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Transformation, Inducing and High-Frequency Regeneration of Embryogenic Callus Initiated from Mature Embryos of Maize (Zea mays L.)

玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究



全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(3): 423−428 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家自然科学基金项目(30571171); 北京市科技攻关项目
作者简介: 王世玉(1980–), 男, 山东日照人, 硕士, 专业方向:植物基因工程。
*
通讯作者(Corresponding author): 张方东。E-mail: fdzhang@mail.hzau.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-06-04; Accepted(接受日期): 2007-09-17.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00423
玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究
王世玉1 郑用琏1 刘 亚2 赵久然2 张方东1,*
(1华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉 130070; 2北京市农林科学院玉米研究中心, 北京 100089)
摘 要: 以玉米自交系 CML295、CML304和 18-599R的成熟胚为外植体, 结合幼胚离体培养方法, 探讨并优化了成
熟胚来源的胚性愈伤组织诱导及继代培养方法。对其愈伤组织的形态和组织切片的研究结果显示, 继代过程可产生
良好的Ⅱ型胚性愈伤组织。在分化培养中分别获得 68.6%、75.4%和 84.8%的高频再生率, 每愈伤组织块成苗数分别
为 2.45、2.43和 2.75。利用基因枪法转化 pCAMBIA1301质粒后的 GUS瞬时表达效率分别为 57.9%、62.5%和 73.1%,
转化 pCAMBIA1303 质粒后检测 GFP 的瞬时表达效率分别为 23.3%、40%和 45.5%。以上 3 种基因型成熟胚来源的
愈伤组织转化率与其对应的幼胚来源的胚性愈伤组织转化率相似。这一技术体系为玉米的遗传改良和功能基因组研
究提供了重要的技术平台。
关键词: 玉米; 成熟胚; 胚性愈伤组织; 再生; 转化
Transformation, Inducing and High-Frequency Regeneration of Embryo-
genic Callus Initiated from Mature Embryos of Maize (Zea mays L.)
WANG Shi-Yu1, ZHENG Yong-Lian 1, LIU Ya2, ZHAO Jiu-Ran2, and ZHANG Fang-Dong 1,*
(1 National Key Laboratory for Genetic Improvement of Crops, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei; 2 Maize Research Center,
Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100089, China)
Abstract: Immature embryo-derived callus is more efficient for transgenic and plant regeneration than calli from other explant
tissues. It’s reported that embryogenic callus can be initiated from mature embryos. The use of mature embryos from dry seed are
easy to handle, available year round and in bulk quantities. In this study we established an efficient transgenic acceptor system and
developed some new methods on maize (Zea mays L.) tissue culture, plant regeneration and genetic transformation with embryo-
genic callus initiated from mature embryos of three elite inbred lines CML295, CML304, and 18-599R. The calli were cultured in
subculture medium of immature embryos. Tissue slice showed that the structure of callus formed from mature embryos was the
same as those from immature embryos, being the type embryogeⅡ nic callus. The calli were transferred into regeneration medium
of immature embryos supplemented with 2 mg L−1 6-BA. The regeneration frequencies of the calli from mature embryos of
CML295, CML304, and 18-599R were 68.6%, 75.4%, and 84.8%, respectively. Vector pCAMBIA1301 was transformed into
callus from mature embryos of CML295, CML304, and 18-599R by particle gun using GUS as a report gene; vector pCAM-
BIA1303 was transformed by particle gun using GFP as a report gene, with GUS staining frequency of 57.9%, 62.5%, and 73.1%;
and GFP transient expression frequency of 23.3%, 40%, and 45.5%, respectively. The transgenic rates of embryogenic callus from
mature embryos of the three inbred lines were similar to those from immature embryos. In conclusion, using embryogenic callus
from mature embryos as transgenic acceptors is efficient and available.
Keywords: Mature embryo; Maize; Embryogenic callus; Regenetion; Transformation
玉米作为粮食、食品、饲料、化学工业的重要
原料作物, 基于基因遗传转化技术的分子育种与功
能基因组研究十分活跃。成功高效的遗传转化技术
体系的核心是具备较高植株再生频率与转化效率的
受体系统。已报道的用于玉米遗传转化受体系统的
外植体有悬浮细胞系[1]、幼胚[2-3]和芽尖[4-5]等, 其中
424 作 物 学 报 第 34卷

