全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(7): 1253−1260 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30760056)和教育部 2008促进与美大地区科研合作与高层次人才培养项目资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 马纪, E-mail: majiuci@xju.edu.cn; Tel: 0991-8583259
第一作者联系方式: E-mail: bluelovewy@126.com
Received(收稿日期): 2008-09-05; Accepted(接受日期): 2009-02-18.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01253
叶绿体型转昆虫抗冻蛋白基因烟草的耐寒性
王 艳 马 纪* 黄 薇 邱立明 叶 锋 张富春
新疆大学生命科学与技术学院 / 新疆生物资源基因工程重点实验室, 新疆乌鲁木齐 830046
摘 要: 根据已构建的大豆叶绿体表达载体 pJY01, 设计特异性引物, 将昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149插入此载体中
构成叶绿体表达载体 pJY01-MpAFP149, 利用基因枪轰击法转化烟草, 经壮观霉素筛选获得 4株叶绿体型转抗冻蛋白
基因烟草株系。PCR和 PCR-Southern结果显示外源基因已整合至烟草叶绿体基因组中, 但同质化水平不高; RT-PCR
结果也表明昆虫抗冻蛋白基因已发生了转录。将野生型烟草、叶绿体型转抗冻蛋白基因烟草及核转化 T1代转抗冻蛋
白基因烟草(pCAMBIA1302-MpAFP149)于–1℃低温处理 3 d, 观察耐寒表型及测定相对电导率。结果表明, 叶绿体型
转基因烟草的耐寒表型优于野生型烟草, 但与核转化的 T1代转抗冻蛋白基因烟草无显著差异。处理 3 d 时, 叶绿体
型转基因烟草和 T1代转抗冻蛋白基因烟草的电导率分别为 39.2%和 38.2%, 而野生型烟草已达 73.7%。本实验获得
的异质化转叶绿体抗冻蛋白基因烟草与转核基因烟草的耐寒力无差异。
关键词: 抗冻蛋白基因 MpAFP149; 叶绿体转化载体; 烟草; 耐寒性
Cold Tolerance of Transplastomic Tobacco Lines Carrying Insect Antifreeze
Protein
WANG Yan, MA Ji*, HUANG Wei, QIU Li-Ming, YE Feng, and ZHANG Fu-Chun
Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering / College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi
830046, China
Abstract: The antifreeze protein gene MpAFP149 from desert insect Microdera punctipennis dzungarica was inserted into soy-
bean chloroplast vector pJY01 to construct recombinant chloroplast vector pJY01-MpAFP149 by designing special primers. The
plasmid was then transformed into tobacco by gene gun. Four transplastomic tobacco lines were obtained by spectinomycin
screening. PCR and PCR-Southern analyses showed that the MpAFP149 gene was successfully integrated into the tobacco chloro-
plast genome, but the transgenic plants exhibited low homoplasmy. The result of RT-PCR also validated that MpAFP149 gene was
transcribed at mRNA level. The antifreeze effect of transplastomic tobacco with insect antifreeze protein gene in its chloroplasts
was evaluated by measuring the relative conductivity and comparing the phenotypes of different plants after cold treatment.
Wild-type tobacco, transplastomic tobacco and T1 generation of transgenic tobacco containing pCAMBIA1302-MpAFP149 in its
nuclei were subjected to –1 for different days℃ (0, 1, 2, and 3 d). The results showed that transgenic plants with insect antifreeze
protein gene in chloroplasts or in nuclei performed better phenotype after cold treatment at –1 for three days and recovering at ℃
room temperature for five days than wild-type tobacco. After three days, the electrolyte leakage reached 73.7% for wild-type to-
bacco, 39.2% for chloroplast transgenic plants and 38.2% for nuclei transformed T1 generation tobacco. There was no cold toler-
ance difference between nuclei transgenic tobacco and heterogeneous tansplastomic tobacco in our research.
Keywords: Antifreeze protein gene MpAFP149; Chloroplast transformed vector; Tobacco; Cold tolerance
抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)又称热滞蛋白
(thermal hysteresis protein, THP), 能以非依数性
(non-colligative)形式降低水溶液的冰点 , 但对熔点
影响甚微, 具有热滞效应和重结晶抑制效应, 从而
保护生物有机体免受结冰引起的伤害。目前已经在
极地鱼类、昆虫、植物、细菌和真菌体内发现多种
抗冻蛋白[1-2], 而昆虫抗冻蛋白比大多数已发现的其
他来源的抗冻蛋白活性都强[3]。在微摩尔级浓度时,
富含苏氨酸和半胱氨酸的黄粉虫抗冻蛋白, 其热滞
活性为鱼类抗冻蛋白的 10~100倍[4]。低温是限制植
1254 作 物 学 报 第 35卷

