全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(3): 428434 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家科技支撑计划项目(2006BAD13B05-2)，国家自然科学基金项目(30571132)，国家科技基础条件平台项目(2005DKA21002-13)和农作物种
质资源保护项目(NB07-2130135-35)资助。
第一作者联系方式: E-mail: peanutlab@oilcrops.cn
Received(收稿日期): 2009-07-09; Accepted(接受日期): 2009-10-02.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00428
利用核心种质发掘及评价花生抗黄曲霉资源
姜慧芳 1 任小平 1 王圣玉 1 张晓杰 1 黄家权 1 廖伯寿 1
Corley C HOLBROOKA2 Hari D UPADHYAYA3
1中国农业科学院油料作物研究所 / 农业部油料作物生物学重点开放实验室, 湖北武汉 430062; 2 USDA-ARS, P O Box 748, Tifton, Georgia
31793, USA; 3 International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics, Patancheru, AP 502 324, India
摘 要: 黄曲霉菌极大地限制全世界的花生生产和产业发展, 且生产上抗性品种较少, 我国花生育种和生产中的抗
性资源缺乏, 迫切需要发掘抗黄曲霉种质。本研究以中国花生核心种质 561份和 ICRISAT微核心种质 155份为材料,
鉴定了黄曲霉侵染和产毒抗性, 发掘出抗黄曲霉侵染和产毒种质各 8份, 包括具优良农艺性状的抗黄曲霉产毒种质
51002-6。鉴定结果表明, ICRISAT 花生微核心种质中抗黄曲霉侵染和产毒种质的频率高于中国花生核心种质; 普通
型花生资源中抗黄曲霉侵染种质的频率较高, 龙生型资源中抗黄曲霉产毒种质的频率较高。根据 SSR 分析, 鉴定出
与生产上推广应用的优良品种中花 5号、中花 6号、中花 12和远杂 9102遗传距离较远的抗黄曲霉产毒种质 ICG12625
和抗侵染种质 ICG4750, 拓宽了我国花生品种改良的遗传基础。根据抗病基因产物的 NBS类型保守域设计简并引物
对抗黄曲霉种质的 DNA进行 PCR扩增、克隆、测序和分析, 获得了 1条 RGA片段。
关键词: 花生核心种质; 抗黄曲霉资源; 农艺性状; SSR遗传多样性; RGA
Development and Evaluation of Peanut Germplasm with Resistance to Aspergil-
lus flavus from Core Collection
JIANG Hui-Fang1, REN Xiao-Ping1, WANG Sheng-Yu1, ZHANG Xiao-Jie1, HUANG Jia-Quan1, LIAO
Bo-Shou1, Corley C HOLBROOKA2, and Hari D UPADHYAYA 3
1 Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Oil Crop Biology of the Ministry of Agriculture, Wu-
han 430062, China; 2 USDA-ARS, PO Box 748, Tifton, Georgia 31793, USA; 3 International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics,
Patancheru, AP 502 324, India
Abstract: Peanut (Arachis hypogaea L.), one of the main oil and cash crops in the world, is easily susceptible to Aspergillus fla-
vus, resulting huge loss in its quality, so Aspergillus flavus infection greatly limits peanut production and industry in China.
Therefore, it is imperative to develop new peanut germplasm with resistance to Aspergillus flavus in breeding program. The core
collection is well accepted as a useful way to improve the efficiency of crop germplasm evaluation and utilization, which contains
a subset of accessions from the entire collection that covers the most of available genetic information. In the present study, a total
of 561 accessions of Chinese peanut core collection and 155 accessions of ICRISAT mini core collection were identified. Eight
varieties with resistance to Aspergillus flavus invasion and aflatoxin production each were developed, including one (51002-6)
with elite agronomic traits. The peanut germplasm with resistance to Aspergillus flavus invasion and aflatoxin production in
ICRISAT mini core were more than those in Chinese peanut core collection. In addition, the percentages of accessions with resis-
tance to Aspergillus flavus invasion in var. hypogaea, and accessions resistant to aflatoxin production in var. hirsuta were rela-
tively high in comparison with others. Genetic diversity in the resistant peanut selections was evaluated based on morphological
traits and SSR approach. ICG12625 with resistance to aflatoxin production and ICG4750 with resistance to aflatoxin invasion
were evaluated by SSR, the genetic distance of them with high-yielding cultivars such as Zhonghua 5, Zhonghua 6, Zhonghua 12,
and Yuanza 9102 was larger. The primers were designed based on the conserved NBS-LRR domains of the disease resistance
genes sequence, one RGA (resistance gene analog) from genomic DNA of six different peanuts with resistance to Aspergillus
flavus was obtained through PCR.
