全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(4): 571578 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30971798)，江苏省自然科学基金项目(BK2010474)和江苏省农业科技自主创新基金项目[CX(10)433]资助。
第一作者联系方式: E-mail: yij@jaas.ac.cn, Tel: 025-84391105
Received(收稿日期): 2010-08-30; Accepted(接受日期): 2011-01-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00571
GmCHS8和 GmIFS2基因共同决定大豆中异黄酮的积累
易金鑫 1 徐照龙 1,2 王峻峰 4 张大勇 1 何晓兰 1 ZULFIQAR Ali1,3
朱虹润 1,2 马鸿翔 1 SANGEETA Dhaubhadel5
1 江苏省农业科学院农业生物技术研究所, 江苏南京 210014; 2 南京农业大学农学院, 江苏南京 210095; 3 Department of Plant
Breeding and Genetics, University of Agriculture, Faisalabad 38040, Pakistan; 4 江苏省连云港职业技术学院, 江苏连云港 222006;
5 Agriculture and Agri-Food Canada, London, ON N5V-4T3, Canada
摘 要: 大豆异黄酮受多基因控制, 采用传统育种方法提高大豆异黄酮含量比较困难。我们之前的研究表明, CHS8
基因在异黄酮生物合成过程中发挥着重要作用, 但 CHS8 基因过量表达并不能显著提高异黄酮含量。本研究利用
Microarray技术, 检测了高异黄酮品种 RCAT Angra (RCAT)和低异黄酮品种 Harovinton (HVNT)的 18 362基因在种子
发育过程中表达水平的变化以及大豆种子中异黄酮累积的趋势, 利用 RT-PCR证实 CHS8和 IFS2分别是 CHSs和 IFSs
基因家族中的主要基因; 证实 CHS8 是类苯基丙醇主路径中的主基因, 并发现异黄酮支路中的 IFS2 基因在 RCAT 和
HVNT 品种中表达差异亦达到显著水平。进一步利用发根农杆菌转化系统, 在大豆上分别过量表达 CHS8、IFS2 和
CHS8+IFS2, 前两者异黄酮含量较对照分别提高 65.9%和 34.4%, 但增幅未达显著水平; 而后者则提高了 82.3%, 增
幅达极显著水平(P<0.0001), 因而证实大豆中异黄酮的积累由 CHS8和 IFS2基因共同决定。
关键词: CHS8; IFS2; 过量表达; 共同决定; 大豆异黄酮
GmCHS8 and GmIFS2 Gene Co-Determine Accumulation of Isoflavonoid in
Soybean
YI Jin-Xin1, XU Zhao-Long1,2, WANG Jun-Feng4, ZHANG Da-Yong1, HE Xiao-Lan1, ZULFIQAR Ali 1,3,
ZHU Hong-Run1,2, MA Hong-Xiang1, and SANGEETA Dhaubhadel 5
1 Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210094, China; 2 Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,
China; 3 Department of Plant Breeding and Genetics, University of Agriculture, Faisalabad 38040, Pakistan; 4 Liangyungang Technical College,
Lianyungang 222006, China; 5 Agriculture and Agri-Food Canada, London, ON N5V-4T3, Canada
Abstract: Soybean isoflavonoids (isoFLVs) are natural secondary componds produced in Phenylpropanol metabolism Pathway. In
past ten years, the isoFLVs were proved with anti-cancer activity to human health and therefore intensively included in nowadays
food industry. However, the low content in natural soybean germplasm is a major limit to be weed in desired population. Herein
we report that expression patterns of 18 362 genes were monitored by using Microarray between 30 to 70 days after pollination
(DAP) during the soybean seed development. The expression profile of CHS8 and IFS2 revealed by both Microarray and RT-PCR
indicated these two genes may play critical roles in determination of the accumulation of isoFLV in soybean seeds. According to
Agrobacterium rhizogenes transformation system, over-expression of individuals of CHS8 and IFS2 resulted in 65.9% and 34.4%
isoFLV increase respectively, but not significant in Duncan’s multiple test at the 0.05 probability level. However, co-expression of
CHS8+ IFS2 significantly increased (P<0.0001) the isoFLV content up to 82.3% when comparing to non-transgenic control. Con-
clusively, both IFS2 and CHS8 gene co-determine the accumulation of isoFLV in soybean.
Keywords: CHS8; IFS2; Over-expression; Co-determination; Soybean isoflavonoid content
大豆异黄酮是豆科植物的天然次生代谢产物 ,
是大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)和大豆黄
素(glycitein)三大类化合物的总称[1-2]。异黄酮类产物
不但在植物体内参与防卫反应 [3]及根瘤形成 [4]等重
要生理过程, 同时也是人类理想的天然抗癌防癌物
质[5-7]。目前, 大豆及其制品已成为西方发达国家食
572 作 物 学 报 第 37卷