物生长、产量和分布的主要环境因素之一。通过基
因工程将抗冻蛋白基因转入植物体内使其产生抗冻
蛋白, 有望提高植物抗冻耐寒能力。这种遗传特性
的改良不仅能增强作物在田间的耐寒能力, 而且会
改善作物在收获后的贮藏加工特性。抗冻蛋白转基
因多采用的是鱼类抗冻蛋白, 已先后转入烟草[5]、油
菜[6]、玉米[7]、番茄[6,8]等作物, 并在提高植物耐寒性
方面取得了一些有效的结果, 但离人们的期望还相
差较远, 原因可能与鱼类抗冻蛋白的热滞活性不高
有关。由于冰水混合物的温度恒定是–1.9 , ℃ 北极鱼
类在进化过程中其抗冻蛋白只需将血液过冷却到
–2.0 , ℃ 就可保证血液不结冰。然而昆虫及虫卵在空
气和土壤浅表面越冬, 所经历的温差很大, 它们表
现的抗冻能力更强, 其抗冻蛋白具有很高的热滞活
性 [9], 因而在转基因提高植物耐寒性方面可能更具
潜力。2002年 Huang等[10]将赤翅甲抗冻蛋白(DAFP)
基因成功导入拟南芥, 并在转基因株系细胞提取物
中检测到具有热滞活性的抗冻蛋白的表达。我们曾
用农杆菌浸染法获得了含有准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋
白基因 MpAFP149 的核转化转基因烟草, 定位结果
显示异源昆虫抗冻蛋白在植物细胞的质外体表达 ,
表现出比野生型烟草较好的耐寒表型[11-12]。
叶绿体基因工程是以叶绿体基因组为平台对植
物进行遗传操作的技术。通过同源重组片段的介导
使外源基因与叶绿体基因组发生同源重组, 定点整
合到叶绿体基因组, 并在其中转录、翻译, 获得终产
物。这项技术是植物基因工程发展的新领域, 具有
传统核转化所不具备的独特魅力, 可高效表达外源
基因 [13]; 其环境安全性好, 不存在转基因的花粉漂
移现象; 不存在“位置效应”问题, 大大减少了基因
沉默发生的几率等, 已经成为植物基因工程领域研
究的热点[13-17]。自问世以来迅速在抗除草剂[18]、抗
虫[19]、抗病[20]、抗旱[16]和表达药用蛋白和疫苗[15,21-22]
等多个研究领域显示出旺盛的生命力。
叶绿体基因组的拷贝数非常大。每个叶绿体中
通常含有 20∼100 个环状的质体 DNA 大分子[23], 而
每个叶肉细胞中又含有几十乃至数百个叶绿体 [24],
若将外源基因导入到叶绿体基因组, 在达到同质化
之后, 外源基因在每个细胞中都具有数百至上万个
拷贝, 使外源基因的高效表达成为可能。
本文构建了含有准噶尔小胸鳖甲 (Microdera
punctipennis dzungarica)抗冻蛋白基因MpAFP149的
叶绿体表达载体并转化烟草, 以探讨叶绿体工程技
术能否进一步提高此昆虫抗冻蛋白基因对植物的耐
寒性。
1 材料与方法
1.1 材料