Keywords: Peanut core collection; Varieties with resistance to Aspergillus flavus; Agronomic traits; SSR genetic diversity; RGA
第 3期 姜慧芳等: 利用核心种质发掘及评价花生抗黄曲霉资源 429
花生黄曲霉毒素是黄曲霉菌(Aspergillus flavus)
及寄生曲霉菌(Aspergillus parasiticus)的产毒菌株侵
染花生后产生的毒性物质, 对人和动物危害极大。
花生是最容易受黄曲霉菌侵染的农作物之一, 我国
花生生产规模较大, 干燥和贮藏条件难于保证, 是
世界上花生黄曲霉毒素污染较为严重的国家[1-2]。培
育和应用抗病品种是防治花生病害最为经济有效的
途径。近 30年来, 国际上广泛开展了花生黄曲霉抗
性的研究, 发现花生对黄曲霉毒素污染的抗性存在
两种类型, 一种是对黄曲霉菌侵染的抗性(抗侵染),
即以种皮的特殊生化成分抵御黄曲霉菌的侵染和定
殖 ; 另一种是对黄曲霉菌产毒的抗性(抗产毒), 即
在黄曲霉菌侵染后抑制其毒素产生[3-6]。目前世界范
围内发掘出的抗黄曲霉毒素污染的种质较少 [3-12],
应用于生产的抗病品种更少, 严重影响了抗病育种
的进展。
从收集的基础花生资源中筛选所需要的抗黄曲
霉材料, 费时费力。核心种质是用科学的方法建立
的并且能以最小的资源数量最大程度地代表整个遗
传资源的多样性群体, 从而为种质资源的评价和鉴
定带来方便。国内外研究表明, 通过核心种质发掘优
异基因资源是有效的。Holbrook等[13-14]通过对美国花
生核心种质的叶斑病和根结线虫抗性鉴定, 获得了
一批抗病资源并明确了抗根结线虫资源的地理分布,
将鉴定效率提高了一倍。Anderson等[15]和 Iseib等[16]
通过美国花生核心种质的番茄斑萎病抗性鉴定, 发
掘出 55份抗病资源, 并认为花生核心种质为快速有
效进行抗病资源发掘提供了一个合理的种质范围。
但目前国内外很少有关于通过花生核心种质发掘出
抗黄曲霉资源的研究报道。
我国构建了以 576 份资源组成的中国花生核心
种质, 并从 ICRISAT引进了全套微核心种质 184份[17],
本研究以这两套核心种质为材料, 对其进行黄曲霉
接种鉴定, 旨在发掘抗病资源, 为花生抗黄曲霉育
种取得突破及资源有效利用提供基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
中国花生核心种质 561份和 ICRISAT微核心种
质 155 份(由于种子数量的限制未用全部的核心种
质), 以“J11”为抗病对照, “中花 5号”为感病对照。
1.2 黄曲霉抗性鉴定及调查方法
连续 3 年(2006—2008 年)选取成熟饱满、种皮
完整的种子(未经其他任何杀菌剂、种衣剂等处理),
参考姜慧芳等[8-9]描述的方法接种黄曲霉菌。接种物
为本实验室筛选出的强产毒菌株 AF2202, 浓度为每
毫升 4×106孢子, 每品种接种 40粒, 重复 3次。置
25℃生长箱中培养 7 d。用甲醇提取黄曲霉毒素, 用
荧光分光光度计检测毒素含量。按《花生种质资源
描述规范和数据标准》的方法和标准调查侵染和产
毒抗性[18]。
1.3 抗病种质植物学性状的调查
2007—2008年连续两年将鉴定出的抗黄曲霉材
料种植于中国农业科学院油料作物所试验农场, 按
《花生种质资源描述规范和数据标准》[18]对主要农
艺性状进行调查。
1.4 抗病种质的 SSR分析
选取花生健壮幼叶, 采用 CTAB 法提取基因组
DNA[19]。用国际半干旱研究所(ICRISAT)生物技术实
验室提供的 SSR引物序列由上海生工公司或北京奥
科公司合成引物, 按本实验室建立的优化体系进行
PCR扩增。用 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增
产物, 银染显色, 电脑扫描。
1.5 抗病种质的 RGA分析
根据NB-LRR型抗病基因的NBS保守区的氨基
酸序列设计 4对简并引物(表 1)扩增基因组DNA, 扩
增产物经 1.0%琼脂糖凝胶(含核酸染色剂)电泳, 用
OMEGA公司 GEL EXTRACTION KIT柱式 DNA凝
胶回收试剂盒回收差异 DNA片段与 pGM-T载体的
连接 , 将连接产物转化到大肠杆菌 , 并进行菌落
PCR检测、测序及分析。
2 结果与分析
2.1 核心种质对黄曲霉菌侵染的反应及抗侵染
种质的发掘