品工业中的热点、重点[8-9]。但是, 大豆自然种质资
源中异黄酮含量较低[6-10], 因此, 显著提高异黄酮含
量, 已经成为进一步扩大应用大豆异黄酮亟待解决
的问题。
大豆异黄酮含量受多基因控制, 累加效应不显
著, 因而使用传统方法提高大豆异黄酮含量难度较
大, 国内最近育成的品种异黄酮含量大约在 0.4%左
右[11-13]。国外主要采用基因工程的策略来提高异黄
酮的含量。大豆异黄酮是由类苯基丙醇通路的分支合
成, 目前的研究表明, 过量表达 PAL、C4H、4CL、CHS
和 CHI 等基因, 并不能显著增加异黄酮含量[14-20]。
Sangeeta 等[20]利用 Microarray 技术分析发现, CHS8
基因是激活整个类苯基丙醇通路的关键基因, 因而
也是异黄酮累积的关键基因; 过量表达 CHS8 基因,
异黄酮支路代谢水平因主通路被激活而略有提高 ,
异黄酮含量随之略有增加, 但增幅不显著。这暗示
了在主通路以外, 异黄酮支路中可能还存在关键基
因, 两者共同作用下可能显著提高异黄酮含量。
本研究试图利用 Microarray 技术, 检测大豆整
个生育过程中类苯基丙醇主通路及异黄酮支路中所
有已知基因的表达水平及变化趋势, 以期发现异黄
酮支路中的关键基因, 并验证其在异黄酮积累过程
中的作用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
采用近年大豆异黄酮研究常用品种 RCAT An-
gora 和 Harovinton[20-21], 两品种引自加拿大农业部
南方植物保护与食品研究中心, 种子中异黄酮含量
前者为 3 255.1 µg g–1而后者为 2 026.6 µg g–1, 两者
差异显著。
1.2 PCR引物及基因克隆
根据大豆基因组(http://www.phytozome.net/
soybean.php) GmCHS8 (Glyma11g01350)和 GmIFS2
(Glyma13g24200)序列分别设计引物克隆此两基因。
引物分别是 CHS8F: 5-GGGGACAAGTTTGTACA
AAAAAGCAGGCTTCACCatggtgagcgtagctgagat-3,
CHS8R: 5-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCT
GGGTTtcagatggccacactgcgcagaa-3; IFS2F: 5-GGG
GACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACC
atgttgcttgaacttgcactt-3, IFS2R: 5-GGGGACCACTT
TGTACAAGAAAGCTGGGTTttaagaaaggagtttagatg
caa-3, 以上引物中大写字母代表 Gateway 识别通用
序列, 小写字母代表来自基因的特异引物。此外, 因
为 CHS7 和 CHS8 在 CDS 区域内相似性达 96%, 而
5UTR 区域内相差明显, 为特异区别两者, CHS7 和
CHS8的 5端引物设计位于 5UTR内, 而引物 3位于
E x o n 内 , 且两者完全相同。引物序列分别是
CHS7/5UTRf1: 5-gccCTGTGTGTTAACCAATTAAA-
3和 CHS8/5UTRf2: 5-GGTCAGAAGTCAACCACA
TGTT-3, 而 3-端共用引物为 CHS78/EXNr: 5-GAC
TTGTCACACATGCGCTGGAA-3。用于 CHS8取授
粉后不同时期 9 种器官 [ 20 ] , 提取总 RNA, 按照
Invitrogen 反转录试剂盒说明获得单链 cDNA 进行
RT-PCR, 以揭示两者表达的组织特异性。
1.3 Microarray及其数据分析
大豆授粉后 30~70 d, 每 10 d取未成熟种子提取
总 RNA, 参照 Sangeeta 等[20]方法进行 Microarray。
采用 Cluster 软件 (http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.
htm)分析数据和聚类分析基因变化趋势, 并用 Java
Treeview 软件 (http://jtreeview.sourceforge.net/)可视
化作图。
1.4 载体构建及遗传转化
按照 Invitrogen 公司 Gateway BP Clonase II
Enzyme Mix和 Gateway LR Clonase II Enzyme Mix
试剂盒说明, 将候选基因 PCR 产物克隆到中间载体
pDONR221, 进而置换入植物表达载体 pEARLYGATE
103。将构建的质粒 pEARLYGATE::CHS8、pEARLY
GATE::IFS2 和 pEARLYGATE::CHS8+IFS2 通过冻
融法转入发根农杆菌 Agrobacterium rhyzogene K599
菌株, 参照 Yi 等[21-22]转化方法, 以大豆子叶为外质
体获得转基因发状根, 用于异黄酮测定。
1.5 异黄酮含量测定
参照鞠兴荣等 [23]和吴敏等 [24]三波长紫外分光
光度法测定总异黄酮含量。即取大豆发状根 0.2 g在
15 mL 70%乙醇中匀浆, 60℃下提取 2 h, 分别在
243、263和 283 nm波长下比色, 计算异黄酮含量。
2 结果与分析
2.1 大豆种子成熟过程中异黄酮的积累
大豆种子发育过程中, 自授粉后 30~70 d, 每 10
d 测定一次异黄酮含量(图 1)。从图中明显看出, 种
子发育的早期和中期, 即 30~60 d, 异黄酮含量缓慢
增加, 而且高含量品种与低含量品种差异不明显。
此间, Harovinton从 80.3 µg g–1增加至 269.9 µg g–1,
而 RCAT则从 110.5 µg g–1增至 280.2 µg g–1; 种子发
育的成熟阶段, 即 60~70 d, 2 个品种的异黄酮含量
第 4期 易金鑫等: GmCHS8和 GmIFS2基因共同决定大豆中异黄酮的积累 573