E. coli DH5α, pGEM-T为本实验室保存。中间
载体为 pJY02 和 pJY01, 由本实验室李金耀在浙江
大学构建[25], 其中 pJY02 载体中含有草丁膦抗性基
因 bar, 该基因的转录起始子和终止子分别为 T7 噬
菌体基因 10 引导序列和烟草的 rps16 3′-UTR (169
bp)。pJY01 载体中含有氨基糖苷腺苷转移酶基因
aada (1 246 bp), 该基因的启动子 Prrn包含了烟草质
体 rRNA基因和部分烟草质体基因 rbcL基因的 5′非
翻译区, 烟草叶绿体基因 PSII 光系统的 Qβ 多肽基
因的 3′序列为转录终止子, 两者片段大小为 147 bp。
pJY01所携带的大豆叶绿体同源序列 LHRR和 RHRR
与烟草叶绿体相应序列分别具有 90%和 97%的同源
性, 大小分别为 1 146 bp 和 1 748 bp。目的基因
MpAFP149 是本实验室克隆的准噶尔小胸鳖甲抗冻
蛋白基因(GenBank 登录号为 AY821792), 大小为
363 bp。
烟草(Nicotiana tabacum L.)W38 品种由北京林
业大学惠赠, 以 55~60 d 的烟草无菌苗叶片为转化
受体材料。核转化 T1代单价转抗冻蛋白基因烟草由
本实验室转化获得[11]。高渗培养基为 MS+0.1 mol
L−1甘露醇+0.1 mol L−1山梨醇。过渡培养基为 MS+
1.0 mg L−1 6-BA +0.1 mg L−1 NAA。筛选分化培养基
为 MS+ 1.0 mg L−1 6-BA +0.1 mg L−1 NAA+500 mg
L−1 spc。生根培养基为 1/2MS+500 mg L−1 spc。以上
培养基均含 30 g L−1蔗糖(1/2MS减半)和 8 g L−1琼脂,
pH 5.8~6.0。spc为壮观霉素, 采用过滤灭菌, 其他均
为 121℃高压灭菌。
1.2 叶绿体植物表达载体的构建
叶绿体载体构建如图 1 所示。根据中间载体
pJY02上的限制性酶切位点, 设计上游含 Not I位点
下游含 Pst I 位点的一对引物扩增目的片段
MpAFP149。
引物序列分别为上游引物 MP1：5′-AATGCGG
CCGCATGGCTTTGACAACAAAATGG-3′, 下游引
物 MP2：5′-ATACTGCAGTTAACCTTTATTTGGAC
ATCC-3′。MpAFP149扩增条件为 94 3 min; 94 ℃ ℃
30 s, 55 30 s℃ , 72 40 s, 30℃ 个循环; 72℃延伸 10 min。
参照分子克隆实验指南进行载体构建、质粒提
取、DNA酶切、连接和转化[26]。将重组质粒送北京
奥科公司测序验证其正确性。
第 7期 王 艳等: 叶绿体型转昆虫抗冻蛋白基因烟草的耐寒性 1255