通过对 716 份花生材料包括中国花生核心种质
561 份和 ICRISAT 微核心种质 155 份的鉴定, 获得
资源的感染指数 0.19~1.00。其中, 感染指数小于
0.30 的资源材料 8 份, 占 1.12%; 感染指数在 0.31~
0.40之间的 33份, 占 4.61%; 感染指数在 0.41~0.55
之间的 66 份, 占 9.22%, 其余资源的感染指数均在
0.55 以上, 占 85.06%。可见, 花生资源中抗黄曲霉
侵染种质的频率很低。
中国花生核心种质与 ICRISAT微核心种质比较
(表 2), 中国资源的感染指数在 0.30以下的资源 4份,
占其 0.71%。ICRISAT 花生核心种质的感染指数在
430 作 物 学 报 第 36卷
表 1 花生抗病基因同源序列扩增引物
Table 1 Primer sequences used for the amplification of peanut resistance gene analogs (RGA)
引物编号
Primer ID
模体
Motif
模体序列
Motif sequence
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
PLTR-fwd P-loop GMGGVGKTT GGNATGGGNGTNGGNAARACNACN
PLTR-rev GLPL GLPLALKVLG NCANCARAANGGNTGNGGNGGGTANGG
PNTR-fwd P-loop GGVGKTT GGNGGNGTNGGNAANACNAC
PNTR-rev RNBS-D CFLYCALFP CGRAANARNSHRCARTANVNRAARC
PCRE-fwd Kinase-2 LILDDVW TGATACTGGATGATGTCTGG
PCRE-rev EGF EGFIRNT GTGCTTCTTATGAACCCTTC
PRGA-fwd P-loop GVGKTT GGNGGNGTNGGNAANACNAC
PRGA-rev GLPL GLPLAL ARNGCTARNGGNARNCC
表 2 不同花生种质对黄曲霉菌侵染反应
Table 2 Response to infection by Aspergillus flavus in different peanut varieties
具不同感染指数的品种(抗性品种)数量
No. of varieties (resistant varieties %) with different infection indexes 种质类别
Type of germplasm
≤0.30 0.31–0.40 0.41–0.55 0.56–0.70 0.71–0.85 >0.85 总数 Total
中国花生核心种质
Chinese core collection
4(0.71%) 16(2.85%) 35(6.24%) 97(17.29%) 210(37.43%) 199(35.47%) 561
ICRISAT花生微核心种质
ICRISAT mini core collection
4(2.58%) 17(10.97%) 31(20%) 53(34.19%) 33(21.29%) 17(10.97%) 155
多粒型 var. fastigiata 0 6(7.32%) 8(9.76%) 22(26.83%) 22(26.83%) 24(29.27%) 82
赤道型 var. aequatoriana 0 0 0 1(100) 0 0 1
秘鲁型 var. peruviana 0 0 0 1(50) 1(50) 0 2
珍珠豆型 var. vulgaris 1(0.34%) 17(5.76%) 22(7.46%) 43(14.58%) 108(36.61%) 104(35.25%) 295
龙生型 var. hirsuta 0 1(2.86%) 3(8.57%) 9(25.71%) 15(42.86%) 7(20.00%) 35
普通型 var. hypogaea 7(2.63%) 14(5.26%) 32(12.03%) 70(26.32%) 79(29.70%) 64(24.06%) 266
中间型 Intermediate type 0 0 1(2.86%) 2(5.71%) 17(48.57%) 15(42.86%) 35
括号内的值为抗性品种的百分数。
The values in brackets mean percentage of resistant varieties.