都急剧增加并达到最高值, 与之前各生育阶段相比,
差异达极显著(P<0.0001)。品种间异黄酮含量也出现
了明显差异, Harovinton由 269.9 µg g–1激增至 2 026.6
µg g–1, RCAT由 280.2 µg g–1激增至 3 255.1 µg g–1,
此时两品种间相差 1 228.5 µg g–1, 差异极显著(P<
0.0001)。这表明种子发育后期是异黄酮积累的关键
时期, 种子发育至 70 d, 异黄酮含量达到极大值、同
时品种间出现最大差异。Microarray 揭示了大豆种
子发育过程中全基因组基因表达水平的变化。
为探明大豆异黄酮累积过程中, 基因表达水平
的变化 , 采用 Microarray 技术 , 对大豆基因组中
18 362个 EST进行了动态监测。其中, 11 480个 EST
的表达水平在 30~70 d期间出现明显变化(图 2-A)。
根据各基因表达水平的变化趋势, 11 480 个 EST 共
聚为 5 组, 利用每组基因在各时间点的平均表达量,
反映各组基因表达水平的变化(图 2-B)。
第 I组包括 2 821个 EST, 共同特征是 30~60 DAP
基因表达水平微幅增加, 而 60~70 DAP表达水平急剧



图 1 大豆种子发育过程中异黄酮含量变化
Fig. 1 Changes of isoflavonoid contents with growth days after
pollination (DAP) in developing soybean seeds
图柱上标有不同字母表示在 0.01水平上显著。
Different superscripts mean significant difference at the 0.01
probability level.



图 2 11 480个基因在授粉后 30~70 d表达水平的变化
Fig. 2 Expression profile of 11 480 genes during 30 DAP and 70 DAP
A: 利用 Cluster软件聚类分析, 将 11 480个基因分为 5组。H和 R分别代表 Harovinton和 RCAT; B: 根据每组基因在各时间点的平均
表达量, 揭示各组基因表达水平的变化。DAP为授粉后天数。黑色和红色折线分别代表各组基因在 Harovinton和 RCAT两个品种中
表达水平的变化。
A: five groups were clustered over tested 11 480 genes based on Cluster software, and were further visualized by using Java Treeview. DAP
means days after pollination. H and R represent Harovinton and RCAT, respectively; B: expression patterns revealed by average expression
value of the group at each time point. The lines in black and red represent soybean cultivar Harovinton and RCAT, respectively.
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增加, 而且在 RCAT 上增加幅度大于 Harovinton。第
II组仅包含 50个基因, 在种子发育早期(30~40 DAP),
表达水平明显下降 ; 而在中期(40~60 DAP)和后期
(60~70 DAP), 表达量因品种而异: 在 RCAT中呈持
续增加态势, Harovinton 上则在中期增加而后期降
低。第 III组包括多达 5 355个基因, 在种子发育早
期, 表达量持续增加而中后期则持续降低, 且两品
种间差异不明显; 第 IV 组包括 2 033 个基因, 除发
育中期(40~50 DAP), 表达水平相对平稳, 其他阶段
则呈不断下降的趋势; 第 V 组中 1 230 个基因在发
育早期和中期(30~60 DAP), 表达水平呈缓慢上升趋
势, 后期(60~70 DAP)则急剧下降。
需要强调指出的是, 第一组基因的表达模式与
异黄酮累积模式完全一致(图 1和图 2-B), 这暗示异
黄酮的积累可能与该组基因的表达存在某种直接联
系。为此, 进一步梳理该组基因, 发现合成异黄酮的
类苯基丙醇通路及异黄酮合成支路中共有 7个基因,
其中 5个基因及其多个等位基因, 共计 17个基因均
包含在本组。这 5个基因家族分别是 CHIs、CHRs、
CHSs、IFSs和 PALs。
2.2 类苯基丙醇通路中与异黄酮合成直接相关
基因表达水平的变化
为了发现合成异黄酮的关键基因, 笔者比较了
类苯基丙醇通路及异黄酮合成支路所有 7 个基因家
族所有 EST 在各时间点的表达水平, 两个品种异黄
酮累积及 EST表达水平在 70 DAP差异最大, 如图 1
和图 4。图 3 中, 7 个基因家族共 54 个 EST 之间比
较, 相对表达量超过 3.0 的仅有 CHSs 基因家族的
AI437793、AI441937 和 AI443042, 以及 IFSs 基因
家族的 AW830241、AW423393 和 AI443120。这 6
个 EST 在 RCAT(高异黄酮含量品种)中的表达量显
著高于Harovinton (低异黄酮含量品种)中; 其余 5个
基因家族表达量较低, 全部低于 3, 而且在 2个品种
之间没有明显差异。此外, 考虑到这 6 个 EST 全部
属于第 I 组, 即该组 EST 的表达模式与异黄酮累积
模式完全一致, 推测这 2 个基因家族共 6 个 EST 在
大豆异黄酮合成过程中发挥关键作用。
将以上所述 6 个 EST 序列比对大豆基因组后
(http://www.phytozome.net/soybean.php)发现 , AI
437793 为来自 CHS7 的 EST, 而 AI441937 和
AI443042 均来自 CHS8; 另外 IFSs 基因家族的 3 条
EST均来自 IFS2基因。考虑到 CHS7和 CHS8之间
96%的序列相似性, AI437793和 CHS8也有 97.4%的
相似性, 推测 AI437793未必能有效地区分 CHS7和
CHS8。为此, 利用 CHS7和 CHS8特异引物, 在大豆
不同发育阶段的 21 个器官进行 RT-PCR (图 4)。结
果发现, CHS8 仅特异性地在大豆的胚及花中表达,
CHS7则特异性地在豆荚外壳、花及叶片中表达, 而
前述 Microarray 的试材仅取自于大豆不同发育阶段
的胚。综合上述 Microarray 和 RT-PCR 的结果, 确
定与异黄酮合成直接相关的 7个基因家族共 54个基
因中, 表达水平最高、高低品种间差异最大而且表
达模式与异黄酮积累模式完全吻合的仅为 CHS8 和
IFS2两个基因。
2.3 过量共表达 IFS2 和 CHS8 基因可明显提高
异黄酮含量
为了验证 CHS8和 IFS2基因在大豆异黄酮合成
中的关键作用, 利用基于 Gateway 技术的 pEARLY
GATE103分别构建 CHS8、IFS2以及 CHS8+IFS2 共
转化过量表达载体(图 5)。以含有 GFP (绿色荧光蛋