图 1 抗冻蛋白基因的叶绿体表达载体 pJY01-MpAFP149构建示意图
Fig. 1 Schematic diagram of the construction of chloroplast expression vector pJY01-MpAFP149

1.3 基因枪转化和转基因烟草的获得
在不含激素的 1/2MS 固体培养基中培养烟草
W38无菌苗, 取 4~6叶期的幼嫩叶片(叶片直径大小
以 3 cm 为佳)作为基因枪转化受体材料, 参照 Svab
等[27]方法用 Bio-Rad 公司 PDS-1000/He 基因枪转化
含有抗冻蛋白基因的叶绿体载体 pJY01-MpAFP149。
轰击距离为 9 cm, 可裂膜压力 7.58 MPa, 金粉颗粒
直径 1.0 μm。在无菌条件下, 将轰击后经过 7 d过渡
培养的受体叶片切成小块, 放入选择分化培养基中
筛选培养, 每 4周左右更换 1次培养基, 待长出愈伤
组织并分化出小苗后, 将小苗转入生根培养基中继
续培养。将初次筛选所得抗性幼苗叶片再次切成小
块, 放入选择分化培养基中进行二次筛选, 经多次
筛选得到的小苗经生根培养后移栽到温室中。
1.4 转基因植株的分子检测
采用 Michaels 等方法[28]提取植物基因组 DNA,
以 LHRR片段的上游引物 LP1: 5′-GATCCAATCAC
GATCTTCTAATAATAAGAAC-3′和 MpAFP149 目
的基因的下游引物MP2检测目的基因是否整合至烟
草叶绿体基因组中。以 LHRR 片段的上游引物 LP1
和 RHRR片段下游引物 RP2：5′-CACCGCCGTATG
GCTGACCG-3′检测烟草叶片转化的同质化程度。
取 PCR 扩增阳性产物在 0.7%琼脂糖凝胶上电
泳, 经变性、中和后按照分子克隆[26]介绍的高盐转
移法将胶上的样品转到 Hybond N 带正电荷的尼龙
膜上, 以 DIG-High primer标记目的基因 MpAFP149
为探针, 采用 Roche公司 DIG High Prime DNA La-
beling and Detection Stater Kit I试剂盒进行杂交。
用 TianGen 公司的 Trizol 试剂提取转基因烟草
的总RNA, 以目的基因的特异引物MP2为反转录引
物 , 采用 TaKaRa 公司的 M-MLV 反转录酶合成
cDNA 第一链, 再以此 cDNA 为模板, 以引物 MP1
和 MP2进行 RT-PCR扩增目的基因, 扩增产物大小
为 363 bp。
1.5 转基因烟草的耐寒性检测
当野生型烟草、核转化 T1代转抗冻蛋白基因烟
草及叶绿体转化再生烟草植株达到一致生长状态时,
参照赵世杰等[29]方法测定相对电导率, 然后将它们
置–1℃低温培养箱, 处理 1、2和 3 d, 分别再次测定
相对电导率。于室温恢复 5 d, 观察其生长状况。每
一待测株系取 3 盆测定, 以 3 组数据的平均值进行
统计分析。
叶片相对电导率 A=电导率 S1/煮沸后植物总电
导率 S2×100%。
2 结果与分析
2.1 叶绿体表达载体的构建与鉴定
以 pJY02为基本载体, Not I和 Pst I进行双酶切
切除 bar基因, 回收载体, 与相同酶切的 MpAFP149
1256 作 物 学 报 第 35卷

PCR产物相连接, 得到重组质粒 pUC-MpAFP149(图
2), 经测序 MpAFP149序列正确。再用 Nco I酶切重
组质粒 pJY02, 得到带 Nco I黏端的 MpAFP149表达
框 T7-MpAFP149-Trps16 (570 bp), 与相同酶切的
pJY01 相连接, 获得含有 MpAFP149 的叶绿体表达
载体 pJY01-MpAFP149 (图 3), 测序结果表明此读码
框正向连接, 序列正确。



图 2 pUC-MpAFP149 的 Kpn I和 Xho I酶切鉴定电泳图
Fig. 2 Electrophoresis analysis of the pUC-MpAFP149 di-
gested by Kpn I and Xho I
M: DL2000 bp marker; 1: Kpn I和 Xho I双酶切 pUC-MpAFP149。
M: DL2000 bp marker; 1: recombinant plasmid pUC-MpAFP149
digested by Kpn I and Xho I.



