全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(10): 1942−1947 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA100104-3), 农业部引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目[2006-G1(A)]
资助。
*
通讯作者(Corresponding authors): 胡国华, E-mail: hugh757@vip.163.com; 陈庆山, E-mail: qshchen@126.com; Tel: 0451-55191945
第一作者联系方式: E-mail: songwankun001@126.com
Received(收稿日期): 2009-01-15; Accepted(接受日期): 2009-04-26.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01942
大豆脂肪酸合成关键酶基因的电子定位及结构分析
宋万坤 1,2 朱命喜 2 赵阳林 1 王 晶 2 李文福 2 刘春燕 1,2 陈庆山 2,*
胡国华 1,3,*
1 黑龙江省农垦科研育种中心, 黑龙江哈尔滨 150090; 2 东北农业大学农学院, 黑龙江哈尔滨 150030; 3 国家大豆工程技术研究中心,
黑龙江哈尔滨 150050
摘 要: 利用最新大豆遗传图与物理图的整合图谱, 对 12个大豆脂肪酸合成中乙酰辅酶 A羧化酶、脂肪酸合酶等关
键酶基因进行基因定位与结构分析。它们分别被定位在 A2、B2、C2、D1b、D2、G、I、L、M等 9个连锁群上, 并
通过序列比对获得了所在相应连锁群区间两侧标记。同时, 比较基因的 cDNA和 gDNA序列信息, 获得了这 12个基
因结构信息, 内含子数目从最少的 0到最多的 30个, 其中 FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3与 FatB是单外显子基因, 没有
内含子; 其余基因都有内含子, KASI有 6个, KASII有 12个, SACPD有 2个, FAD3有 7个。通过定位获得对应分子
标记可以为基因的分子辅助育种提供参考资料, 而基因结构信息能更好地用于基因的功能分析。
关键词: 大豆; 脂肪酸; 基因; 电子定位; 基因结构
In silico Mapping and Structure Analysis of Key Enzyme Genes in Fatty Acid
Synthesis of Soybean
SONG Wan-Kun1,2, ZHU Ming-Xi1,2, ZHAO Yang-Lin1, WANG Jing1, LI Wen-Fu1, LIU Chun-Yan1,2, CHEN
Qing-Shan2,*, and HU Guo-Hua1,3,*
1 The Crop Research and Breeding Center of Land-Reclamation, Harbin 150090, China; 2 Agriculture College, Northeast Agricultural University,
Harbin 150030, China; 3 The National Research Center of Soybean Engineering and Technology, Harbin 150050, China
Abstract: The 12 genes of key enzyme such as acyl-CoA carboxylase and fatty acid synthase in fatty acid synthesis were mapped
on the newest genetic map integrating from physical map and genetic map, and the gene structure was analyzed. They were
mapped on nine linkage groups, including A2, B2, C2, D1b, D2, G, I, L, M, and the flank markers of the gene on the linkage
groups were obtained. At the same time, we compared the sequence information of cDNA with gDNA to get the structure infor-
mation of the 12 genes, with the number of intron from 0 to 30. FAD2-1, FAD2-2, FAD2-3, and FatB were all single extron gene,
but there were six introns in KASI, twelve introns in KASII, two introns in SACPD, and seven introns in FAD3. Therefore, the
corresponding markers obtained from the mapping are available for molecular assisted selection, while the structure information
can be better used in gene function analysis.
Keywords: Soybean; Fatty acid; Gene; In silico mapping; Gene structure
大豆基因组复杂, 基因组长约 975 Mb, 据预测可能
有 6万个基因[1]。对大豆基因组研究主要包括结构基因组
计划和功能基因组计划。在大豆种子的发育过程中, 脂肪
酸合成途径(图 1)主要发生在质体的内质网和其他部位[2],
乙酰辅酶 A 是脂肪酸合成的前体[3], 在质体中经 ACCase
催化形成丙二酰单酰辅酶 A, 然后经脂肪酸合酶(FAS)催
化聚合, 每循环增加 2 个碳合成酰基碳链, 并在酰基载体
蛋白(acyl-carried proteins, ACP)或酰基转移酶(acyl-trans-
ferase)的作用下终止。终止聚合后不同长度 ACP, 在酰基
辅酶 A 合成酶(acyl-CoA synthetase)的作用下合成酰基辅
酶 A, 并从质体转运到内质网或胞质中。最后利用贮存在
胞质中的乙酰辅酶 A, 在内质网上通过 3种不同的酰基转
移酶, 分别在甘油上附连脂肪酸以合成三酰甘油脂, 多数
不饱和脂肪酸的合成是经饱和脂肪酸合成途径的扩展。油
酸 (18:1∆9)在 ∆12-脂肪酸脱氢酶的催化下形成亚油酸
(18:2∆9,12)也可以在∆15-脂肪酸脱氢酶催化下形成 α-亚麻
第 10期 宋万坤等: 大豆脂肪酸合成关键酶基因的电子定位及结构分析 1943


