全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(11): 1949−1955 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30571096)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 马凤鸣, E-mail: fengming_ma@sohu.com, Tel: 0451-55191947; 陈连江, E-mail: chen4004@163.com,
Tel: 0451-86609481
第一作者联系方式: E-mail: dgz@hlju.edu.cn, Tel: 0451-86604561
Received(收稿日期): 2011-04-02; Accepted(接受日期): 2011-07-15; Published online(网络出版日期): 2011-09-06.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110906.1103.011.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01949
甜菜 nia基因的克隆及不同氮素形态诱导的差异表达
丁广洲 1,2 侯 静 2 陈 丽 1 马凤鸣 2,* 陈连江 1,*
1 中国农业科学院甜菜研究所, 黑龙江哈尔滨 150080; 2 东北农业大学, 黑龙江哈尔滨 150030
摘 要: 利用同源序列克隆方法从二倍体甜菜品种 Ty7中获得氮素诱导 nia基因片段, 通过 RACE技术克隆 nia基因
全长序列, 该基因 ORF长度 2 718 bp, 编码 905个氨基酸, 并已在 GenBank上登录(EU163265), 基因组中 nia以低拷
贝数存在。nia 编码蛋白的等电点为 6.12, 推测分子量为 102 kD, 以 NADH 为电子供体。为揭示不同氮素形态和处
理对甜菜 nia 基因表达的影响, 采用半定量 PCR 方法检测不同氮素形态诱导 nia 基因 mRNA 的表达, 同时测定酶活
力。结果表明, 当铵态氮诱导 nia基因时, 低浓度的铵离子能促进基因的表达, 过高浓度的铵离子抑制基因的表达。
当硝态氮诱导 nia基因时, 随处理浓度的增加, nia的表达加强, 呈正相关关系。用 30 mmol L–1硝态氮诱导 4 h后, nia
基因表达达最高值, 约在 6 h后, 表达明显下降。
关键词: nia基因克隆; 氮素形态和处理; 基因表达
Cloning of nia Gene and Its Differential Expression Induced by Different Nitro-
gen Forms in Sugar Beet (Beta vulgaris L.)
DING Guang-Zhou1,2, HOU Jing2, CHEN Li1, MA Feng-Ming2,*, and CHEN Lian-Jiang1,*
1 Sugar Beet Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150080, China; 2 College of Agriculture, Northeast Agricultural
University, Harbin 150030, China
Abstract: From diploid species Ty7, a cDNA clone related to nitrate reduction was isolated by Homology-based cloning. Accord-
ing to its sequences information, a novel full-length cDNA termed nia (accession number: EU163265) was obtained by using
rapid amplification of cDNA ends (RACE). nia was 3 247 bp long containing a 2 718 bp ORF, encoded 905 amino acids with a
theoretical molecular weight of 102 kD and an isoelectric point of 6.12. Southern bloting proved that nia gene of Ty7 existed in
the form of low copies. It was also proved that this clone was the style of NADH-NR. To reveal the effect of nitrate and ammo-
nium nitrogen on nia expression, we determined NR activity in sugar beet under the treatment of nitrate and ammonium. Gene
transcripts of nia were detected by semi-quantitative PCR. Efficiency of mRNA synthesis from each sample was estimated by
quantitative PCR of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). The results showed that when nia gene was induced
by ammonium, the gene expression was promoted with low concentration of ammonium ion, while inhibited by high concentra-
tion of ammonium ion. When nia gene was induced by nitrate, being positively correlated with the concentration, the gene expres-
sion was enhanced with the increase of the concentration. By 30 mmol L–1 nitrate induction for four hours, nia gene expression
reached the highest value, and at about six hours of induction, the expression decreased significantly.
Keywords: Nia gene cloning; Nitrogen form and processing; Gene differential expression
nia 是植物氮代谢中的重要调节基因, 也是限
速基因[1]。nia编码的硝酸还原酶 NR是存在于胞质
中可溶的电子转运蛋白, 一般单体包含一个 100 kD
左右的多肽, 还原硝酸盐到亚硝酸盐的过程经还原
吡啶核苷酸 , 辅酶(NADH)或辅酶磷酸盐(NADPH)
催化, 电子转移一般要通过亚铁血红素结合酶, 黄
素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)
和钼因子(Mo cofactor)的调节[2]。大多数 NR为底物
1950 作 物 学 报 第 37卷