图 3 抗冻蛋白基因的叶绿体表达载体 pJY01-MpAFP149酶切
鉴定电泳图
Fig. 3 Electrophoresis analysis of chloroplast vector
pJY01-MpAFP149
M: DL2000 bp marker; 1: Nco I酶切重组质粒 pJY01-MpAFP149。
M: DL2000 bp marker; 1: recombinant plasmid pJY01-MpAFP149
digested by Nco I.
2.2 转基因植株的获得及 PCR和 PCR-Southern
检测
烟草无菌苗叶片在含有 0.1 mol L−1甘露醇和 0.1
mol L−1山梨醇的MS培养基上高渗培养 4~6 h, 然后
移入 MS 固体培养基上 , 用包裹有质粒 pJY01-
MpAFP149 的金粉子弹轰击烟草无菌苗叶片, 轰击
后的叶片在过渡培养基中过渡培养 1 周, 然后切成
约 0.5 cm2的小块, 转入选择分化培养基中继续培养,
约 2周后叶片逐渐失绿变白, 并且膨大至原来的 3~4
倍, 继续生长两周后, 有些叶块边缘长出绿色小芽
(图 4-A, B), 待小苗长到 1 cm左右转入含有 500 mg
L−1 壮观霉素的选择生根培养基中(图 4-C)。将初次
筛选得到的抗性小苗叶片再切成小块, 放入筛选分
化培养基中进行 2次筛选, 25~28 d后得到 2次筛选
的抗性苗, 经过约一年半的上述反复筛选, 抗性小
苗经炼苗后移入温室盆栽, 最终得到具壮观霉素抗
性的转基因株系(图 4-D)。
利用 LHRR片段的上游引物 LP1和 MpAFP149
目的基因的下游引物MP2进行 PCR扩增, 获得长度
为 1 544 bp的片段, 表明目的基因已整合到叶绿体
基因组中(图 5)。以 LHRR片段上游引物 LP1和 RHRR
下游引物 RP2进行 PCR扩增, 未转入基因的烟草只
产生 2 896 bp的条带, 转基因完全同质化的烟草则
应产生 4 870 bp的条带。图 6扩增结果显示, 野生
型烟草基因组 DNA仅扩出 2 896 bp的条带, 而经过
多轮筛选的叶绿体型转基因不同株系烟草均扩增出
了 2 896 bp和 4 870 bp的条带, 说明转基因植株中
还存在部分野生型叶绿体基因组, 尚未达到完全同
质化, PCR-Southern 结果也进一步证明外源基因表
达盒确已整合至烟草叶绿体基因组中(图 7)。
2.3 转基因植株的 RT-PCR检测
提取转基因烟草的总 RNA 作为模板进行反转
录, 由于叶绿体 RNA 和原核生物 RNA 一样不具有



图 4 基因枪轰击转化叶绿体表达载体 pJY01-MpAFP149获得的转基因烟草
Fig. 4 Transgenic tobacco lines with chloroplast expression vector pJY01-MpAFP149 mediated by gene gun
A~C: 烟草抗性苗在 500 mg L−1壮观霉素培养基中的筛选和再生; D: 叶绿体型转基因烟草的炼苗移栽。
A–C: regeneration and screening of resistant plantlets on the selective medium containing 500 mg L−1 spectinomycin;
D: transplant of young transplatomic tobacco in green house.
第 7期 王 艳等: 叶绿体型转昆虫抗冻蛋白基因烟草的耐寒性 1257




图 5 叶绿体型转基因烟草的 PCR检测
Fig. 5 PCR analysis for the identification of transplastomic
tobacco lines
M: DL15000+2000 bp marker; 1: 阳性对照 pJY01-MpAFP149;
2: 阴性对照野生型烟草; 3~6: 4株叶绿体型转基因烟草。
M: DL15000+2000 bp marker; 1: pJY01-MpAFP149 plasmid as
positive control; 2: wild-type tobacco as negative control; 3–6: four
transplastomic tobacco plants.



图 6 叶绿体型转基因烟草的同质化程度检测
Fig. 6 PCR analysis for the degree of homoplasmy of trans-
plastomic tobacco lines
M: DL15000+2000 bp marker; 1: 阳性对照 pJY01-MpAFP149;
2: 阴性对照野生型烟草; 3~6: 4株叶绿体型转基因烟草。
M: DL15000+2000 bp marker; 1: pJY01-MpAFP149 plasmid as
positive control; 2: wild-type tobacco as negative control;
3–6: four transplastomic tobacco plants.