酸(18:3∆9,12,15)[4]。
本研究利用大豆基因组物理图谱和遗传图谱的整合
图谱完成了 12个大豆脂肪酸合成关键酶基因的定位, 并对
基因的结构进行了分析。这为基因的分子辅助选择奠定基
础, 并可更好实现基因功能的研究。



图 1 大豆种子质体中脂肪酸合成的代谢途径
(引自 Sommerville[4], 2000)
Fig. l Pathway of soybean plastid fatty acid synthesis (from Som-
merville[4], 2000)
图中加下画线的表示本研究定位基因。
Genes mapped in this paper were underlined.
1 材料与方法
1.1 实验材料
从 NCBI网站下载 12个大豆脂肪酸合成中关键的酶
基因信息(表 1)。从美国能源部网站(ftp://ftp.jgi-psf.org/pub/
JGI_data/Glycine_max)下载的大豆基因组草图序列, 该部
分数据为 7倍测序结果。并从 NCBI网站下载用于进行本
地比对的 Blast2.2.16软件包。
1.2 图谱的整合
将下载的大豆基因组序列进行本地建库, 用 Choi 等
[13]构建的大豆公共图谱及其标记序列信息与本地大豆基
因组序列库进行比对 , 将得到的结果按照匹配度择优筛
选, 共有 160 个拼接的 Super 定位到连锁群上, 占序列总
数的 72.77%。用 MapChart2.1画出连锁群, 并按照比对的
结果将 Super画在与之相应的标记位置, 得到了一套物理
图谱与遗传图谱的整合图谱[14]。
2 结果与分析
2.1 基因的物理图定位
通过基因与基因组的比对, 完成基因的物理图定位
(表 2)。表中列出了具有内含子的基因与基因组比对出现
的多片段联配、匹配区段的 E 值范围、匹配率平均值。
FatB、FAD2-3、FAD2-2、FAD2-1基因没有内含子, 因此
E值没有范围是具体的数值。可以看出, 基因与基因组匹
配的 E 值均接近于 0, 平均匹配率均超过了 93%, 说明基
因与基因组的匹配是可信的。
2.2 基因的遗传定位
表 3表明 12个关键酶基因被定位在 C2、A2、D1b、
D2、G、M、L、I、B2, 9个连锁群上, 如 FAD3B基因被定
位在D1b连锁群的 Super14上的 3 717 225~3 721 120之间,
且 Satt546~Sat_139 是分别位于此区间的两侧最近的标记,
距离是 5.5 cM。其中的 D1b、L、D2、I与前人关于大豆
脂肪酸组分 QTL 定位的连锁群是一致的[15]。除 FAD3A
与 FAD3C 基因定位的区域由于标记太少没有被具体的标
注在连锁群上外 , 其他基因都被标注在相应的连锁群上
(图 2), 另外 FAD2-2与 FAD2-3被定位在同一个位置。
2.3 基因结构分析
根据比对结果确定了这 12个大豆脂肪酸合成相关基