图 3 异黄酮合成直接相关的 7个基因家族的 54个基因在 Harovinton和 RCAT-Angora品种中的表达水平
Fig. 3 Expression profile of 54 genes involved in seven gene families directly associated isoflavonoid biosynthesis in soybean
cultivars Harovinton and RCAT-Angora
第 4期 易金鑫等: GmCHS8和 GmIFS2基因共同决定大豆中异黄酮的积累 575




图 4 RT-PCR显示 CHS7和 CHS8器官特异性表达
Fig. 4 Tissue specific expression pattern of CHS7 and CHS8 revealed by RT-PCR
M: marker; 1: 5DAP; 2: 10DAP; 3: 15DAP; 4: 20DAP; 5: 30DAP; 6: 40DAP; 7: 50DAP; 8: Flower buds; 9: 20DAP; 10: 30DAP; 11: 40DAP;
12: 30DAP; 13: 40DAP; 14: 50DAP; 15: Flower; 16: early leaf; 17: mediate leaf; 18: early stem; 19: mediate stem; 20: mediate root; 21: late root.



图 5 表达载体示意图
Fig. 5 Sketch map of expression constructs
构建表达载体 pEARLYGATE::CHS8、pEARLYGATE::IFS2和
pEARLYGATE::CHS8 +IFS2。
Gateway-based over-expression constructs for pEARLYGATE::CHS8,
pEARLYGATE::IFS2, and pEARLYGATE::CHS8 +IFS2.



图 6 绿色荧光蛋白验证发根农杆菌转化系统
Fig. 6 Validation of Agrobacterium rhizogene-mediated trans-
formation system using green florescent protein (GFP)
发根农杆菌介导的遗传转化系统: A: 发根农杆菌侵染后形成发
状根; B: 395 nm波长紫外光激发 509 nm发射, 绿色荧光显示转
基因发状根。
Agrobacterium rhizogene-mediated transformation system. A: hairy
roots formed after infection of A. rhizogene; B: GFP (green flores-
cent protein) showing the transgenic hairy roots under ultraviolence
with wavelength of 395/509 nm (excited/emission).

白)验证发根农杆菌转化系统(图 6)。过量表达 CHS8、
IFS2 和 CHS8+IFS2, 总异黄酮相对含量依次比对照
提高 65.9%、34.4%和 82.3%, 经方差分析, 分别过
量表达 CHS8 和 IFS2 虽较对照有所提高, 但未达到
显著水平, 而过量表达 CHS8+IFS2, 在 1%水平上极
显著高于对照(P<0.0008)(图 7)。
3 讨论
3.1 IFS2和 CHS8共同决定大豆异黄酮的积累
类苯基丙醇代谢途径是植物界中被了解最为详
尽的代谢途径之一, 包括异黄酮、黄酮、丹宁和花


图 7 IFS2和 CHS8基因共表达明显提高异黄酮含量
Fig. 7 Co-expression of CHS8 and IFS2 results increase of the
isoflavonoid contents in soybean
转基因发状根中异黄酮含量的变化。图中 A、B表示在 α=0.01
水平上显著性测验, 相同字母表示差异不显著。
Variation of ioflavonoid contents in hairy roots with transformation
of CHS8, IFS2, and CHS8+IFS2, respectively. Bars supercoiled by
different capital letters are significantly different at the 0.01
probability level.