图 7 叶绿体型转基因烟草的 PCR-Southern检测
Fig. 7 PCR-Southern analysis for the identification of
transplastomic tobacco lines
1: 阳性对照 pJY01-MpAFP149; 2: 阴性对照野生型烟草;
3~6: 4株叶绿体型转基因烟草。
1: pJY01-MpAFP149 plasmid as positive control; 2: wild-type to-
bacco as negative control; 3–6: four transplastomic tobacco plants.

真核生物核成熟 mRNA 特有的 Poly(A)尾巴, 所以
采用目的基因MpAFP149的特异下游引物MP2进行
反转录, 以引物 MP1 和 MP2 进行 RT-PCR 扩增(图
8)。所有转基因株系均扩增出预期大小的 363 bp目
的片段, 而以对照野生型烟草的 cDNA 第 1 条链和
转基因植物的 RNA为模板(结果未列出)则没有扩增
出相应产物 , 说明整合进烟草叶绿体基因组的
MpAFP149基因已经在 mRNA水平发生了转录。



图 8 叶绿体型转基因烟草的 RT-PCR分析
Fig. 8 RT-PCR analysis of transplastomic tobacco plants
M: DL2000 bp marker; 1: 阳性对照 pJY01-MpAFP149; 2: 阴性对
照野生型烟草; 3~6: 4株叶绿体型转基因烟草。
M: DL2000 bp marker; 1: pJY01-MpAFP149 plasmid as positive
control; 2: wild-type tobacco as negative control; 3–6: four trans-
plastomic tobacco plants.

2.4 转基因植株的耐寒性检测
当叶绿体型转基因烟草、核转化 T1代转基因烟
草和野生型烟草达到相同的生长状态时, 进行–1℃
低温实验(图 9-A)。低温处理 1 d时, 两种转基因烟
草和野生型烟草都表现出轻微脱水(图 9-B), 其相对
电导率也显示出少量增长。当低温处理至第 2 天和
第 3 天时, 野生型烟草除了顶部叶片外, 大多数叶
片都受到了冻害, 表现出严重的水渍状, 然而两种
转基因型烟草只是位于基部的叶片显示出萎蔫状
(图 9-C, D)。低温处理第 2天, 野生型烟草的电导率
已达到 70.0%, 第 3天达到 73.7%。叶绿体型转基因
烟草和核转化抗冻蛋白烟草的电导率分别仅为
35.5%和 33.5%, 第 3天分别为 39.2%和 38.2%(图 10),
通过 Prism4.0 软件进行生物统计学分析, 二者无显
著性差异(P＞0.05)。低温处理第 3 天时, 尽管相对
电导率都有上升, 但变化幅度不大。恢复室温时, 叶
绿体型转基因烟草和核转化 T1代转基因烟草均能完
全恢复并正常生长, 而野生型植株叶片尤其是基部
叶表现出严重的萎蔫和白化, 在一定程度上遭受了
不可逆的伤害。表明携带抗冻蛋白基因的核转化烟
草和叶绿体型转基因烟草的耐寒力较野生型烟草均
得到了提高, 但两种转基因型烟草间的耐寒力无显
著差异。
3 讨论
组培体系是进行植物遗传转化的先决条件和重
1258 作 物 学 报 第 35卷



图 9 –1℃处理对转基因烟草和野生型烟草表型的影响
Fig. 9 Effect of –1 treatment℃ on the phenotypes of wild-type and transgenic plants
A: 室温 25~28 ; B: ℃ –1℃处理 1 d; C: –1℃处理 2 d; D: –1℃处理 3 d; E: 室温 25~28℃恢复 5 d。
从左至右：T1代核转基因型烟草、野生型烟草、叶绿体型转基因烟草。
A: plants at 25–28 ; ℃ B: plants at –1℃ for 1 d; C: plants at –1℃ for 2 d; D: plants at –1℃ for 3 d; E: plants recovered at 25–28 for 5 d after ℃
cold treatment. From left to right: T1 generation nuclear transgenic tobacco carrying MpAFP149, wild-type tobacco, transplastomic tobacco.