以幼胚离体培养产生的胚性愈伤组织为转化受体的
报道较多[5-7]。
幼胚虽是玉米组织培养的主要外植体来源, 但
幼胚取材受到严格的生长季节的限制, 只能在玉米
授粉后 9~12 d较为短暂的特定时段内取胚[6-10], 而
且幼胚愈伤组织需要常年进行继代培养, 工作量大
而集中, 不能适应功能基因组学研究中对大量候选
基因进行功能验证的需要。与之相比, 种子收获干
燥后易于大量保存, 以成熟胚萌发后的不同阶段的
不同部位作为外植体进行组织培养易于操作, 可以
不受季节限制随时取材。
玉米成熟胚来源的外植体主要有萌发幼苗的茎
段[11]、芽尖[4-5]、顶芽[12-13]、腋芽[14]、中胚轴[15]等部
位。其中利用顶芽分生组织和 7~10 d 龄幼苗的中胚
轴开展的工作已有成功的遗传转化报道[15-17]。与以
上来源于幼苗的外植体相比, 种子的胚芽处于更易
进行脱分化的状态, 而且其操作比微小的芽尖分生
组织的操作更简便。1974 年Green等[18]首次报道了
玉米成熟胚(胚芽)可以诱导愈伤组织, 但是他们的
研究未能获得再生植株。1987年Wang[19]报道用自交
系B73 和Mo17 的成熟胚组织可以获得 4%~5%的植
株再生率, 但是他所用的基因型A632未能获得再生
植株。2004 年Huang等[20]通过对 7 个自交系材料的
研究, 初步建立了成熟胚途径的胚性愈伤组织诱导
和 植 株 再 生 体 系 , 其 植 株 再 生 效 率 达 到
19.8%~32.4%。
笔者在前期研究中沿用Huang等[20]的技术流程,
筛选到一批可高效诱导胚性愈伤组织的自交系。本
研究利用筛选出的 3 个基因型材料, 结合幼胚组织
培养技术流程, 旨在进一步优化通过成熟胚途径获
得高效率、高质量胚性愈伤组织的技术体系, 对获
得的愈伤组织进行了植株再生和遗传转化瞬时表达
的研究, 为利用玉米成熟胚建立优良的转化受体系
统提供重要的技术基础和理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
在前期对 71 份自交系大规模成熟胚愈伤组织诱
导试验(未详细列出)基础上筛选出 3 个玉米自交系。
其中 CML295和 CML304为本研究室的保存种质, 18-
599R由四川农业大学玉米研究所潘光堂教授提供。
以玉米幼胚为对照处理的相关研究方法(包括
取材、消毒、取胚、幼胚胚性愈伤组织诱导培养、
继代培养和植株再生)均参照付凤玲等[9]的报道。对
照处理的试材为已继代培养 8 个月的CML295 和
CML304, 已继代培养 20 个月的 18-599R的幼胚胚
性愈伤组织。
以玉米成熟胚为试材的相关研究方法(包括种
子消毒、吸胀萌发、取胚芽、成熟胚愈伤组织的诱
导和前两次继代程序)参照Huang等[20]的报道。在第
2 次继代培养后, 将符合II型胚性愈伤特征的胚性愈
伤组织, 转入幼胚胚性愈伤组织培养所用的继代培
养基中, 按幼胚材料继代的方法培养。
1.2 胚性愈伤组织的植株再生
将继代培养的成熟胚来源的胚性愈伤组织和
作为对照的幼胚来源的胚性愈伤组织同时转入分化
培养基[9](基础培养基+6-BA 2 mg L−1)。分化培养温
度为(26±1)℃, 每天光照 14 h。每个材料用于分化
的愈伤组织不少于 100块。
分化培养 30 d后统计胚性愈伤组织的植株再生
频率。再生愈伤数指有绿苗形成的愈伤组织块数 ,
再生率指有绿苗形成的愈伤组织占所有进行分化
培养的愈伤组织块的比例。再生绿苗数指经过 30 d
培养后 , 所有在愈伤组织表面分化出的长度大于
5 mm的绿苗(芽)总数。每愈伤组织块成苗数为再生
绿苗数与所有进行分化培养的愈伤组织块的比值。
1.3 胚性愈伤组织的石蜡切片
选取来自幼胚和不同时期的成熟胚的胚性愈伤
组织进行石蜡切片。其中包括继代过程中的胚性愈
伤组织和分化起始 3 d内的愈伤组织。
参照王灶安 [21]的方法制作石蜡切片。取样→
FAA固定(24 h)→5 级梯度酒精脱水→5 级梯度二甲
苯透明→透蜡(3 d)→3级梯度石蜡包埋→切片(厚度
为 6~8 μm)、展片、粘片→脱蜡及染色→封片、观察
和显微照相。染料为细胞核、细胞质染料甲苯胺蓝。
1.4 质粒及基因枪转化
质粒 pCAMBIA1301 含有 GUS 基因和 HPT 选
择标记基因, 其 T-DNA区段的遗传结构如图 1所示;
pCAMBIA1303 中 GUS 与 mGFP5 位于同一个启动
子 CaMV35S 下, 同样含有 HPT 选择标记基因, 其
T-DNA区段的遗传结构如图 2所示。
将用于转化的胚性愈伤组织夹碎成 2~3 mm大
小, 转入新的继代培养基中预培养 1周。转化前 4 h
将预培养的愈伤组织转入含高渗培养基(继代培养
基[9]+ 0.2 mol L-1甘露醇)的培养皿中。按Klein等[22]
的方法制备微弹DNA。用BIO-RAD公司生产的
第 3期 王世玉等: 玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究 425