青素等合成支路[25-26]。图 8 中列出了目前研究比较
深入的主路径上 7 个基因、异黄酮支路上 3 个基因
和黄酮支路上 1个基因, 其中查尔酮合成酶(CHS)是
类苯基丙醇代谢途径的分支酶, 该基因的 2个产物经
CHI 异构化, 分别为异黄酮支路、黄酮支路及主路
径下游基因提供底物, 因此, 该基因对于整个类苯
基丙醇代谢途径活性都具有重要影响, 在异黄酮生
物合成过程中发挥重要作用[20]。CHSs基因家族在大
豆基因组中共有 8 个等位基因, 本研究中, CHS8 基
因表达活性位居整个类苯基丙醇代谢途径之首, 即
使在整个基因组所有检测的 18 362个基因中也高居
第 8位, 明确支持前述 Sangeeta等[20]的结论。但是,
过量表达 CHS8, 可以提高异黄酮含量, 却增量不显
著, 这与前人研究结果一致。例如 Zernova等[15]在大
豆中以 CaMV 35S启动子分别驱动 PAL、CHS和 IFS
过量表达, 未能检测到异黄酮含量显著增加; 改用
大豆种子储藏蛋白基因(b-conglycinin)的启动子分别
过量表达上述 3 个基因, 异黄酮含量仍无显著增加。
Shirley等[19]和 Jez等[17]先后将 CHS基因和黄酮醇合
成酶(FLS)基因导入番茄, 转基因果肉中花青素合成
576 作 物 学 报 第 37卷



图 8 类苯基丙醇代谢途径示意图
Fig. 8 Brief dendrogram of phenylpropanoid pathway
白色圆圈代表与异黄酮生物合成直接相关的 7个基因家族。PAL:
苯丙氨酸裂解酶; C4H: 肉桂酸-4-羧化酶; 4CL: 香豆酸辅酶A连
接酶; CHS: 查尔酮合成酶; CHI: 查尔酮异构酶; F3H: 黄烷酮-3-
羟化酶; DFR: 二羟基黄酮醇还原酶; CHR: 查尔酮还原酶;
IFS: 异黄酮合成酶; FNS: 黄酮合成酶。
White circles represent seven gene families directly associated with
isoflavonoid biosynthesis.
PAL: phenylalanine ammonia lyase; C4H: cinnamic acid
4-hydroxylase; 4CL: 4-coumarate:coenzyme A ligase;
CHS: chalcone synthase; CHI: chalcone isomerase; F3H: flavonoid
3’-hydroxylase; DFR: dihydroflavonol 4-reductase; CHR: chalcone
reducase; IFS: isoflavone synthase; FNS: flavone synthase.