0.30 以下的材料也是 4 份 , 占其 2.58%。可见 ,
ICRISAT 花生微核心品中抗黄曲霉侵染种质的频率
高于中国花生核心种质的对应值。
不同植物学类型材料对黄曲霉菌侵染的反应
(表 2)表明, 多粒型、龙生型和中间型花生中均没有
感染指数在 0.30以下的种质。赤道型和秘鲁型资源
较少, 仅 3份, 均表现不抗黄曲霉菌侵染, 感染指数
均在 0.56以上。珍珠豆型花生中感染指数在 0.30以
下的材料 1份, 占该类型的 0.34%。普通型花生中感
染指数在 0.30以下的材料 7份, 占该类型的 2.63%。
由此可见, 普通型花生中, 抗黄曲霉侵染种质的频
率最高。
综上所述, 在中国花生核心种质和 ICRISAT 花
生微核心种质中发掘出抗黄曲霉侵染种质 8 份(表
4), 包括珍珠豆型 1份和普通型 7份。其中, 中国和
ICRISAT花生种质各 4份。
2.2 核心种质对黄曲霉菌产毒的反应及抗产毒
种质的发掘
与抗黄曲霉菌侵染鉴定相似, 对 716 份核心种
质的接种鉴定表明, 黄曲霉毒素含量小于 6 000 μg
kg–1的材料 8份, 占鉴定资源总数的 1.12%; 毒素含
量在 6 000.1~15 000.0 μg kg–1之间的 44份, 占 6.15%;
毒素含量在 15 000.1~30 000.0 μg kg–1之间的 105份,
占 14.66%, 其余材料的毒素含量均在 30 000.0 μg
kg–1以上, 占 78.07%。可见, 花生种质资源中, 抗黄
曲霉菌产毒种质的频率与抗侵染种质的频率相似。
表3表明, 中国花生核心种质中, 毒素含量小于
6 000 μg kg–1的材料 5 份, 占 0.89%, 毒素含量在
6 000.1~15 000.0 μg kg–1之间的 31份, 占 5.70%, 毒
素含量在 15 000.1~30 000.0 μg kg–1之间的 81份, 占
第 3期 姜慧芳等: 利用核心种质发掘及评价花生抗黄曲霉资源 431
14.44%。ICRISAT 花生微核心种质中, 毒素含量小
于 6 000 μg kg–1的材料 3份, 占 1.94%, 毒素含量在
6 000.1~15 000.0 μg kg–1之间的 13份, 占 8.39%, 毒
素含量在 15 000.1~30 000.0 μg kg–1之间的 24份, 占
15.48%。可见, ICRISAT花生微核心种质中抗黄曲霉
产毒资源的频率高于中国花生核心种质的对应值。
综合分析不同植物学类型材料对黄曲霉菌产毒
的反应(表 3)表明, 龙生型和普通型花生中毒素含量
小于 6 000 μg kg–1的材料各 2 份, 分别占各类型的
5.71%和 0.75%。珍珠豆型花生中毒素含量小于 6 000
μg kg–1的材料 3份, 占该类型的 1.02%。涉及赤道型
材料 1 份, 表现抗黄曲霉菌产毒, 接种条件下毒素
含量为 4 257 μg kg–1。多粒型和秘鲁型材料均表现不
抗黄曲霉菌产毒。
通过上述分析 , 在中国花生核心种质和
ICRISAT 花生微核心种质中发掘出抗黄曲霉产毒种
质 8 份(表 4), 包括赤道型 1 份, 珍珠豆型 3 份, 龙
生型 2份和普通型 2份。
表 3 中国花生核心种质和 ICRISAT花生微核心种质对黄曲霉菌产毒反应
Table 3 Response to aflatoxin production in Chinese core collection and ICRISAT mini core collection (μg kg1)
具不同毒素含量的品种(抗性品种)数量
No. of varieties (resistant varieties %) with different aflatoxin contents 种质类型
Type of germplasm
≤6000 6000.1–15000.0 15000.1–30000.0 30000.1–50000.0 >50000.0 总数 Total
中国花生核心种质
Chinese core collection
5(0.89%) 31(5.53%) 81(14.44%) 147(26.20%) 297(52.94%) 561
ICRISAT花生微核心种质
ICRISAT mini core collection
3(1.94%) 13(8.39%) 24(15.48%) 44(28.39%) 71(45.81%) 155
多粒型 var. fastigiata 0 5(6.10%) 10(12.20%) 18(21.95%) 49(59.76%) 82
赤道型 var. aequatoriana 1(100%) 0 0 0 0 1
秘鲁型 var. peruviana 0 0 1(50%) 1(50%) 0 2
珍珠豆型 var. vulgaris 3(1.02%) 22(7.46%) 46(15.59%) 82(27.80%) 142(48.14%) 295
龙生型 var. hirsuta 2(5.71%) 4(11.43%) 5(14.29%) 9(25.71%) 15(42.86%) 35
普通型 var. hypogaea 2(0.75%) 13(4.89%) 40(15.04%) 79(29.70%) 132(49.62%) 266
中间型 Intermediate 0 1(2.86%) 2(5.71%) 2(5.71%) 30(85.71%) 35
括号内的值为抗性品种的百分数。
The values in bracket mean percentage of resistant varieties.