PDS-1000/He型气动式基因枪按产品说明书提供的
方法, 每皿轰击一枪。
轰击后的愈伤组织在高渗培养基上继续培养 16
h后, 转入继代培养基中恢复培养 1周。


图 1 质粒 pCAMBIA1301 T-DNA区段遗传结构示意图
Fig. 1 T-DNA structure of vector pCAMBIA1301
LB: T-DNA左边界; RB: T-DNA右边界; Nos-t: Nos终止子; 35S-p:
35S启动子; GUS: β-葡聚糖酸醛苷酶基因; HPT: 潮霉素抗性基因。
LB: left border; RB: right border; Nos-t: nopaline synthase gene
terminator; 35S-p: 35S promoter; GUS: β-glucuronidase gene; HPT:
hygromycin resistance gene.



图 2 质粒 pCAMBIA1303 T-DNA区段遗传结构示意图
Fig. 2 T-DNA structure of vector pCAMBIA1303
LB: T-DNA左边界; RB: T-DNA右边界; Nos-t: Nos终止子; 35S-p:
35S启动子; 35S-t: 35S终止子; mGFP5-GUSA: mGFP5-GUS-组
氨酸融合蛋白基因; HPT: 潮霉素抗性基因。
LB: left border; RB: right border; Nos-t: nopaline synthase gene
terminator; 35S-p: 35S promoter; 35S-t: 35S terminator;
mGFP5-GUSA: mGFP5-GUS-histidine fusion gene; HPT:
hygromycin resistance gene.