和黄酮合成支路的底物水平显著提高, 黄酮醇类物
质积累增加, 但未见异黄酮合成增加。此外, 过量表
达 CHS 基因激活子的尝试表明, 虽然可以明显提高
CHS 的表达活性, 但其结果往往显著增加类苯基丙
醇主路径产物花青素的合成和积累, 而作为支路产
物的异黄酮积累有所增加, 但增量不显著。例如玉
米 C1 MYB转录因子与Myc转录因子 R的结合可以
激活查尔酮合成酶(CHS)和异构酶(CHI)的活性 [27],
Bruce等[28]进一步组装了玉米转录因子 C1和 R编码
区的嵌合体基因 CRC, 在玉米 BMS细胞中表达, 结
果显示该转录因子能激活 CHS 基因的表达, 增加花
青素的合成和积累, 表现为细胞组织由白色转为微
红色 , 但经 HPLC 检测 , 未发现染料木素的积累 ;
Oliver 等[29]则在大豆种子中表达玉米的 C1 和 R 转录
因子, 发现可以提高大豆黄素(daidzein)积累, 但降低
了染料木素(genistein)的积累, 异黄酮总体水平变化
不大。综合分析所有证据认为, CHS基因是整个类苯
基丙醇代谢途径的关键基因, CHS 基因的激活可以
提高包括各条支路在内的整个途径的代谢水平, 但
相比较而言, 以主路径产物增加为主, 而各条支路
(包括异黄酮支路)产物有所增加, 但增量不明显。同
时 , 也暗示 , 就提高大豆总异黄酮含量而言 , 高水
平表达 CHS 基因是其必要前提, 但在异黄酮支路内
可能还存在其他基因, 两者共同作用才能决定总异
黄酮含量。
IFS2 是异黄酮支路内直接催化生成异黄酮的基
因。本研究发现, 其表达活性仅次于 CHS8、且远高
于类苯基丙醇代谢途径内其他所有基因 ; 此外 ,
IFS2 和 CHS8 基因在高异黄酮品种表达活性明显高
于在低异黄酮品种, 但 IFS2基因在高低品种间差异
幅度小于 CHS8在两品种间的差异。据此推测, IFS2
基因是大豆异黄酮合成的又一关键基因, 但其效应
可能略小于 CHS8基因。本研究中过量表达 IFS2可
提高异黄酮相对含量至 1.34 倍, 略小于过量表达
CHS8基因的 1.66倍, 证实其效应确实低于前者, 总
异黄酮含量虽有增加但并未达显著水平。其原因可
能如 Oliver 等[30]所述, 由于异黄酮合成酶(IFS)是合
成路径的中间酶, 仅仅过量表达 IFS 基因, 受底物
水平的限制, 稳定提高异黄酮类化合物的整体水平
是比较困难的。但 CHS8 和 IFS2 两者共表达后, 异
黄酮相对含量则增加到 1.82 倍, 增量达极显著水平
(P<0.0008)。由此证实, CHS8和 IFS2共同决定大豆
异黄酮的生物合成量。其他相近研究也提供了间接
证据, 例如 Oliver等[30]检测 CHS基因的激活子 CRC
基因在染料木素(异黄酮类)合成过程中的作用时发
现, 用 35S启动子分别驱动 IFS和 CRC基因在玉米
BMS 细胞中持续共表达, 有高达 95%的 BMS 细胞
由白色转为浅红色 , 表明花青素积累增加 , 而且
HPLC检测显示染料木素明显增加。再如Oliver等[29]
在过量表达 IFS 基因的拟南芥中, 另加紫外光(UV)
处理, 能显著提高异黄酮支路合成水平, 但伴随花
青素合成极显著增加, 整株呈现深紫色。究其原理,
可能是由于限制异黄酮积累的主要因素是异黄酮合
成酶(IFS)的底物水平, 过量表达 CHS 或其激活子,
甚至 UV处理, 都显著提高 CHS基因表达活性[31-32],
进而激活整个类苯基丙醇代谢途径, 为异黄酮支路
提供额外且数量充足的底物, 加之 IFS 基因的过量
表达, 从而提高异黄酮类产物的积累。
此外, 在前述过量表达激活子 CRC[30]及紫外光
照射[29]的实验中都出现了花青素异常积累, 如 BMS
细胞由白色转为浅红色及拟南芥整株显紫色, 暗示
了 CHS 基因表达过度, 除满足异黄酮合成支路因过
量表达 IFS 基因而额外增加的底物需求外, 仍有大
量过剩并进而导致主路径产物花青素异常积累。这
提示研究人员, 在提高异黄酮含量的分子育种过程
中, 过量共表达 CHS8 和 IFS2 时, 必须选用恰当的
启动子, 以保持两者之间合适的比例关系, 既提高
异黄酮含量, 又避免花青素异常积累, 维持其原有
的农艺性状。
第 4期 易金鑫等: GmCHS8和 GmIFS2基因共同决定大豆中异黄酮的积累 577


3.2 IFS2 和 CHS8 与大豆异黄酮含量相关 QTL
的关系
近年来, 数量性状位点(quantitative trait loci,
QTL)被广泛地运用于数量性状的分子标记辅助育
种, 包括大豆异黄酮含量 QTL[33-34]。为了探明 CHS8
和 IFS2与大豆异黄酮含量相关QTL的关系, 将大豆
CHS基因族的 8个等位基因定位到 9条染色体上, 其
中 CHS8定位在 Gm11:793661..794583 (表 1); IFS基
因族的两个等位基因定位在 7 号和 13 号染色体,
IFS2 则定位在 Gm07:37261175..37261619。根据
Primomo等[33]和Meksem等[34]的报道, 将不同年份、
不同群体、不同地理位置情况下重复出现的 QTL定
位到基因组中, 发现 4个QTL定位在第 11号染色体,
相距 CHS8基因 13.8 cM至 18.6 cM, 3篇文献中提到
该 QTL 对异黄酮含量变化的解释率高达 37%~55%;
而另外 6 个 QTL 则集中定位在 7 号染色体, 相距
IFS2基因 4.9 cM至 58.5 cM, 对异黄酮含量变化的
解释率为 7.7%~21.9%。此外 , 笔者还注意到前述
PAL、C4H、4CL、CHI和 CHR等 5个基因家族, 在
上述报道的 3 个群体中无一重复出现, 而且对异黄
酮含量变异的解释率全部低于 10%, 再次印证了本
文结论。

表 1 CHS8和 IFS2在基因组中定位以及它们与已经发表的与异黄酮含量相关的 QTL之间的联系
Table 1 Localization of CHS8 and IFS2 in soybean genome and relationship between the two genes and the published QTLs
conferring isoflavone content in soybean
基因
Gene
在基因组中定位
Genomic location
QTL 在基因组中定位
Genomic location
距离
Distance (cM) 1)
参考文献
Reference
CHS Gm01:29149998..29150267
Gm02:51243351..51243957
Gm06:9634458..9634587
Gm08:8384440..8384620
Gm09:8193622..8196216
Gm11:793661..794583 Satt251 Gm11:6859124 13.8 Primomo V S, et al. [33]
Satt251 Gm11:6859124 13.8 Primomo V S, et al. [33]
Satt251 Gm11:6859124 13.8 Meksem K, et al. [34]
Satt197 Gm11:8911063..8912113 18.6 Primomo V S, et al. [33]
Gm14:456517..457492
Gm18:60910353..60910900
Gm19:35280487..35280953