表 4 通过核心种质发掘出的抗黄曲霉材料
Table 4 Peanut varieties with resistance to Aspergillus flavus in core collections
种质名称
Genotype
植物学类型
Botanical type
来源
Origin
感染指数
Infection
index
种质名称
Genotype
植物学类型
Botanical type
来源
Origin
毒素含量
Toxin content
(μg kg1)
铺地毡
Pudizhan
普通
var. hypogaea
中国
China
0.23 51002-6 珍珠豆
var. vulgaris
中国
China
3495
百色大花生
Baisedahuasheng
普通
var. hypogaea
中国
China
0.25 沙岗立大
Shaganglida
普通
var. hypogaea
中国
China
5703
老番豆
Laofandou
普通
var. hypogaea
中国
China
0.27 揭农
Jienong
珍珠豆
var. vulgaris
中国
China
5959
新沂大麻花
Xinyidamahua
普通
var. hypogaea
中国
China
0.30 巨野小花生
Juyexiaohuasheng
龙生
var. hirsuta
中国
China
5592
ICG6813 普通
var. hypogaea
ICRISAT 0.25 嵊县小红毛
Shengxianxiaohongmao
龙生
var. hirsuta
中国
China
5224
ICG12370 普通
var. hypogaea
ICRISAT 0.19 ICG12625
赤道
var. aequato-
riana
ICRISAT 4257
ICG4750 珍珠豆
var. vulgaris
ICRISAT 0.30 ICG12697 珍珠豆
var. vulgaris
ICRISAT 5019
ICG4156 普通
var. hypogaea
ICRISAT 0.22 ICG14482 普通
var. hypogaea
ICRISAT 5159
432 作 物 学 报 第 36卷
2.3 抗病种质的主要植物学性状和产量性状
对 16份抗侵染和产毒材料的主要植物学性状和
产量性状比较表明, ICG12697的主茎最高(115.5 cm),
51002-6的主茎最矮(44.5 cm)。ICG12697的侧枝最
长 (123.2 cm), 51002-6 的侧枝最短 (53.6 cm)。
ICG6813的总分支数最多(21.8个), ICG12697的总分
支数最少(4.9 个)。揭农的单株结果数最多(19.9 个),
ICG12370 的单株结果数最少(5.3 个)。沙岗立大和
51002-6 的荚果和种子均较大, 荚果长宽分别为 3.9
cm×1.6 cm和 3.5 cm×1.5 cm, 种子长宽分别为 2.0 cm×
0.9 cm和 1.8 cm×1.0 cm, 百果重分别为 206.5 g和
202.2 g, 百仁重分别为 82.8 g和 78.0 g, 出仁率分别
为 70.2%和 72.5%。嵊县小红毛的出仁率最高(79.8%),
51002-6的单株生产力最大(22.5 g)。
2.4 抗病种质的 SSR遗传多样性
以获得的抗病种质和生产上应用的优良品种中
花 5号、中花 6号、远杂 9102、中花 12为材料, 用
206对 SSR引物进行扩增, 筛选获得 26对具多态性
且扩增效果较好的引物。26对 SSR引物扩增获得的
条带数为 2~8 条, 其中 1B9 和 8D9 的条带最多, 均
为 8条, 而大部分引物在大多数种质基因组 DNA中
只扩增出 2~4条带。
26对引物在对黄曲霉菌不同抗性种质中扩增出
的DNA片段及遗传距离表明, 所涉及的抗黄曲霉种
质间遗传差异较大, 遗传距离变幅较宽, 其范围在
0.11~0.86之间, 平均为 0.42。在 20份材料中, 两两
之间遗传距离最大的出现在2份抗产毒种质, 即赤道
型的 ICG12625 与普通型的沙岗立大之间, 为 0.86;