1.5 GUS基因的瞬时表达检测
取基因枪转化pCAMBIA1301 后恢复培养 1 周
的愈伤组织进行X-Gluc[23-24]染色, 检测GUS基因的
瞬时表达情况, GUS+频率表示被X-Gluc溶液染为蓝
色的愈伤组织团块占所有参与染色的愈伤组织团块
的比例。同时设置未转化的愈伤组织进行X-Gluc染
色作为对照。
1.6 GFP基因瞬时表达的荧光检测
基因枪转化愈伤组织恢复培养 1周后, 以体视荧
光显微镜(Leica MZFLⅢ型)检测GFP的瞬时表达并
照相[25]。滤光片为GFP2, 激发滤光片为 480/40 nm,
封阻滤光片为 510 nm。GFP+频率是可以观察到绿色
荧光的愈伤组织团块占所有转化的愈伤组织团块的
比例。同时以观察未转化的愈伤组织有无荧光表达
为对照。
2 结果与分析
2.1 成熟胚途径的转化受体系统的建立
3 个材料的成熟胚均能在 2 个月内形成生长速
度较快、松散易碎、颜色鲜亮的胚性愈伤组织, 在
形态上符合Ⅱ型胚性愈伤组织[26]的特征(图 3-A)。将
其夹碎成 3~5 mm的小团置幼胚继代培养基上培养,
可以迅速增殖扩大(图 3-B), 扩繁能力与对应的幼胚
诱导的胚性愈伤组织相当。石蜡切片证明, 稳定继
代后, 由成熟胚诱导产生的胚性愈伤组织在组织结
构上与幼胚诱导产生的胚性愈伤组织相同, 其愈伤
组织表面的胚性细胞细胞核大, 核仁明显并富含细
胞质(图 3-C)。在含有生长素如 2,4-D等的培养基上,
胚性细胞团不能发育为成熟的体胚, 但其本身可以
通过细胞的增殖和细胞团的不断破碎而不断延
续[27]。新形成的胚性愈伤组织的表面因为胚性细胞
的不断增殖而显得不平整(图 3-D)。


图 3 成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织及其组织切片
Fig. 3 Embryogenic callus initiated from mature embryos and
the tissue slice
A: 成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织; B: 成熟胚来源的胚性愈伤
组织在幼胚继代培养基上继代; C: 愈伤组织表面具有浓厚细胞质
的胚性细胞; D: 继代中愈伤组织表面形成新的胚性愈伤组织。
A: embryogenic calli initiated from mature embryos; B: subculture
of embryogenic callus initiated from mature embryos in subculture
media of immature embryos; C: embryogenic callus with dense
cytoplasmic cells; D: a new embryogenic calli formed on the sur-
face of embryogenic callus in subculture.

形态学和石蜡切片的证据显示, 由成熟胚诱导
产生的胚性愈伤组织与幼胚诱导的胚性愈伤组织实
质上是相同的。成熟胚诱导产生的胚性愈伤组织在
幼胚继代培养基上可以良好地增殖与继代。
2.2 成熟胚胚性愈伤组织的高频植株再生
分化 1~2 d 的愈伤组织石蜡切片显示, 在愈伤
组织表面有大量的胚性细胞、二细胞胚、四细胞胚
(图 4-A)及多细胞的体细胞原胚形成(图 4-B)。在 3 d
后即可肉眼观察到愈伤组织表面形成的多个胚状体
426 作 物 学 报 第 34卷