表 1 大豆脂肪酸合成关键酶基因信息
Table 1 Information of the key genes in fatty acid synthesis of soybean
名称
Name
登录号
Accession No.
功能
Function
参考文献
Reference
ACC L42814 ATP dependent carboxylation of acetyl-CoA to malonyl-CoA Anderson et al. [5]
KASI AF243182 Fatty acid synthesis in plants by catalyzing the condensing reaction from malonyl-ACP to palmitoyl-ACP Kinney A J, unpublished (2000)
KASII AF244518 Elongation of palmitoyl-ACP to stearoyl-ACP in the plastid Karthik et al. [6]
KASIII AF260565 Initiation of the fatty acid synthesis in plants by catalyzing the condensing reaction of acetyl-CoA and malonyl-ACP Katayoon et al.
[7]
FatB DQ861998 Release free fatty acids and ACP Andrea et al. [8]
SACPD L34346 Principle enzyme in the conversion of saturated fatty acids to unsaturated fatty acids Chen et al. [9]
FAD2-3 DQ532371 Introduction of the first double bond into stearoyl-ACP (18:0-ACP) Li et al. unpublished
FAD2-2 L43921 Introduction of the first double bond into stearoyl-ACP (18:0-ACP) Heppard et al. [10]
FAD2-1 AY954300 Introduction of the first double bond into stearoyl-ACP (18:0-ACP) Grace et al .[11]
FAD3A AY204710 Omega3 and omega6 fatty acid desaturases, catalyzing a third double bond into linoleic Bilyeu et al. [12]
FAD3B AY204711 Omega3 and omega6 fatty acid desaturases, catalyzing a third double bond into linoleic Bilyeu et al. [12]
FAD3C AY204712 Omega3 and omega6 fatty acid desaturases, catalyzing a third double bond into linoleic Bilyeu et al. [12]

1944 作 物 学 报 第 35卷

表 2 大豆脂肪酸合成关键酶基因的物理图定位
Table 2 Physical mapping result of the key genes in fatty acid synthesis of soybean
基因名称
Gene name
基因长度
Length (bp)
基因匹配区段
Gene matched sequence
基因组匹配区段
Genome matched sequence
E值范围
E-value
平均匹配率
Identity (%)
Super名称
Super name
ACC 6786 1–6786 1422035–1435656 0–2×10−16 99.35 25
KASI 1410 1–1410 6307562–6312159 0–1×10−28 100.00 21
KASII 1467 1–1467 3529857–3535693 1×10−104–2×10−17 98.69 24
KASIII 1194 1–1194 1648591–1652140 0.063–1×10−12 86.28 20
FatB 1173 1–1173 211555–212727 0 99.00 170
SACPD 1236 1–1236 2237593–2241047 0–4×10−40 93.66 101
FAD2-3 1140 1–1140 924308–925621 0 96.00 76
FAD2-2 1152 1–1152 924135–928815 0 98.00 76
FAD2-1 1314 1–1314 1148788–1149917 0 94.00 0
FAD3A 1131 1–1131 6998640–7002507 1×10−161–2×10−29 99.85 35
FAD3B 1143 1–1143 3717225–3721120 1×10−168–2×10−29 99.87 14
FAD3C 1143 1–1143 239615–242148 1×10−169–1×10−32 99.75 248

表 3 大豆脂肪酸合成关键酶遗传图基因定位
Table 3 Genetic mapping result of the key genes in fatty acid synthesis of soybean
名称
Name
基因组编号
Code of genome
位置
Location
标记
Marker
定位区间
Mapping interval (cM)
连锁群
LG
ACC 25 1422035–1435656 Sat_336–Sat_457 49.0–55.1 C2
KASI 21 6307562–6312159 Sat_409–Sat_315 35.1–41.6 A2
KASII 24 3529857–3535693 Sct_192–Satt328 13.8–19.7 D2
KASIII 20 1648591–1652140 Satt503–Sat_143 68.0–71.1 G
FatB 170 211555–212727 Satt154–Satt582 52.0–53.0 D2
Fab2 101 2237593–2241047 Sat_121–Sat_250 99.6–100.7 M
FAD2-3 76 924308–925621 Sat_340–Sat_010 51.1–55.4 L
FAD2-2 76 924135–928815 Sat_340–Sat_010 51.1–55.4 L
FAD2-1 0 1148788–1149917 Satt270–Satt354 48.2–44.9 I
FAD3A 35 6998640–7002507 — — B2
FAD3B 14 3717225–3721120 Satt546–Sat_139 92.3–97.8 D1b
FAD3C 248 239615–242148 — — G
—: No suitable markers found in the linkage group.