遗传距离最小的出现在2份普通型的抗侵染种质, 即
铺地毡和百色大花生之间, 为 0.11。两两品种之间
遗传距离达 0.42以上的有 89个组合。与中花 5号、
中花 6 号、远杂 9102 和中花 12 平均遗传距离最远
的种质是 ICG12625, 遗传距离在 0.71~0.85之间, 其
次是 ICG4750, 遗传距离在 0.59~0.67之间。
应用相关软件, 对 20份材料的 SSR扩增结果进
行聚类分析(图 1), 在遗传距离 0.65处被分为 2组(A
组和 B 组)。A 组由来源于 ICRISAT 的 ICG4750(抗
侵染)和 ICG12625(抗产毒)组成。B 组的 18 份材料
在遗传距离 0.42处进一步分为 3个亚组。B1亚组由
密枝亚种的普通型和龙生型共 11份资源组成, 包括
图 1 抗黄曲霉资源聚类图
Fig. 1 Dendrogram of genotypes with aflatoxin resistance based on SSR profiles
Shaganglida: 沙岗立大; Xinyidamahua: 新沂大麻花; Shengxianxiaohongmao: 嵊县小红毛; Laofandou: 老番豆; Juyexiaohuasheng: 巨
野小花生; Baisedahuasheng: 百色大花生; Pudizhan: 铺地毡; Yuanza 9102: 远杂 9102; Zhonghua 6: 中花 6号; Zhonghua 5: 中花 5号;
Zhonghua 12: 中花 12; Jienong: 揭农。
第 3期 姜慧芳等: 利用核心种质发掘及评价花生抗黄曲霉资源 433
7份抗侵染材料和 4份抗产毒材料; B2亚组由生产上
应用的 4份优良品种组成; B3亚组由 3份抗产毒的
珍珠豆型资源组成。
2.5 抗病种质的 RGA分析
利用设计的 4 对简并引物, 对 6 份不同抗、感
黄曲霉的花生(沙岗立大、巨野小花生、揭农、嵊县
小红毛、51002-6 和中花 12)基因组 DNA 进行 PCR
扩增 , 获得特异 DNA 条带的引物有 3 对 , 包括
PLTR、PNTR及 PCRE, 其中 PCRE在所有材料中均
扩增出约 500 bp的特异条带(图 2)。
图 2 简并引物 PCRE对 6份抗黄曲霉种质的扩增结果
Fig. 2 PCR amplifications using degenerated primer PCRE
among six varieties genotypes with different resistance to aflatoxin
将回收的目的片段连接到 pGM-T 载体上, 转化
至大肠杆菌感受态细胞中, 重组质粒经蓝白斑筛选后,
随机挑选 3~5个白色菌落进行 PCR鉴定。挑选的 6个
克隆均扩增出略大于 500 bp的条带, 说明目的DNA片
段已连接到 pGM-T载体上。序列分析结果显示, 6个
重组质粒均含插入片段, 序列测定表明插入片段中
含引物序列。将重组质粒去除 pGM-T 载体后进行序
列比对, 表明这6条序列对应于1条RGA序列。该RGA
编码 166 个氨基酸。将获得的 DNA 序列输入 NCBI
网站的GenBank数据库, 利用Blast进行同源性搜索,
发现该序列与已公布的植物抗病基因类似物(RGA,
登录号为 AY747324.1)具有一定的同源性, 编码蛋
白与该基因编码的 CRE蛋白同源性达到 100%。
用 CLUSTAL X 软件分析 5 份抗病和 1 份感病
品种的同源序列, 发现其核苷酸序列完全相同, 而
在感病品种中花 12 中, 在第 14 位和第 444 位两处
存在单核苷酸的多态性(SNP)位点变化(表 5)。
表 5 不同抗黄曲霉种质的核苷酸序列差异比较
Table 5 Comparison of nucleotide sequences in peanut varieties with various resistance to Aspergillus flavus
沙岗立大
Shaganglida
巨野小花生
Juyexiaohuasheng
揭农
Jienong
嵊县小红毛
Shengxianxiaohongmao