图 10 –1℃处理对转基因和非转基因烟草叶片电导率的影响
Fig. 10 Effect of –1 ℃ treatment on the relative conductivity of
leaves of transgenic and non-transgenic plants

要平台基础, 由于模式植物烟草具有稳定而高效率
的再生体系, 且近年来在叶绿体转化领域积累了成
功经验 , 烟草被广泛地用于功能基因的研究与表
达。陈飒等[25]构建了绿色荧光蛋白基因 GFP和 GUS
基因融合的大豆叶绿体转化载体, 其中大豆叶绿体
同源序列的左臂和右臂与烟草叶绿体基因组的相应
序列分别具有 90%和 97%的同源性, 转化烟草后获
得抗性苗, 通过激光扫描共聚焦观察到GFP的表达,
说明叶绿体载体中的两段左右同源臂与烟草叶绿体
基因组中的同源序列发生了重组。鉴于此结果, 为
了避免重新克隆烟草叶绿体基因组中的同源片段 ,
通过一系列载体构建 , 我们将昆虫抗冻蛋白基因
MpAFP149 插入此大豆叶绿体表达载体中并进行烟
草转化, 以进一步提高植物的耐寒性。
由于植物细胞所含叶绿体数目众多, 而叶绿体
的最初转化事件只涉及单个或几个叶绿体 DNA 分
子[30], 不可能通过一次转化在所有叶绿体基因组中
引入外源基因, 因此所获得的叶绿体转化株通常是
异质的, 如何使转化的叶绿体尽快取代非转化的叶
绿体以获得同质化转基因植株是叶绿体基因工程的
关键环节之一。本实验采用高浓度壮观霉素选择压
(500 mg L−1)得到外源基因的转化植株后, 再次切取
植物叶片在相同选择压力的培养基上诱导筛选, 经
过一年半的反复循环组培筛选, 期望逐步淘汰野生
型拷贝, 使植株中已整合外源基因 MpAFP149 的叶
绿体基因组取代原基因组, 以期最终获得同质化的
叶绿体转基因植株。尽管分子检测表明 MpAFP149
已整合至叶绿体基因组中并已发生了转录, 但同质
化程度不高。通过−1℃耐寒表型和生理生化实验结
果显示, 叶绿体型转基因烟草的耐寒性优于野生型
第 7期 王 艳等: 叶绿体型转昆虫抗冻蛋白基因烟草的耐寒性 1259


烟草, 但与核转化 T1代转基因烟草无耐寒性差异。
推测可能原因之一是不同基因在叶绿体载体系统中
表达异源蛋白水平的差异。叶绿体转基因主要在
5′PL(启动子和前导序列)和 3′-T盒(终止子)中表达。
其中 5′-UTR 对于蛋白质积累非常重要, 编码 N-末
端的 mRNA 序列可与 5′-UTR 形成二级结构来促进
或阻止翻译起始。蛋白质通过 mRNA 被编码, 相同
蛋白质的表达水平可在一个表达盒中很高, 而在另
一个盒中则很低[31]。所以, 为了得到高效而稳定的
蛋白表达水平, 应该将目的蛋白在不同的表达盒中
进行表达, 以达到最佳表达效果。另一方面可能是
由于叶绿体型转基因烟草的同质化程度较低而未达
到增加抗冻蛋白表达量的目的, 后期可通过克隆烟
草的同源序列重新构建叶绿体表达载体以进一步提
高转基因植物的同质化程度。同时也可将叶绿体型
转基因烟草细胞和核转化烟草细胞融合, 使再生植
株细胞的质外体和叶绿体中均有异源昆虫抗冻蛋白
的表达, 以进一步提高植物的耐寒性。
4 结论
构建了含有准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因
MpAFP149的叶绿体植物表达载体pJY01- MpAFP149,
通过基因枪转化法导入模式植物烟草, 获得 4 株同质
化程度不高的转基因植株。其耐寒能力明显优于野生
型烟草, 但与核转化T1代转基因烟草(pCAMBIA1302-
MpAFP149)无耐寒性差异。

致谢：诚挚感谢李金耀博士在质粒构建中的大力帮助。
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