因的长度在 1 140~13 622 bp之间, 外显子数目在 1~31个
之间, 内含子的数目在 0~30个之间(表 3)。其中 FAD2与
FatB是单外显子基因, 它们的 cDNA基因长度都在 1 100
bp左右。其他基因都有内含子, 其中 KASI有 6个, KASII
有 12个, SACPD有 2个, FAD3有 7个。ACC基因最长, 为
13 622 bp, 外显子和内含子的数目也最多, 共 31 个外显
子和 30个内含子, ACC的基因结构与 GenBank网站上提
交的信息完全一致。
3 讨论
本研究利用 Song 等[16]2004 年已构建的 5 张大豆遗
传图谱整合了一张新的公共图谱 SoyMap2, 共有 20 个连
锁群, 1 849个标记, 包括 709个 RFLP标记、1 015个 SSR
标记、73 个 RAPD 标记、6 个 AFLP 标记、46 个其他类
型的标记。该图谱标记丰富, 与其他图谱的共线性较高。
2007年, Choi等[13]在此基础上又开发了 5 551个 SNP标
记, 进一步丰富了图谱。由于这些标记的特异性高, 是整
合图谱构建的重要桥梁 , 也为遗传图与物理图的穿梭定
位奠定了基础。
基因定位包括间接的分子标记定位与直接的电子定
位。利用大豆遗传群体遗传作图定位的性状有很多, 并获
得了紧密连锁的分子标记, 如低亚油酸含量、抗大豆花叶
病毒病、种子蛋白、产量及抗胞囊线虫[17-19]等性状。但是
即使这些标记与控制性状的基因位点的遗传距离再近 ,
在物理距离上也会相当长, 因此这些标记都是间接的分
子标记。从基因自身序列出发而获得染色体或连锁群的定
位可以将遗传距离和物理距离均降至零, 实现基因的准
确精细定位。目前在大豆上这方面的研究较少, 究其根源
第 10期 宋万坤等: 大豆脂肪酸合成关键酶基因的电子定位及结构分析 1945





图 2 大豆脂肪酸合成关键酶基因定位示意图
Fig. 2 Location sketch-map of mapped genes in fatty acid synthesis of soybean
图中阴影部分为基因被定位的区间。
The black parts in the map represent the mapping interval.
1946 作 物 学 报 第 35卷

表 4 大豆脂肪酸合成关键酶基因结构比对信息
Table 4 Blast information of the gene structure in fatty acid synthesis of soybean
名称
Name
登录号
Accession No.
cDNA基因长度
cDNA length (bp)
gDNA基因长度
gDNA length (bp)
外显子数
No. of extron
内含子数
No. of intron
ACC L42814 6786 13622 31 30
KASI AF243182 1410 4598 7 6
KASII AF244518 1467 5837 13 12
KASIII AF260565 1194 3550 7 6
FatB DQ861998 1173 1173 1 0
SACPD L34346 1236 3455 3 2
FAD2-3 AY954300 1140 1140 1 0
FAD2-2 L43921 1152 1152 1 0
FAD2-1 DQ532371 1314 1314 1 0
FAD3A AY204710 1131 3868 8 7
FAD3B AY204711 1143 3896 8 7
FAD3C AY204712 1143 2534 8 7