IFSs Gm07:37261175..37261619 isoflv1-5 Gm07:2006025..2006305 58.5 Primomo G, et al. [33]
isoflv1-6 Gm07:9320915..9320710 21.3 Primomo G, et al. [33]
isoflv1-7 Gm07:4963107..4962954 11.4 Primomo G, et al.[33]
Satt201 Gm07:2006025 4.6 Primomo V S, et al. [33]
Satt540 Gm07:4963107 11.4 Primomo V S, et al. [33]
Satt245 Gm07:9320915 21.3 Primomo V S, et al. [33]
Gm13:27567540..27568105
1) 1 cM=437 kb

4 结论
类苯基丙醇主路径及异黄酮支路中的 CHS8 和
IFS2基因表达水平在高异黄酮品种 RCAT中显著高
于在低异黄酮品种 HVNT中。利用发根农杆菌转化
系统过量表达 CHS8+IFS2, 异黄酮含量较对照提高
了 82.3%, 增幅达显著水平(P<0.0001), 证实大豆中
异黄酮的积累由 CHS8和 IFS2基因共同决定。

致谢: 感谢南京农业大学喻德跃教授审读全文。
References
[1] Wang C-E(王春娥), Liu S-Y(刘叔义). The component, content
and characteristic of isoflavone in soybean. Food Sci (食品科学),
1998, 19(4): 39–43 (in Chinese with English abstract)
[2] Zhang Y-Z(张永忠), Sun Y-M(孙艳梅). Technical terms in the
study of soybean isoflavone. Chin Cereals Oils Assoc (中国粮油
学报), 2004, 19(4): 50–52 (in Chinese)
[3] Deavours B E, Dixon R A. Metabolic engineering of isoflavonoid
biosynthesis in alfalfa. Plant Physiol, 2005, 138: 2245–2259
[4] Downie J A, Walker S A. Plant responses to nodulation factors.
Curr Opin Plant Biol, 1999, 2: 483–489
578 作 物 学 报 第 37卷