51002-6 中花 12
Zhonghua 12
第 14位碱基 14th Nt A A A A A G
第 444位碱基 444th Nt A A A A A C
3 讨论
本研究表明, 利用花生核心种质发掘抗黄曲霉
资源是有效的。通过对 2个核心种质人工接种黄曲
霉菌鉴定其抗性, 获得抗黄曲霉侵染材料 8份, 抗黄
曲霉产毒种质 8 份。抗病材料存在广泛的遗传多样
性, 感染指数和毒素含量变异范围均较宽。接种强
产毒黄曲霉菌株后中国花生核心种质的感染指数为
0.23~1.00, 毒素含量为 3 495~175 947 μg kg–1,
ICRISAT 花生微核心种质相应为 0.19~1.00 和
4 257~207 970 μg kg–1。ICRISAT花生微核心种质中
抗黄曲霉侵染和产毒材料频率均较高, 普通型花生
资源中抗黄曲霉侵染种质的频率较高, 龙生型资源
中抗黄曲霉产毒种质的频率较高。这些结果为制定
我国花生种质资源的收集、引进和保护计划具有参
考价值。
系统了解作物种质资源的主要特性和遗传多样
性是资源有效利用和保护的基础[20], 鉴定和发掘与
高产品种遗传差异较大的抗病种质, 对于改良高产
优良品种的抗性具有重要意义。本研究发掘出的 16
份抗病种质在形态性状方面存在较大差异 , 其中
51002-6 的植株较矮, 高产潜力较大, 荚果和种子均
较大, 单株生产力高。SSR 分析结果与植物学分类
吻合, 珍珠豆型、普通型、龙生型分别聚在一起, 中
国花生资源与 ICRISAT 资源也基本上能区分开, 表
明中国花生种质与 ICRISAT 花生种质存在一定差
异。鉴定出与生产上推广应用的优良品种中花 5号、
中花 6 号、中花 12 和远杂 9102 遗传距离较远的种
质 ICG12625、ICG4750、ICG12697、ICG14482 和
老番豆。因此, 在对这些优良品种进行遗传改良时,
可以选择这些亲缘关系较远、遗传距离较大的种质,
扩大我国花生品种改良的遗传基础。
根据抗病基因产物的 NBS类型保守域设计 4对
简并引物对抗黄曲霉种质的 DNA 进行 PCR 扩增,
通过克隆测序和同源性分析, 获得 1 条与已公布的
植物抗病基因类似物具有一定同源性的 RGA 片段,
该片段在感病品种中花 12与其他 5个抗病品种之间
有两处存在碱基差异, 此片段是否与花生黄曲霉抗
性相关, 有待进一步研究。这些结果为揭示花生抗
黄曲霉的分子机制和花生的分子育种奠定了基础。
434 作 物 学 报 第 36卷
4 结论
发掘出抗黄曲霉侵染和产毒种质 16份, 证明利
用花生核心种质发掘抗黄曲霉资源是有效的。通过
对抗感材料的分析, 获得 1条 RGA片段。
References
[1] Liang X-Q(梁炫强), Pan R-Z(潘瑞炽), Bin J-H(宾金华). Pro-
gress on mechanism of resistance to Aspergillus infection in pea-
nut. Chin Oil Crops Sci (中国油料作物学报), 2000, 22(3):
77–80 (in Chinese with English abstract)
[2] Liang X-Q(梁炫强), Pan R-Z(潘瑞炽), Bin J-H(宾金华). Factors
related to preharvest resistance to Aspergillus infection in peanut.
Chin Oil Crops Sci (中国油料作物学报), 2000, 22(4): 67–70 (in
Chinese with an English abstract)
[3] Xiao D-R(肖达人), Wang S-Y(王圣玉), Qu Z(瞿桢). Progress
on aflatoxin contamination of peanut. Peanut Sci Tech (花生科
技), 1999, 28(suppl): 124–129 (in Chinese)
[4] Xiao D-R(肖达人), Wang S-Y(王圣玉), Zhang H-L(张洪玲).