诱导酶, NO3−对NR的诱导作用发生在转录水平[3-5]。
氮饥饿的烟草植株在加入充足 NO3−几分钟后, nia
mRNA迅速积累, 几个小时以后 NR也累积[6]。而在
菜豆上的研究表明 , 当植株放入硝酸盐介质中时 ,
其叶片 nia mRNA快速表达, 4 h后达最大稳态水平,
在此后的 20 h 内, 尽管仍有硝酸盐的存在, 但转录
水平缓慢下降[7]。目前, nia基因至少已在菜豆[8-9]、
菠菜 [10-11]、玉米 [12]、烟草 [13-14]、拟南芥 [15-16]、水
稻[17]、大豆[18]、番茄[19]、大麦[20-21]、甘蓝型油菜[22]、
蓖麻[23]、不结球型白菜[24]、矮牵牛[25]、笋瓜[2]上被
克隆。目前, 还没有其他的关于甜菜 nia基因全序列
被克隆注册的报道。本实验在克隆甜菜二倍体品种
Ty7 nia基因的基础上, 通过半定量 PCR方法结合酶
活力测定, 检测了不同氮素形态和处理诱导下 nia
基因的表达差异。
1 材料与方法
1.1 供试品种
采用黑龙江省甜菜(Beta vulgaris L.)主栽二倍
体(diploid species)品种甜研 7 号(Ty7), 原种由中国
农业科学院甜菜研究所提供。将种子在室温下浸种
过夜, 置培养皿中 25℃恒温培养 24~48 h使之萌发,
定植至营养钵中, 于光照培养箱中培养, 待植株长
出 2对真叶时以硝酸钾(30 mmol L–1 KNO3)诱导处
理, 用于实验操作。
1.2 甜菜 nia基因的克隆
取硝酸钾诱导后的甜菜叶片 0.1 g, 使用 Trizol
试剂盒(Invitrogen, USA)提取总 RNA, 电泳检测其
质量, –70℃保存。前期利用同源序列克隆技术筛选
拼接得到一个 1 438 bp nia基因片段。采用 SMART
RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA)进行
5′端和 3′端的 RACE 反应。根据中间片段设计特异
性引物(GSP见表 1)。以 5′GSP与 UPM引物扩增基
因的 5′端, 反应经 5个循环(94 30 s, 72 3 min); 5℃ ℃
个循环(94 30 s, 70 30 s, 72 3 min); 20℃ ℃ ℃ 个循环
(94 30 s, 58.7 30 s, 72 3 min), 4℃ ℃ ℃ ℃保存。以
3′GSP与 UPM引物扩增基因的 3′端, 反应经 5个循
环(94 30 s, 72 3 min); 5℃ ℃ 个循环(94 30 s, 70 ℃ ℃
30 s, 72 3 min); 25℃ 个循环(94 30 s, 62 30 s, ℃ ℃
72 3 min), 4℃ ℃保存。将 PCR产物电泳条带切下,
按照 TIAN gel Midi Purification Kit使用说明书回收,
连接到 pEASY-T1 载体上 , 转化连接产物到
Trans1-T1感受态细胞中。挑取白色单克隆培养, 使
用通用引物 M13正反向引物鉴定阳性克隆。

表 1 试验中采用的引物
Table 1 Primers used in this study
引物
Primer
序列
Sequence
5-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3 5′RACE primer
5-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3
5-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3 3′RACE primer
5-CGCGGTTCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3
S103 5′-GCGTAGTCTTTTCTCTTTTCCTTTT-3′
A3024 5′-ATTGACTCCCAAGGCGATTACACAG-3′
GAPDH(F) 5′-CACATTTCTCATTTCTTCACCAT-3′
GAPDH(R) 5′-TCGAAAACTGCAGCTATGTATTA-3′
5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′ 通用引物 Consensus primer
5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′