的萌发(图 4-C)。愈伤组织表面存在的胚性细胞、二
细胞胚、四细胞胚、多细胞胚及胚状体在胚性愈伤
组织的继代过程中同样可以观察到, 但胚状体不能
萌发形成绿苗。结果证明成熟胚来源的愈伤组织确
实具有良好的胚性。
分化 30 d后的再生苗如图 4-D所示, 统计再生
频率的结果如表 1所示。由于本研究所用的 18-599R
的幼胚来源的胚性愈伤组织已继代培养 20 个月左
右, 胚性有较大降低, 因此其愈伤组织再生率和每
愈伤组织块成苗数略低于其幼胚来源的愈伤组织。
CML295 和 CML304 的成熟胚来源的愈伤组织再生
率和每愈伤组织块成苗数均略低于幼胚来源愈伤组
织的效率。但 3 种基因型的成熟胚愈伤组织再生指
标均达到较高的水平。
2.3 转化 pCAMBIA1301 的 GUS 基因瞬时表达
检测
转化pCAMBIA1301 的愈伤组织GUS染色结果
(图 5)显示, 大部分轰击区GUS染色较深, 并呈点状
集中分布在愈伤组织的一面(图 5-A和图 5-B), 表现
了良好的转化表达效果, 未转化的对照愈伤组织不
能被染色(图 5-C)。不同基因型的成熟胚和幼胚来源
的愈伤组织GUS+瞬时表达频率如表 2所示。


图 4 成熟胚诱导的胚性愈伤组织的植株再生及其组织切片
Fig. 4 Regeneration of embryogenic callus initiated from ma-
ture embryos and tissue slice
A: 玉米体细胞原胚分裂产生的二细胞胚(dc)和四细胞胚(t); B:
玉米多细胞原胚(mcp); C: 胚性愈伤组织表面的多个胚状体萌发
(第 3天); D: 胚性愈伤组织形成的丛生绿苗。
A: dyad cell (dc) and tetracyte (t) of maize proembryo; B: a multi-
ple-cell proembryo of maize; C: embryoids germination on the
surface of embryogeinc callus (3rd day); D: green shoots of an
embryogenic calli formed.

表 1 玉米成熟胚和幼胚不同基因型诱导的胚性愈伤组织的植株再生频率
Table 1 Frequency of regeneration of the embryogenic callus in different genotype initiated from mature embryos and immature
embryos of maize
基因型
Genotype
愈伤总数
No. of calli
再生愈伤数
No. of calli producing
green shoots
再生率
Rate for callus
regeneration (%)
形成绿苗数
No. of green shoots
每愈伤成苗数
No. of shoots per callus
CML295me 102 70 68.6 250 2.45
CML295ie 142 130 91.5 501 3.53
CML304me 114 86 75.4 277 2.43
CML304ie 113 105 92.9 393 3.47
18-559Rme 105 89 84.8 289 2.75
18-599Rie 148 111 75.0 395 2.67
me : 成熟胚; ie: 幼胚。me: mature embryo; ie: immature embryo.

2.4 转化 pCAMBIA1303 的 GFP 基因瞬时表达
检测
经紫外光激发, 在体视荧光显微镜下能观察到
在转化 pCAMBIA1303 的成熟胚和幼胚来源的胚性
愈伤组织中, GFP 表达的部位有明显点状或团状分
布的绿色荧光(图 6-A), 表现了良好的转化表达效
果。没有转化的愈伤组织则只能看到较为暗淡的黄
绿色荧光(图 6-B)。不同基因型的成熟胚和幼胚来源
的愈伤组织 GFP瞬时表达效率如表 3所示。
pCAMBIA1303 和 pCAMBIA1301 转化效率存
在差异(表 2和表 3), 说明不同的质粒载体具有不同
的瞬时表达效率。
第 3期 王世玉等: 玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究 427



图 5 转化 pCAMBIA1301的胚性愈伤组织及对照的 GUS染色
Fig. 5 GUS staining of transformed embryogenic callus with vector pCAMBIA1301 and CK
A、B: GUS染色的愈伤组织; C: 对照, 未转化的愈伤组织不能被染色。
A, B: callus with GUS staining; C: callus as CK without GUS staining.

表 2 成熟胚和幼胚不同基因型转化 pCAMBIA1301后 GUS基
因瞬时表达率
Table 2 Frequency of GUS transient expression in different
genotypes of mature embryos and immature embryos with
pCAMBIA1301 transformed
基因型
Genotype
转化外植体数
No. of trans-
formed explants
GUS+外植体数
No. of GUS+
explants
GUS+频率
GUS+ fre-
quency (%)
CML295me 57 33 57.9
CML295ie 48 34 70.8
CML304me 48 30 62.5
CML304ie 54 44 81.5
18-559Rme 52 38 73.1
18-599Rie 47 42 89.4
me: mature embryo; ie: immature embryo.