Rapid identifying method for resistance to aflatoxin production in
peanut. Chin Oil Crops Sci (中国油料作物学报), 1999, 21(3):
72–76 (in Chinese with English abstract)
[5] Mehan V K, McDonald D. Research on the aflatoxin problem in
groundnut at ICRISAT. Plant Soil, 1984, 79: 255–260
[6] Mehan V K, McDonald D, Rasagopalan K. Resistance of peanut
genotypes to seed infection by Aspergillus flavus in field trials in
India. Peanut Sci, 1987, 14: 17–21
[7] Mehan V K, McDonald D, Haravu L J, Jayanthi S. The groundnut
aflatoxin problem: Review and literature database. ICRISAT
Press, 1991
[8] Jiang H-F(姜慧芳), Wang S-Y(王圣玉), Ren X-P(任小平). Re-
action of groundnut germplasm to Aspergillus flavus invasion.
Chin Oil Crops Sci (中国油料作物学报), 2002, 24(1): 23–25 (in
Chinese with English abstract)
[9] Jiang H-F(姜慧芳), Ren X-P(任小平), Wang S-Y(王圣玉).
Evaluation for resistance to invasion and aflatoxin contamination
caused by Aspergillus flavus in groundnut. Chin Oil Crops Sci
(中国油料作物学报), 2005, 27(3): 21–25 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[10] Jiang H-F(姜慧芳), Ren X-P(任小平), Wang S-Y(王圣玉), Liao
B-S(廖伯寿). Durability of resistance to Aspergillus flavus infec-
tion and effect of intact testa without injury on Aflatoxin produc-
tion in peanut. Acta Agron Sin (作物学报), 2006, 32(6): 851–855
(in Chinese with English abstract)
[11] Mixon A C. Peanut accessions resistance to seed infection by
Aspergillus flavus. Agron J, 1973, 65: 560–562
[12] Mixon A C. Reducing Aspergillus species infection of peanut
seed using resistant genotypes. J Environ Qual, 1986, 15:
101–103
[13] Holbrook C C, Anderson W F. Evaluation of a core collection to
identify resistance to late leaf spot in peanut. Crop Sci, 1995, 35:
1700–1702
[14] Holbrook C C, Timper P, Xue H Q. Evaluation of the core collec-
tion approach for identifying resistance to Meloidogyne arenaria
in peanut. Crop Sci, 2000, 40: 1172–1175
[15] Anderson W F, Holbrook C C, Culbreath A K. Screening the core
collection for resistance to tomato spotted wilt virus. Peanut Sci,
1996, 23: 57–61
[16] Isleib T G, Beute M K, Rice P W, Hollowell J E. Screening the
peanut core collection for resistance to Cylindrocladium black rot
and early leaf spot. Proc Am Peanut Res Edu Soc, 1995, 27: 25
[17] Jiang H-F(姜慧芳), Ren X-P(任小平), Liao B-S(廖伯寿), Huang
J-Q(黄家权), Lei Y(雷永), Chen B-Y(陈本银), Guo B Z, Hol-
brook C C, Upadhyaya H D. Peanut core collection established in
China and compared with ICRISAT mini core collection. Acta
Agron Sin (作物学报), 2008, 34(1): 25–30 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[18] Jiang H-F(姜慧芳), Duan N-X(段乃雄). Descriptors and data
standard for peanut (Arachis spp.). Beijing: China Agriculture
Press, 2006. pp 11–36 (in Chinese)
[19] Lei Y(雷永), Liao B-S(廖伯寿), Wang S-Y(王圣玉), Li D(李栋),
Jiang H-F(姜慧芳). Identification of AFLP markers for resistance
to seed infection by Aspergillus flavus in peanut (Arachis hypo-
gaea L.). Acta Agron Sin (作物学报), 2005, 31(10): 1349–1353
(in Chinese with English abstract)
[20] Mace E S, Phong D T. SSR analysis of cultivated groundnut
(Arachis hypogaea L.) germplasm resistant to rust and late leaf
spot diseases. Euphytica, 2006, 152: 317–330