1.3 硝态氮不同处理 nia基因的表达
采用 Hoagland营养液配方, 并在此基础上略做
改进。用硝态氮(KNO3)诱导幼苗。按营养液中 NO3−
的浓度比例, 设处理 T1 (10 mmol L–1); 处理 T2 (20
mmol L–1); 处理 T3 (30 mmol L–1); 处理 T4 (40
mmol L–1); 处理 T5 (50 mmol L–1)。将长出 2对真叶
的处于氮饥饿的甜菜幼苗用去离子水洗净根部, 放
入装有不同处理浓度的营养液中处理 4 h, 光源为日
光灯, 光量子数为 30 μmol m–2 s–1, 测定硝酸还原酶
活力(NRA)。采用半定量 PCR检测mRNA的积累量。
1.3.1 反转录合成 cDNA 取各样本RNA 2 μg按
SuperScript III Reverse Transcriptase试剂盒(Invitro-
gen)操作方法, 在一个 DEPC处理过的 Eppendorf离
心管中加入总 RNA 2 μg, 0.5 μg μL−1 Oligo(Dt)18 1
μL, 加 DEPC处理的灭菌水补至 12 μL, 稍离心混合
后 70℃反应 5 min, 取出后立即放于冰上, 然后加入
第 11期 丁广洲等: 甜菜 nia基因的克隆及不同氮素形态诱导的差异表达 1951


5×buffer 4 μL, Ribonuclease inhibitor (核糖核酸酶抑
制剂) 1 μL, 10 mmol L−1 dNTP mix 2 μL, 混匀后
37℃反应 5 min, 再加 200 U μL−1 SuperScript III
Reverse Transcriptase 1 μL, 42℃反应 1 h, 取出放于
70℃加热 10 min终止反应。获得 cDNA模板, 保存
于−20℃用于 PCR扩增。
1.3.2 半定量 PCR反应 反应体系为 50 μL, 于
PCR管中加入反转录产物 cDNA模板 1~2 μL (cDNA
模板的加入量依据使用的样品和看家基因 GAPDH
mRNA的量来确定), 10×buffer 5 μL, 25 mmol L−1
MgCl2 3 μL, 10 mmol L−1 dNTP mix 1 μL, nia-F和
nia-R(或 GAPDH-F和 GAPDH-R)各 1 μL, Bio-Ready
LA-Taq酶(BioFlux) 0.5 μL, 再加 RNase Free ddH2O
补足 50 μL。将 PCR 管在 PTC100 PCR 仪(MJ Re-
search)上 94℃先保温 3 min, 按 94 30 s, 60 30 s, ℃ ℃
72 1 min℃ 为一个循环, 循环 30次, 72℃延伸 10 min,
最后 4℃保存。取 PCR产物 2 μL, DNA marker 2 μL,
用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 用 EB 染色, 在影像
分析系统 SYNGENE (Gene Company, USA)上照相,
用 SYNGENE TOOL软件对电泳条带进行平均光密
度分析, 取 nia的 PCR产物与相应的GAPDH的 PCR
产物的光密度比值, 半定量表示 mRNA 相对表达
量。
1.3.3 酶活力测定 采用磺胺比色法[26]测定 nia
编码硝酸还原酶活力。
1.4 硝态氮同一处理不同处理时间 nia基因的表
达
只设一个处理, NO3−的浓度为 30 mmol L–1, 处
理后每小时取一次样 , 测定酶活力 , 同步测定
mRNA积累量。
1.5 铵态氮不同处理 nia基因的表达
营养液中氮素选用(NH4)2SO4, 根据每升营养液
中(NH4)2SO4 的含量不同, 分为处理 T1 (1.5 mmol
L–1); 处理 T2 (3.2 mmol L–1); 处理 T3 (8.0 mmol
L–1); 处理 T4 (12.8 mmol L–1)。
2 结果与分析
2.1 甜菜 nia基因及编码产物的特性分析
采用 RACE技术对前期研究获得的 1 438 bp的
中间片段进行基因全长序列克隆, 3′RACE克隆获得
了 1 109 bp的序列(图 1); 5′RACE克隆获得了 803 bp
的序列(图 2), 利用通用引物鉴定回收产物, 显示克
隆结果较好。使用 contig Express软件将 5′RACE序
列、中间序列和 3′RACE 序列拼接, 获得全长序列
3 247 bp, 含有一个 2 718 bp的开放阅读框 (ORF);
包括 147 bp的 5′非翻译区(UTR)和 382 bp的 3′非翻
译区。该序列编码 905个氨基酸残基, 分子量为 102
kD (ExPaSy分析的分子量), 等电点为 6.12。将全序
列登录 NCBI 的 GenBank, 登录号为 EU163265, 编
码多肽序列号为 ABW05098。

图 1 cDNA3端的 inner PCR电泳图
Fig. 1 The electrophoresis result of cDNA 3 end by inner PCR
M: DL2000 marker; 1~5: cDNA 3端巢式 PCR。
M: DL2000 marker; 1–5: inner PCR of cDNA 3 end.