图 6 转化 pCAMBIA1303的胚性愈伤组织的 GFP表达(A)
Fig. 6 GFP expression(A) of transformed embryogenic callus
with vector pCAMBIA1303

表 3 成熟胚和幼胚不同基因型转化 pCAMBIA1303后 GFP基
因瞬时表达率
Table 3 Frequency of GFP transient expression in different
genotypes of mature embryos and immature embryos with
pCAMBIA1303 transformed
基因型
Genotype
转化外植体数
No. of trans-
formed explants
GFP+外植体数
No. of GFP+
explants
GFP+频率
GFP+ fre-
quency (%)
CML295me 172 40 23.3
CML295ie 188 57 30.3
CML304me 120 48 40.0
CML304ie 180 63 35.0
18-559Rme 99 45 45.5
18-599Rie 207 52 25.1
me mature embryo; ie immature embryo.
3 讨论
本研究证明, 玉米成熟胚这种易于获得、可以
随时进行操作的外植体完全可以成为有效的玉米胚
性愈伤组织的诱导起始材料。
形态学和组织学的证据均证明使用幼胚来源的
胚性愈伤组织培养方案对成熟胚来源的胚性愈伤组
织进行继代培养是可行的。在幼胚继代培养基上 ,
成熟胚诱导的胚性愈伤组织生长旺盛、增殖迅速、
状态良好并能稳定继代、扩繁。
用成熟胚诱导胚性愈伤组织时依次形成分生组
织中心和分生组织结节, 随后在分生组织结节的表
面形成胚性细胞团。在胚性愈伤组织继代培养中 ,
不可避免地会夹杂有分生组织结节等非胚性细胞团
(薄壁细胞等), 在最初的第 1~2 次的继代中, 这些
能够继代存活但仅有极低再生能力的非胚性细胞团
仍会占据整个愈伤团的一部分, 从而导致植株再生
效率在统计学上低于幼胚来源的胚性愈伤组织。如果
经过多次继代培养, 非胚性细胞团的成分不断减少,
成熟胚来源的愈伤组织植株再生频率将会逐渐与幼
胚来源的相当。而且采用本研究的继代培养方案可以
迅速扩大成熟胚愈伤组织的基数, 也可在数量上达
到与幼胚来源的胚性愈伤组织相同的植株再生效果。
Zhong等 [16]和Zhang等 [17]利用玉米幼苗芽尖建
立的组织培养体系进行了遗传转化; Sidorov等[15]利
用 7~10 d龄幼苗的中胚轴, 诱导愈伤组织并进行农
杆菌介导的遗传转化, 获得 2%~11%的转化率。但是
直接利用成熟胚萌动的胚芽, 诱导胚性愈伤组织进
行遗传转化的研究尚未见报道。本研究报告基因
GUS和GFP的瞬时表达结果显示, 成熟胚来源的胚
性愈伤组织与幼胚来源的胚性愈伤组织效率相近。
如果以技术体系成熟的幼胚材料作为参照, 可以认
428 作 物 学 报 第 34卷

为, 本研究中使用的成熟胚材料及其技术体系可以
为开展大规模的玉米遗传转化研究提供重要的材料
资源和技术基础。其中四川农业大学培育的 18-599R
幼胚作为优良的转基因受体已有多项报道[7-8,10], 本
研究进一步证明, 18-599R基因型同样适用于成熟胚
来源的愈伤组织的诱导与转化研究。

致谢: 四川农业大学玉米所提供的优良玉米自交系
18-599R 对本研究具有重要意义。在此表示衷心的
感谢!
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