[5] Davis S R, Dalais F S, Simpson E R, Murkies A L. Phytoestro-
gens in health and disease. Recent Prog Horm Res, 1999, 54:
185–210
[6] Watanabe S, Yagamuchi M, Sobne T, Takahashi T, Arai T,
Mazur W, Wakala K, Adlercreutz H. Pharmacokinetics of soy-
bearls in plasma, urine and feces of men after ingestion of 60 g
baked soybean powder (kinako). J Nutr, 1998, 128: 1710–1715
[7] Wei F-H(魏福华). A brief account of soybean isoflavones. Culi-
nary Sci J Yangzhou Univ (扬州大学烹饪学报), 2006, 3: 62–64
(in Chinese with English abstract)
[8] Yin L-J(殷丽君), Li L-T(李里特), Li Z-G(李再贵). Develop-
ment and expectation of research on soybean isoflavone. Food
Sci (食品科学), 2002, 23(4): 152–154 (in Chinese with English
abstract)
[9] Zhang Y-K(张延坤), Ma Y(马燕). Characterization and special
physiological function of soybean isoflavone. J Prev Med Chin
People’s Leberation Army (解放军预防医学杂志), 2003, 21(4):
307–310 (in Chinese)
[10] Xia J-Q(夏剑秋), Liu Y-F(刘宇峰). Research and development
trend of soybean isoflavone production in China and overseas.
China Oils Fats (中国油脂), 2002, 27(5): 10–12 (in Chinese with
English abstract)
[11] Sun J-M(孙君明), Ding A-L(丁安林), Chang R-Z(常汝镇).
Qualitative-quantitative analysis for inheritance of isoflavone
content in soybean seeds. Soybean Sci (大豆科学), 1998, 17(4):
305–310 (in Chinese with English abstract)
[12] Sun J-M(孙君明), Ding A-L(丁安林), Chang R-Z(常汝镇). Pri-
mary genetic analysis of isoflavone content in soybean seeds. Sci
Agric Sin (中国农业科学), 2002, 35(1): 16–21 (in Chinese with
English abstract)
[13] Zhang D-Y(张大勇), Xu J(徐杰), Zhang S-Z(张淑珍), Jiang
Z-F(姜振峰), Li W-B(李文滨). Some research advance of ge-
netic and eco-physiological factors affecting isoflavone contents
in soybean seeds. J Northeast Agric Univ (东北农业大学学报),
2006, 37(4): 525–528 (in Chinese with English abstract)
[14] Oliver Y, Brian M. Metabolic engineering of Isoflavone biosyn-
thesis. Adv Agron, 2005, 86: 147–190
[15] Zernova O V, Ulanov A V, Lygin A V, Widholm J M, Lozovaya
V V. Genetic modification of soybean seed isoflavone content
and composition. the 9th Biennial Conference of the Cellular and
Molecular Biology of the Soybean (Urbana-Champaign IL Col-
lege of Agricultural Science), 2002
[16] Verhoeyen M E, Bovy A, Collins G, Muir S, Robinson S, de Vos
C H R, Colliver S. Increasing antioxidant levels in tomatoes
through modification of the flavonoid biosynthetic pathway. J
Exp Bot, 2002, 53: 2099–2106
[17] Jez J M, Bowman M E, Dixon R A, Noel J P. Structure and
mechanism of the evolutionarily unique plant enzyme chalcone
isomerase. Nat Struct Biol, 2000, 7: 786–791
[18] Jung W, Yu O, Lau S C. Identification and expression of
isofiavone synthase, the key enzyme for biosynthesis of isofla-
vone in legumes. Nat Biotechnol, 2000, 18: 208–212
[19] Shirley B W, Hanley S, Goodman H M. Effects of ionizing radia-
tion on a plant genome: analysis of two Arabidopsis transparent
testa mutations. Plant Cell, 1992, 4: 333–347
[20] Sangeeta D, Mark G, Pat M, Mana F. Transcriptome analysis re-
veals a critical role of CHS7 and CHS8 genes for isoflavonoid
synthesis in soybean seeds. Plant Physiol, 2007, 143: 326–338
[21] Yi J X, Derynck M R, Li X, Telmer P, Marsolais F, Dhaubhadel
S. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regu-
lates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis
in soybean. Plant J, 2010, 62: 1019–1034
[22] Yi J X, Michael R D, Ling C, Sangeeta D. Differential expression
of CHS7 and CHS8 genes in soybean. Planta, 2010, 231: 741–753
[23] Ju X-R(鞠兴荣), Yuan J(袁建), Wang H-F(汪海峰). Determina-
tion of total isoflavone content in soybean seeds by using
three-wavelength ultraviolet lights. Food Sci (食品科学), 2001,
22(5): 46–48(in Chinese)
[24] Wu M(吴敏), Yuan J(袁建), Yu T(俞阗), Li Y(李燕), Wang
H-L(王红玲), Zhang J-S(张巨松), Ma H(麻浩). Determination of
total isoflavone content in chickpea seeds by three-wave-
length UV spectrophotometry. Agric Res Arid Areas (干旱地区
农业研究), 2007, 25(6): 96–101 (in Chinese with English abstract)
[25] Forkmann G, Martens S. Metabolic engineering and applications
of flavonoids. Curr Opin Biotechnol, 2001, 12: 155–160
[26] Yang Z-R(杨致荣), Mao X (毛雪), Li R-Z(李润植). Research
progress in genetic engineering of plant secondary metabolism. J
Plant Physiol Mol Biol, 2005, 31(1): 11–18 (in Chinese with
English abstract)
[27] Grotewold E, Chamberlin M, Snook M, Siame B, Butler L,
Swenson J, Maddock S, Clair G S, Bowen B. Engineering sec-
ondary metabolism in maize cells by ectopic expression of tran-
scription factors. Plant Cell, 1998, 10: 721–740
[28] Bruce W, Folkerts O, Garnaat C, Crasta O, Roth B, Bowen B.
Expression profiling of the maize flavonoid pathway genes con-
trolled by estradiol-inducible transcription factors CRC and P.
Plant Cell, 2000, 12: 65–80
[29] Oliver Y, Jung W, Shi J. Production of the isofiavones genistein
and daidzein in non-legume dicot and monocot tissues. Plant
Physiol, 2000, 124: 781–793
[30] Oliver Y, Shi J, Hession A O, Maxwell C A, McGonigle B, Odell
J T. Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in
soybean seed. Phytochemistry, 2003, 63: 753–763
[31] Kreuzaler F, Ragg H, Fautz E, Kuhn D N, Hahlbrock K.
UV-induction of chalcone synthase mRNA in cell suspension
cultures of Petroselinum hortense. Proc Natl Acad Sci USA, 1983,
80: 2591–2593
[32] Hartmann U, Valentine W J, Christie J M, Hays J, Jenkins G I,
Weisshaar B. Identification of UV/blue light-response elements
in the Arabidopsis thaliana chalcone synthase promoter using a
homologous protoplast transient expression system. Plant Mol
Biol, 1998, 36: 741–54
[33] Primomo V S, Poysa V, Ablett G R, Jackson C J, Gijzen M, Ra-
jcan I. Mapping QTL for individual and total isoflavone content
in soybean seeds. Crop Sci, 2005, 45: 2454–2462
[34] Meksem K, Njiti V N, Banz W J, Iqbal M J, Kassem M M, Hyten
D L, Yuang J, Winters T A, Lightfoot D A. Genomic regions that
underlie soybean seed isoflavone content. J Biomed Biotechnol,
2001, 1: 38–44