图 2 cDNA 5端的 inner PCR电泳图
Fig. 2 The electrophoresis result of cDNA 5 end by inner PCR
M: DL2000 marker; 1~6: cDNA 5端巢式 PCR。
M: DL2000 marker; 1–6: inner PCR of cDNA 5 end.

nia编码多肽含有: 钼辅因子功能区(eukary NR
Moco: 93~478)、Fe-血红素结合区(Cyt-b5: 535~608)
和 FAD结合区(FAD binding 6: 653~760) 3个氧化还
原功能区。在甜菜 nia 基因编码氨基酸序列下游含
有 NADH-NR 特有的 CGPPP-M 基序(877~882), 说
明该 NR以 NADH为电子供体, 属于专一型 NADH-
NR。经 ANTHEPROT软件分析, 甜菜 nia基因编码
1952 作 物 学 报 第 37卷

产物的 C端含有跨膜区(778~891)。
以 Hind III、BamH I、EcoR I和 Dra I酶酶解甜
研 7基因组, 经电泳与转膜、预杂交和杂交, Southern
杂交检测结果表明, 在甜研 7 基因组中, nia 基因为
低拷贝, 即 1~3个拷贝(图 3)。

图 3 Southern杂交印记检测
Fig. 3 Genomic Southern blotting
M: 1 kb ladder marker; 1: Dra I; 2: BamH I; 3: Hind III; 4: EcoR I.

2.2 硝态氮不同处理的基因表达及酶活力测定
从图 4可以看出, nia的表达受 NO3−的诱导, 且
呈正相关关系, 随处理浓度的增加, 甜菜 nia基因的
表达加强。但随浓度的进一步加大, 基因表达强度
的增幅逐步减弱。由表 2 可见, 随处理浓度的提高,
内外源基质条件下酶活力都呈逐渐增高趋势, 与基
因表达情况一致。

图 4 硝态氮不同处理对 nia表达的影响
Fig. 4 Effects of nitrate nitrogen on nia expression under
different treatments

2.3 硝态氮不同处理时间的基因表达及酶活力
测定
以 30 mmol L–1硝酸钾处理甜菜幼苗, 处理后每
小时取一次样, 检测基因的表达。从图 5 可以看出,
处理 1 h较处理 2 h高, 说明硝酸盐的诱导之初会使
处于 N 饥饿状态下的甜菜幼苗 nia 的表达出现一个
波峰, 2 h又有所减弱, 这与马凤鸣等[27]的关于甜菜
幼苗对 NO3−有 2 h的最初适应阶段的研究结果相吻
合。经硝态氮诱导 4 h, nia的表达量达到最大, 然后
减弱, 约 6 h左右, 表达明显下降。通过方差分析得
出, 2、4、5和 6 h与对照有极显著差异(P<0.01), 1、
3和 7 h与对照差异不显著(P>0.05)。实验结果与 NR
活力的变化规律基本相同。

表 2 硝态氮不同处理条件下的 NR活力变化
Table 2 Changes of NR activity under different treatments of nitrate nitrogen
NRA (µg NO2– g–1 FW h–1) a 处理
Treatment
处理浓度
KNO3 (mmol L–1) 内源基质 Endo 外源基质 Exo
CK 0 0 2.20
1 10 1.11 5.79
2 20 1.33 6.42
3 30 1.76 8.32
4 40 2.10 8.38
5 50 2.70 8.99
a单位时间内每克鲜重叶片生成亚硝态氮量(µg NO2– g–1 FW h–1)。
a The amount of nitrite generated by per gram of fresh weight leaves in unit time (µg NO2− g–1 FW h–1).

