frost tolerance. Plant Sci, 1995, 116: 177–184
[27] Reyes D, Morsy B, Gibbons J. A snapshot of the low temperature
stress transcriptome of developing rice seedlings (Oryza sativa L.)
via ESTs from subtracted cDNA library. Genetics, 2003, 107:
1071–1082
[28] Breton G, Danyluk J, Charron J B, Sarhan F. Expression profiling
and bioinformatic analysis of a novel stress-regulated multispan-
ning transmembrane protein family from cereals and Arabidopsis.
Plant Physiol, 2003, 132: 64–74