在于没有序列与遗传图的对应关系。
利用分子标记完成定位需要相应定位群体, 各种仪
器设备及大量的人力物力 , 而基因电子定位是建立在大
规模测序的基础之上和利用生物信息学软件结合序列信
息的一种方法, 具有投入少、见效快、高通量等特点, 可
以收到事半功倍的效果。传统方式获得的标记区间较大,
分子辅助育种效果不理想 , 而电子定位获得的标记与基
因位点的物理距离很近 , 甚至可以开发基于基因的分子
标记, 选择效果好, 因此电子定位获得的分子标记为分子
标记辅助育种奠定了重要基础。
电子定位能够同时获得 cDNA和 gDNA的基因信息,
因此很容易获得精细的基因结构信息, 也就是基因是否
存在内含子, 有几个内含子, 这为深入研究基因奠定了基
础。传统定位仅仅能获得基因的定位区间, 基因克隆往往
集中在 cDNA基因的分离上。关于大豆脂肪酸合成关键酶
基因的研究较多 , 并得到了大部分基因序列 , 但在
GenBank数据库中它们多为 cDNA序列, 没有完整的基因
结构信息, 而本研究提供了这方面的补充。
References
[1] Lackey J A. Chromosome numbers in the Phaseoleae and their
relation to taxonomy. Am J Bot, 1980, 67: 595–602
[2] Ohlrogge J, Browse J. Lipid biosynthesis. Plant Cell, 1995, 7:
957–970
[3] Nikolau B J, Ohlrogge J B, Wurtele E S. Plant biotin-containing
carboxylases. Arch Biochem Biophys, 2003, 414: 211–222
[4] Somerville C, Browse J, Jaworski J G, Ohlrogge J. Biochemistry
and Molecular Biology of Plants. Amer Soc of Plant Physiolo-
gists, Rockville, MD. 2000, pp 456–527
[5] Anderson J V, Lutz S M, Gengenbach B G, Gronwald J W. Ge-
nomic sequence for a nuclear gene encoding acetyl-coenzyme A
carboxylase (accession No. L42814) in soybean (95-055). Plant
Physiol, 1995, 109: 338
[6] Aghoram K, Wilson R F, Burton J W, Dewey R E. A mutation in
a 3-keto-acyl-ACP synthase II gene is associated with elevated
palmitic acid levels in soybean seeds. Crop Sci, 2006, 46: 2453–
2459
[7] Dehesh K, Tai H, Edwards P, Byrne J, Jaworski J G. Overexpres-
sion of 3-ketoacyl-acyl-carrier protein synthase IIIs in plants re-
duces the rate of lipid synthesis. Plant Physiol, 2001, 125:
1103–1114
[8] Cardinal A J, Burton J W, Camacho-Roger A M, Yang J H, Wil-
son R F, Dewey R E. Molecular analysis of soybean lines with
low palmitic acid content in the seed oil. Crop Sci, 2007, 47:
304–310
[9] Chen L, Moon Y, Shanklin J, Nikolau B, Atherly A G. Cloning
and sequence of a cDNA encoding stearoyl-acyl carrier protein
desaturase from Glycine max. Plant Physiol, 1994, 109: 1498
[10] Heppard E P, Kinney A J, Stecca K L, Miao G H. Developmental
and growth temperature regulation of two different microsomal
omega-6 desaturase genes in soybeans. Plant Physiol, 1996, 110:
311–319
[11] Byfield G E, Upchurch R G. Effect of temperature on delta-9
stearoyl-ACP and microsomal omega-6 desaturase gene expres-
sion and fatty acid content in developing soybean seeds. Crop Sci,
2007, 47: 1698–1704
[12] Bilyeu K D, Palavalli L, Sleper D A, Beuselinck P R. Three mi-
crosomal omega-3-fatty acid desaturase genes contribute to soy-
bean linolenic acid levels. Crop Sci, 2003, 43: 1833–1838
[13] Choi I Y, Hyten D L, Matukumalli L K, Song Q J, Chaky J M,
Quigley C V, Chase K K, Lark G, Reiter R S, Yoon M S, Hwang
E Y, Yi S I, Young N D, Shoemaker R C, van Tassell C P, Specht
J E, Cregan P B. A soybean transcript map: Gene distribution,
haplotype and single-nucleotide polymorphism analysis. Genet
Soc Am, 2007, 176: 685–696
[14] Qi Z M, Li H, Wu Q, Sun Y N, Liu C Y, Hu G H, Chen Q S. An
integrated map of soybean physical map and genetic map. J
Northeast Agric Univ, 2009, 16(2): 12–16
第 10期 宋万坤等: 大豆脂肪酸合成关键酶基因的电子定位及结构分析 1947


[15] Zheng Y-Z(郑永战), Gai J-Y(盖钧镒), Lu W-G(卢为国), Li
W-D(李卫东), Zhou R-B(周瑞宝), Tian S-J(田少君). QTL map-
ping for fat and fatty acid composition contents in soybean. Acta
Agron Sin (作物学报), 2006, 32(12): 1823–1830 (in Chinese
with English abstract)
[16] Song Q J, Marek L F, Shoemaker R C, Lark K G, Concibido V C,
Delannay X, Specht J E, Cregan P B. A new integrated genetic
linkage map of the soybean. Theor Appl Genet, 2004, 109:
122–128
[17] Yu Y G, Saghai-Maroof M A, Buss G R, Maughan P J, Tolin S A.
RFLP and microsatellite mapping of a gene for soybean mosaic
virus resistance. Phytopathology, 1994, 84: 60–64
[18] Mansur L M, Lark K G, Kross H, Oliveira A. Interval mapping of
quantitative trait loci for reproductive, morphological and seed
traits of soybean (Glycine max L.). Theor Appl Genet, 1993, 86:
907–913
[19] Conclbido V C, Denny R L, Boutin S R, Hautea R, Orf J H,
Young N D. DNA marker analysis of loci underlying resistance to
soybean cyst nematode (Heterodera glycine Ichinohe). Crop Sci,
1994, 34: 240–246



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