小白菜和番茄的硝酸还原酶在硝态氮诱导后 2
h, 酶活力达到最高[28], 经对甜菜 NR 的研究发现,
甜菜的硝酸还原酶经硝态氮诱导, 4 h酶活力达到最
高值(表 3)。
2.4 铵态氮不同处理的基因表达及酶活力测定
从图 6可以看出, 甜菜 nia基因的表达受铵态氮
的影响, 低浓度的铵态氮促进 nia 基因 mRNA 的积
累, 铵态氮浓度过高会抑制 mRNA 的积累。说明
第 11期 丁广洲等: 甜菜 nia基因的克隆及不同氮素形态诱导的差异表达 1953



图 5 不同处理时间 nia基因的表达
Fig. 5 nia gene expression at different treated time-points

表 3 不同处理时间的酶活力变化
Table 3 Changes of NR activity at different time-points of
treatment
NRA (µg NO2– g–1 FW h–1) 处理时间
Dealing time (h) 内源基质 Endo 外源基质 Exo
1 0.81 3.31
2 1.14 2.12
3 1.49 5.02
4 1.74 8.25
5 1.58 7.16
6 1.07 6.17
7 0.76 3.28

图 6 铵态氮不同处理对 nia表达的影响
Fig. 6 Effects of ammonium nitrogen on nia expression under
different treatments

NO3−还原速率不应超过 NO2−还原速率, 也就是说,
单位时间内 NO3−的同化量即产生的氨基酸不能超
过代谢要求。否则, 由于 NO2−的积累, 会造成对细
胞的毒害作用。这也证明了 Mesnard 等[29]的关于植
物氮代谢系统存在自我调控机制的结论。
表 4 表明, 内源基质条件下, 硝酸还原酶活力
并不是随氨态氮浓度增加而增加, 以处理 T3的酶活
力最强, 当铵态氮的浓度达到 12.8 mmol L–1时, 酶

表 4 铵态氮不同处理条件下的酶活力变化
Table 4 Changes of NR activity under different treatments of ammonium nitrogen
NRA (µg NO2– g–1 FW h–1) 处理
Treatment
铵态氮浓度
NH4+-N (mmol L–1) 内源基质 Endo 外源基质 Exo
1 1.5 0.432 3.523
2 3.2 0.502 4.162
3 8.0 0.726 5.297
4 12.8 0.306 6.056

的活性大幅度降低(低于处理 T1)。外源基质条件下,
硝酸还原酶活力则随铵态氮浓度的增加而增加。说
明高浓度的铵态氮对 NR 有抑制作用, 在测试过程
中, 由于外源添加了 NO3−, 使受抑制的酶活力被激
活[30]。外源基质条件下的 NR 活性反映叶片对氮素
的最大利用程度, 即叶片对氮素的还原潜力, 这实
际上也间接反映了甜菜叶片内 NR酶量的多寡。
3 讨论
目前, 生产上所采用的栽培糖甜菜大多是高度
杂合的多倍体品种, 基因组成相对复杂, 因此本研
究选用当前栽培面积比较大的标准偏高糖型二倍体
甜菜品种 Ty7 号, 利于分子生物学的操作和实验结
果的分析, 具有一定的代表性。
nia基因编码的 NR蛋白是植物氮同化的关键酶,
对氮代谢起至关重要的作用。根据电子供体的不同,
NR 被分为 NADH:NR(EC1.6.6.1)、NAD(P)H:NR
(EC1.6.6.2)和 NADPH:NR(EC1.6.6.3) 3种。NADPH:
NR 存在于真菌中, 而在藻类和高等植物中 NADH:
NR最为常见, 但有些种类也含 NAD(P)H:NR。区别
在于 NR C′端的 FAD结构域都具有(Cys-Gly)保守的
基序, 由它下游的氨基酸残基决定利用哪种供氢体,
如 NADH-NR为 CGPPP-M (拟南芥), 当 P被 A或 S
代替时 , 则 NADH 专一性就变成了两者兼可的
NAD(P)H-NR[20-21]。已报道自大麦中克隆了 NADH:
NR和 NAD(P)H:NR[21] 2种 nia基因。本研究在甜菜
nia 编码多肽 C′端 FAD 结构域下游发现 CGPPP-M
(877~882)基序, 说明此 NR属于专一 NADH型。
1954 作 物 学 报 第 37卷

甜菜叶片中, nia编码硝酸还原酶活性一方面能
充分反映出外界氮素水平, 另一方面也可以反映甜
菜氮素利用的效率。特别是在内源基质条件下, 高
氮量会表现出较高的酶活性, 所以硝酸还原酶活性
能迅速、准确地反映出甜菜氮素营养状况[27]。但关
于不同氮素形态及处理下甜菜 nia 基因的表达, 以
及与编码酶蛋白活性变化的关系, 却鲜见报道。本
实验采用半定量 PCR结合内外源基质条件下的酶活
力测定, 检验了 nia 基因在不同底物诱导条件下的
表达情况。目的是根据不同氮素形态和浓度以及诱
导时间对甜菜 NR 的活性和 nia 转录水平的影响,
来获取提高 nia-mRNA 转录丰度的途径, 研究表明,
nia-mRNA 的转录丰度与诱导底物的种类、浓度和
诱导时间均有关, nia基因表达与酶活力表现一致。
根据反复试验结果, nia mRNA在 4 h积累达到高峰,
因此硝态氮不同处理和铵态氮不同处理的基因表达
检测, 都以积累 4 h作为检测点。基因表达检测和酶
活力测定结果显示, nia mRNA积累高峰和酶蛋白活
力高峰时间差很小, 没有超过 1 h。这也说明甜菜作
物对氮素营养反应快, 具有较快的吸收利用速率。
与甜菜同属藜科的菠菜 nia 基因是单拷贝, 在
杂交实验前, 我们推断甜菜 nia 基因在基因组中以
单拷贝形式存在, 但从 Southern杂交印记结果判断,
不能断定甜菜 nia 基因为单拷贝, 只能推断为 1~3
个拷贝即低拷贝。关于甜菜中究竟有几个 nia 基因
的位点需要进一步研究验证。
4 结论
从甜菜中克隆得到 nia 基因全长序列, 该基因
编码 905 个氨基酸, 等电点为 6.12, 推测分子量为
102 kD, 基因组中以低拷贝数存在, 编码还原蛋白
以 NADH为电子供体。甜菜 nia基因的表达受铵态
氮的影响, 低浓度的铵能促进基因的表达, 过高浓
度的铵抑制基因的表达。nia的表达受硝态氮的诱导,
且呈正相关关系, 随处理浓度的增加, nia 的表达加
强 , 但基因表达强度的增幅逐步减弱。nia 经 30
mmol L–1硝态氮诱导处理 4 h, 基因表达达到最高值,
约在 6 h表达开始明显下降。
References
[1] Crawford N M, Arst H N Jr. The molecular genetics of nitrate
assimilation in fungi and plants. Annu Rev Genet, 1993, 27:
115−146
[2] Crawford N M, Campbell W H, Davis R W. Nitrate reductase
from squash: cDNA cloning and nitrate regulation. Proc Natl
Acad Sci USA, 1986, 83: 8073−8076
[3] Melzer J M, Kleinhofs A, Warner R L. Nitrate reductase regula-
tion: effects of nitrate and light on nitrate reductase mRNA ac-
cumulation. Mol Gen Genet, 1989, 217: 341−346
[4] Crawford N M. Nitrate: nutrient and signal for plant growth.
Plant Cell, 1995, 7: 859−868
[5] Tucker D E, Allen D J, Ort D R. Control of nitrate reductase by
circadian and diurnal rhythms in tomato. Planta, 2004, 219:
277−285
[6] Vaucheret H, Vincenta M, Kronenberger J, Caboche M, Rouzé P.
Molecular cloning and characterization of the two homeologous
genes coding for nitrate reductase in tobacco. Mol Gen Genet,
1989, 216: 10−15
[7] Hoff T, Stummann B M, Henningssen K W. Cloning and expres-
sion of gene encoding a root specific nitrate reductase in bean
(Phaseolus vulgaris). Physiol Plant, 1991, 82: 197−204
[8] Jensen P E, Hoff T, Moiler M G, Stummann B M, Henningsen K
W. Identification and characterization of a nitrate reduetase gene
from bean (Phaseolus vulgaris) contgxning four introns. Physiol
Plant, 1994, 92: 613−623
[9] Jensen P E, Hoff T, Stummann B M, Henningsen K W. Func-
tional analysis of two bean nitrate reductase promoters in trans-
genic tobacco. Physiol Plant, 1996, 96: 357−358
[10] Prosser I M, Lazarus C M. Nucleotide sequence of a spinach ni-
trate reductase cDNA. Plant Mol Biol, 1990, 15: 187−190
[11] Tamura N, Takahashi H, Takeba G, Satoi T, Nakagawa H. The ni-
trate reductase gene isolated from DNA of cultured spinach cells
Biochim Biophys Acta, 1997, 1338: 151−155
[12] Hyde G E, W H Campbell. High-level expression in Escherichia
coli of the catalytically active flavin domain of corn leaf NADH:
nitrate reductase and its comparison to human NADH: cyto-
chrome b5 reductase. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 168:
1285−1291
[13] Cherel I, Gonneau M, Meyer C, Pelsy F, Caboche M. Biochemi-
cal and immunological characterization of nitrate reduetese defi-
cient nia mutants of Nicotiana plumbaginifolia. Plant Physiol,
1990, 92: 659−665
[14] Yamamoto-Katou A, Katou S, Yoshioka H, Doke N, Kawakita K.
Nitrate reductase is responsible for elicitin-induced nitric oxide
第 11期 丁广洲等: 甜菜 nia基因的克隆及不同氮素形态诱导的差异表达 1955


production in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Physiol, 2006,
47: 726−735
[15] Cheng C L, Acedo G N, Dewdney J, Goodman H M. Differential
expression of the two Arabidopsis nitrate reductase genes. Plant
Physiol, 1991, 96: 275−279
[16] Wilkinson J Q, Crawford N M. Identification and characteriza-
tion of a chlorate-resistant mutant of Arabidopsis thaliana with
mutations in both nitrate reductase Mol Gen Genet, 1993, 239:
289−297
[17] Choi H, Kieinhofs A, An G. Nucleotide sequence of rice nitrate
reductase gene. Plant Mol Biol, 1989, 13: 731−733
[18] Wu S, Lu Q, Kriz A L, Harper J E. Identification of cDNA clones
corresponding to two inducible nitrate reductase genes in soy-
bean: analysis in wild-type and nr1 mutant. Plant Mol Biol, 1995,
29: 491−506
[19] Daniel-Vedele F, Dorbe M F, Caboche M, Rouze P. Cloning and
analysis of the tomato nitrate reductase-encoding gene: protein
domain structure and amino acid homologies in higher plants.
Plant Gene, 1989, 85: 371−380
[20] Miyazaki J, Juricek M, Angelis K, Schnorr K M, Kleinhofs A,
Warner R L. Characterrization and sequence of a novel nitrate
reductase from barley. Mol Gen Genet, 1991, 228: 329−334
[21] Schnorr K M, Juricek M, Huang C, Culley D, Kleinhofs A. Ana-
lisis of barley nitrate reductase cDNA and genomic clones. Mol
Gen Genet, 1991, 227: 411−416
[22] Fukuoka H, Ogawa T, Minami H, Yano H, Ohkawa Y. Develop-
mental stage-specific and nitrate independent regulation of nitrate
reductase gene expression in rapeseed. Plant Physiol, 1996, 111:
39−47

[23] Tsai C B, Kaiser W M, Kaldenhoff R. Molecular cloning and
characterization of nitrate reductase from Ricinus communis L.
heterologously expressed in Pichia pastoris. Planta, 2003, 217:
962−700
[24] Sun F F, Hou X L, Li Y, Yang X D. Molecular cloning and char-
acterization of nitrate reductase gene from non-heading Chinese
cabbage. Sci Hort, 2008, 119: 1−10
[25] Salamoubat M, Budang H D. Analysis of the petunia nitrate re-
ductase apoenzyme-encoding gene: a first step for sequence
modification analysis. Gene, 1993, 128: 147−154
[26] Chen W(陈薇), Zhang D-Y(张德颐). Extraction, mensuration
and purification of nitrate reductase in plant tissues. Plant
Physiol Commun (植物生理学通讯), 1980, 16(4): 45−49 (in
Chinese with English abstract)
[27] Ma F-M(马凤鸣), Gao J-G(高继国), Jiang F-C(姜福臣). Nitrate
uptake and its relation to nitrate reductase activity in sugar beet
(Beta vulgaris L.) seedlings at cotyledon stage. Acta Agron Sin
(作物学报), 1996, 22(6): 681−687 (in Chinese with English ab-
stract)
[28] Wang L-Q(王利群), Wang Y(王勇), Dong Y(董英), Wang
W-B(王文兵). Induced activity of nitrate reductase by nitrate
and cloning of nitrate reductase gene. Chin J Biotechnol (生
物工程学报), 2003, 19(5): 632−635 (in Chinese with English
abstract)
[29] Mesnard F, Ratcliffe R G. NMR analysis of plant nitrogen me-
tabolism. Photosynth Res, 2005, 83: 163−180
[30] Li J, Xue L X, Yan H X, Wang L, Liu L, Lu Y, Xie H. The nitrate
reductase gene-switch: a system for regulated expression in trans-
formed cells of Dunaliella salina. Gene, 2007, 403: 132−142